專利名稱：滯留層析和蛋白質芯片排列在生物學和醫藥上的應用的制作方法
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國家資助的研究或開發不適用。
背景技術：
本發明涉及分離技術和分析生物化學。
本發明的方法可用于生物學或醫藥，包括分析基因功能，基因差異表達，蛋白質的發現，細胞和臨床診斷，以及藥物篩選。
不論是細胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決于細胞所表達的基因(即基因功能)。基因的表達有質與量兩方面的內容。即，細胞在所表達的特定基因和同一基因的相對表達量上都可能不同。基因的差異表達表現在，例如，基因編碼蛋白質表達的差異，或所表達蛋白翻譯后修飾的差異。例如，蛋白質可以被糖基或磷酸基修飾，也可以通過肽剪切加工。所以，在生物化學水平上，細胞代表著有機生物分子的復雜混合物。
基因組學(genomics)(“蛋白組學(protomics)”)的目的之一是鑒定和描述由不同細胞差異表達的有機生物分子。通過比較表達情況可以鑒定出造成細胞特定病理活性的分子。例如，鑒定出只在癌細胞內表達而不在正常細胞內表達的蛋白質可用于診斷，并最終用于藥物開發和疾病治療。人類基因組計劃一旦完成，將完成人類全部基因的克隆，測序，并組織成數據庫。在這一“后基因組”世界，鑒定差異表達的蛋白質的能力將繼而使人能夠鑒定編碼它們的基因。這樣，將可用遺傳學來解決細胞功能問題。
基因表達和功能的差異化學分析需要能夠分辨細胞內分子的復雜混合物，即使它們以微量存在，并加以定量和鑒定的方法。但是，目前用于這一目的的分析化方法在上述各方面都有局限。一種常用的生物分子分離方法是凝膠電泳。通常是用凝膠內等電點聚焦先分離蛋白質，再用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行第二次分離。結果得到一張根據等電點范圍(凈電荷)和大小(質量)來區分蛋白質的圖。雖然有用，但是該方法存在以下幾方面的局限。首先，該方法只提供生物分子的兩項特征一質量和等電點(pI)。其次，各維度(dimension)的分辨率受到凝膠分辨能力的限制。例如，通常很難區分質量差異小于5％或pI差異小于0.5的分子。第三，凝膠的容量和靈敏度都有限；可能無法檢測出少量表達的生物分子。第四，無法觀察到分子量低于約10-20kDa的小蛋白或小肽。
其它分析方法可能克服以上局限之一或幾項，但是難以將它們有效組合。例如，分析層析能夠根據多種分析物/吸附劑相互作用來分離生物分子，但是作多緯度(multi-dimensional)分析卻困難而費時。而且，該方法的靈敏度也很有限。
臨床診斷要求能夠特異性地檢測出疾病的已知標記。但是，制備特異性結合標記或能在復雜的混合物中鑒別出標記的試劑需要大量時間，這阻礙了此類診斷方法的發展。
藥物開發要求迅速篩選出調節配體/受體相互作用的藥物。通常，這類篩選中的限速步驟是對配體/受體相互作用的檢測能力。所以，鑒定結合的迅速特異性方法將是該領域的一大進展。
至今，從鑒定潛在標記或配體/受體對的成員到產生藥物這一過程一直很難。在一種方法中，將正常組織與病理組織相比，鑒定在病理組織中mRNA的增加或減少或被表達的序列標簽(“EST”)。用常規重組DNA法分離出這些序列并產生它們編碼的多肽。然后，將這些多肽分離出來用作免疫原提供標記的特異性抗體。這些抗體可以用于例如ELISA試驗中測定患者樣品中的標記含量。
該方法費時而費事。產生所述抗體可能需要9個月到1年，其中許多時間耗費在開發能夠分離出足量多肽以用于免疫的方法上。而且，該方法寄希望于RNA表達的差異所表現的就是蛋白質表達的差異。但是，這一假設并不一定正確。所以，直接檢測被差異表達的蛋白并且能夠在明顯縮短的時間內產生特異性配體的方法將對該領域大有裨益。
所以，分析生物化學、生物學和醫藥領域所需要的是能夠分辨有機生物分子的復雜混合物，鑒定混合物中各生物分子并鑒定出涉及一種或多種靶分析物的特異性分子識別的方法。
發明概述本發明提供了進行滯留層析的裝置和方法。滯留層析是一種組合方法，它使用多維度分離方法提供復雜混合物中分析物的高分辨信息。它為生物學和藥學提供了統一的分析物檢測和功能分析能力，其特征在于是一個直接檢測與基因功能、蛋白質功能、細胞功能和生物體整體功能相關的分析物表達方式的單一完整操作系統。本發明內容之一提供一種統一的操作系統，用于基因功能、蛋白質功能、或整個大分子組功能、細胞功能和生物體整體功能的發現和診斷。
更具體的說，可以多種兩維度形式分辨分析物，從而提供多維度信息。首先，根據分析物在至少兩種不同選擇性條件下吸附于固定相的能力(例如陰離子/陽離子，疏水性/親水性，或特異性生物分子識別作用)在至少兩種不同的第一維度上分離分析物。然后，用解吸譜(例如激光解吸質譜)根據質量在第二維度上分離分析物，進一步檢測已分離的分析物。分析物所吸附的吸附劑的性質提供了分析物的物理-化學信息。
所以，本發明提供了一種分子發現和診斷裝置，其特征在于具有并行和多路分析物處理能力。因為是對分析物的直接檢測，本發明能夠在一個操作單元中從同一循環(“circuit”)同時發出兩種或更多種靶分析物的信號(即，可定址的“芯片”位置)。
滯留層析與常規層析存在以下區別。首先，滯留層析中檢測的是滯留在吸附劑上的分析物。在常規層析中，分析物先從吸附劑上洗脫，然后進行檢測。在常規層析中沒有常規或方便的方法來檢測不從吸附劑上洗脫的分析物。所以，滯留層析提供了有關滯留分析物化學或結構特征的直接信息。第二，吸附層析與解吸譜檢測相結合提供了毫微微摩爾級的優良靈敏度以及極高的分辨率。第三，在一定程度上，因為允許直接檢測分析物，滯留層析提供了用多種不同選擇性條件迅速分析滯留物的能力，由此提供對樣品中分析物的快速多維度描述。第四，吸附劑可以于預先確定的排列、可定址位置附著于基質上。這就能夠對在不同洗脫條件下接觸不同吸附位置(即，“親合性位置”或“位點”)的分析物進行并行處理。
滯留層析在生物學和藥學上具有諸多用途。其中包括組合在一起的分析物生物化學分離與純化，基因差異表達和分子識別的研究，診斷和藥物開發。
滯留層析作為分析手段的一種基本用途包括樣品與不同吸附劑/洗脫劑組合接觸，檢測分析物在不同條件下的表現。這樣，既純化了分析物又確定了用于檢測樣品中某分析物的條件。帶有由此鑒定的吸附劑的基質可用作某分析物或多種分析物的特異性檢測劑。在一種逐步提取法中，樣品與第一吸附劑/洗脫劑組合接觸并洗滌，去除了被第一吸附劑吸附的分析物再與第二吸附劑接觸，從中去除其它分析物。在制備性純化過程中也可以使用經鑒定可滯留分析物的選擇性條件，此時，含有分析物的不純樣品依次接觸保留分析物的吸附劑，從而去除雜質，再從吸附劑上收集滯留的分析物進行下一輪。
本

發明內容
之一是，直接檢測以排列內可定址位置上特定選擇性條件為特征的各類或各種分子識別的情況(例如靶吸附劑-靶分析物的相互作用)，同時，被結合的分子仍然位于(即，滯留在)可定址的位置上。也就是說，直接的選擇和檢測不需要洗脫、回收、擴增或標記靶分析物。
本發明另一方面的內容是，檢測可定址排列內一處或多處的一種或多種分子識別情況只需取出或消耗吸附劑-分析物總量中很小的一部分。這樣，未用過的部分可以經一種或多種原位(即在可定址位置內)“二次處理”進一步測知其結構和功能，包括進一步的組裝或拆解，修飾，或(直接或間接)擴增。
可以用一種被稱為“逐步分辨”的重復過程開發對分析物的特異性提高的吸附劑，該過程中，用其它變量測試已知保留分析物的吸附劑或洗脫劑，由此鑒定具有更好結合特性的吸附劑于洗脫劑的組合。另一種方法則能夠迅速形成帶有分析物的特異性抗體吸附劑的基質。該方法包括將分析物錨定于某吸附劑，在噬菌體展示文庫中篩選與分析物結合的噬菌體。
滯留層析還可以用于分子生物學和細胞生物學。將樣品與用于解吸譜分析的多種吸附劑/洗脫劑組合接觸，由此利用其它分離和檢測系統所無法達到的高信息分辨能力鑒定在兩樣品中存在情況不同的分析物(即，兩份細胞提取物中差異表達的蛋白質)。根據吸附劑/洗脫劑組合的化學特性測定包括分子量在內的理化特征可以鑒定未知靶蛋白，而這一信息可用來在數據庫中篩選具有類似特征的蛋白質。
分離生物化學中的這些方法和由這些方法產生的吸附劑具有診斷方面的用途。更具體的說，可以開發出化學或生物特異性吸附劑以檢測重要的診斷標記。在某實施例中，基質可具有為診斷某疾病或綜合征所用標記組合而選用的吸附位點排列。
滯留層析還可以用于藥物開發。將受體/配體對的成員之一錨定于一種吸附劑，并在藥物存在下檢測其與結合伴侶結合的能力。因為吸附作用的測試很迅速，所以可方便地在藥物文庫中測試各藥物調節相互作用的能力。
本

發明內容
之一提供了高信息分辨樣品中至少一種分析物的方法。該方法是包括并行分離與檢測多個分析物在內的組合型分離法。該方法包括的步驟有a)將分析物置于至少兩種不同的選擇性條件中，使得吸附劑能夠保留分析物，不同的選擇性條件由吸附劑與洗脫劑所成的組合確定；和b)在不同選擇性條件下通過解吸譜檢測滯留的分析物。不同選擇性條件下的滯留分析物檢測提供了分析物的高信息分辨。
在實施例之一中，各種不同的選擇性條件被確定在不同的預定可定址位置上，用于并行處理。在另一實施例中，所述的方法包括i)分析物與確切位置上的第一選擇性條件接觸，使得分析物被吸附劑保留；ii)在第一選擇性條件下用解吸譜檢測滯留的分析物；iii)在確切位置上不同的第二選擇性條件下洗滌吸附劑，使得分析物滯留在吸附劑上；和iv)在第二選擇性條件下用解吸譜檢測滯留的分析物。
在另一實施例中，分析物是一種有機生物分子，多元分子復合物或大分子組。在另一實施例中，有機生物分子是酶、免疫球蛋白、細胞表面受體或胞內受體。
在另一實施例中，吸附劑包含陰離子、陽離子、疏水作用吸附劑、多肽、核酸、糖、凝集素、染料、還原劑、烴或它們的組合。在另一實施例中，吸附劑結合在包含玻璃、陶瓷、磁性材料、有機聚合物、導電聚合物、天然生物聚合物、用有機物包被的金屬或非金屬的基質上。在另一實施例中，吸附劑的形式是微乳液、膠乳、層或珠。在另一實施例中，基質上的位置呈線形或正交排列。在另一實施例中，在分析物與選擇性條件接觸前，吸附劑在基質上位于不同的位置。在另一實施例中，在分析物與選擇性條件接觸后，吸附劑在基質上位于不同的位置。在另一實施例中，不同的選擇性條件包括不同的結合條件和不同的洗脫條件。
在另一實施例中，檢測步驟包括用激光解吸質譜測定分析物的質量。
在另一實施例中，所選的選擇性條件盡可能優化吸附劑對分析物的保留。在另一實施例中，所述的至少一種分析物多余一種。在另一實施例中，多種選擇性條件的吸附劑不同而洗脫劑相同。
另一實施例還包括一步提供在可定址位置上包含吸附劑的基質，各吸附劑是經鑒定可保留分析物的選擇性條件中的吸附劑。在另一實施例中，洗脫條件的差異在于pH、緩沖能力、離子強度、水結構特征、除垢劑種類、除垢劑強度、疏水性或介電常數。在另一實施例中，多種選擇性條件中的洗脫劑相同。
本發明另一實施例提供從樣品中順次抽提分析物的方法。這是一種適合對多種分析物并行的組合型連續分離純化法。該方法包括a)將含分析物的樣品與第一選擇性條件接觸，使得分析物被第一吸附劑保留并產生非滯留樣品；b)收集含分析物的非滯留樣品，將非滯留樣品與第二選擇性條件接觸，使得分析物被第二吸附劑保留并產生非滯留樣品；c)在不同選擇性條件下用解吸譜檢測滯留分析物。
本發明的另一方面內容提供一種解吸譜用基質，它包含結合特征沿單軸線或多軸線梯度變化的吸附劑。
本發明的另一方面內容提供一種逐步鑒定選擇性條件的方法，該條件對樣品中的某種分析物具有更高的分辨率。該方法包括(a)如下鑒定保留樣品中一種分析物的選擇性條件i)將樣品與一組選擇性條件接觸，各選擇性條件具有至少一種結合特性和至少一種洗脫特性；ii)用解吸譜檢測各選擇性條件下被滯留的分析物；iii)鑒定保留該分析物的選擇性條件；和(b)鑒定對分析物具有更高分辨率的選擇性條件i)從已鑒定出的選擇性條件中選取至少一種結合特性或洗脫特性，將它加入選擇特征常數組；ii)將樣品與一組經修飾的選擇性條件組接觸，該修飾組中的各選擇性條件包含(1)常數組中的選擇特征和(2)常數組所沒有的結合特性或洗脫特性；和iii)用解吸譜法從修飾組中鑒定出與先前鑒定的選擇性條件相比以更高的分辨率保留分析物的選擇性條件。實施例之一中重復步驟(b)至少一次。另一實施例重復步驟(b)直到鑒定出只保留樣品中靶分析物的選擇性條件。
本發明的另一方面提供用于解吸譜法的基質，包含經鑒定可逐步分辨分析物的選擇性條件中的吸附劑。實施例之一中，吸附劑來自一試劑盒，該試劑盒還包含選擇性條件中的洗脫劑或如何將洗脫劑與吸附劑結合使用的說明書。
本發明的另一方面內容提供一種從不純樣品中制備性純化分析物的方法。該方法包括a)在多種不同選擇性條件下將樣品與基質接觸；用解吸譜法檢測不同條件下滯留的分析物；鑒定使得分析物被保留的選擇性條件；b)對鑒定出的多種不同選擇性條件順次重復以下步驟以純化分析物i)在鑒定出的條件下將樣品與吸附劑接觸使得分析物被吸附劑保留；ii)將分析物與不被基質保留的雜質分離；和iii)從吸附劑上收集分析物。
本發明的另一方面內容提供一種制備用于檢測樣品中至少一種分析物的基質的方法。該方法是用于設計和鑒定分析物特異性吸附劑的組合型方法。它可以用于檢測靶分析物。該方法包括a)將樣品與至少兩種不同的選擇性條件接觸使得分析物被吸附劑保留，各選擇性條件定義為不同的吸附劑與洗脫劑組合；b)用解吸譜法鑒定至少一種使得分析物被保留的選擇性條件；和c)制備包含至少一種所鑒定的選擇性條件的吸附劑。在實施例之一中，鑒定步驟包括鑒定至少一種使得多種分析物被保留的選擇性條件。另一實施例中的制備步驟包括制備包含多種吸附劑的作為多元吸附劑的基質的方法，所述的吸附劑可在同一洗脫條件下保留分析物。
本發明的另一方面內容提供診斷以至少一種診斷標記為特征的疾病的方法。這是一種用于同時檢測多種診斷標記的組合型方法。該方法包括a)提供用于解吸譜法的基質，該基質包含至少一個可定址的位置，每個可定址的位置包含在某種洗脫條件下至少分辨一種診斷標記的吸附劑；b)在洗脫條件下將基質與來自患者的生物樣品接觸使得診斷標記滯留；和c)用解吸譜法檢測滯留的生物標記。檢測滯留的檢測標記即是對疾病的診斷。
本發明另一方面內容提供一種用于檢測樣品中某分析物的試劑盒，它包括(1)用于解吸譜法的基質，它包含至少一個可定址的位置，每個可定址的位置上包含在由吸附劑和洗脫劑構成的選擇性條件下分辨分析物的吸附劑；和2)將樣品與選擇性條件接觸的洗脫劑或說明書。在實施例之一中，試劑盒的特征在于有多種診斷標記，并且，基質包含多個可定址位置，每個可定址位置包含分辨至少一種診斷標記的吸附劑。
本發明的另一方面內容提供用于解吸譜法的基質盒，它包含可定址位置上的至少一種吸附劑，這至少一種吸附劑可分辨患者樣品中某種病理狀態的多種診斷標記。
本發明的另一方面內容提供選擇某蛋白分析物候選特征的方法。該方法是根據至少兩種理化特征鑒定蛋白質的組合型方法。該方法包括a)測定一組說明樣品中某蛋白分析物的至少第一和第二理化特征的匹配參數的數據，這是通過i)將分析物置于不同的選擇性條件中，由鑒別蛋白分析物某理化特征的引力基礎介導分析物被基質所吸附；和ii)在不同選擇性條件下用解吸譜法檢測滯留的分析物；和b)在可編程計算機中運行以下步驟i)訪問數據庫，數據庫中參比多肽組中的每一成員都具有說明參比多肽至少第一和第二理化特征的一組數據；ii)輸入說明該蛋白分析物理化特征的數據組；iii)從數據庫中選出數據組在匹配參數內的參比多肽。選出的參比多肽提供了蛋白分析物的候選特征。沒有被選出的參比多肽無此候選特征。
本發明的另一方面內容提供一種順次保留分析物的方法。該方法是檢測多元大分子或超分子組裝的方法。它通過對分子識別的干擾用作藥物開發的方法。該方法包括a)將第一樣品與最初吸附劑和洗脫劑接觸使得第一分析物被吸附劑保留，并用解吸譜法檢測被吸附的分析物，滯留的第一分析物由此變成第二吸附劑；b)將第二樣品與第二吸附劑和洗脫劑接觸使得第二分析物被第二吸附劑保留，用解吸譜法檢測被吸附的第二分析物，滯留的第二分析物由此變成第三吸附劑。
本發明的另一方面內容提供一種檢測樣品中的酶的方法。該方法包括a)提供包含吸附劑和與該吸附劑結合的酶底物的固相，酶對酶底物的活性產生具有特征性分子量的產物；b)將底物與樣品接觸；和c)用解吸譜法檢測產物。檢測產物就是檢測酶。
本發明的另一方面內容提供一種確定某分析物在第一和第二樣品中是否差異存在(例如差異表達)的方法。該方法可以用于通過差異蛋白質展示檢測差異基因表達的組合方法。該方法包括a)測定分析物在第一樣品中至少一種選擇性條件下的第一滯留圖；b)測定分析物在第二樣品中相同選擇性條件下的第二滯留圖；和c)比較第一和第二滯留圖之間的差異。兩滯留圖的差異肯定了分析物在第一和第二樣品中的差異存在。
該方法的實施例之一是測定某種蛋白是否在兩種不同細胞，包含細胞的第一和第二樣品或來自細胞的材料中差異表達。該方法的另一實施例是測定某種藥物是否改變生物樣品中某蛋白質的表達，這還包括將藥物用于第一生物樣品但不用于第二生物樣品的步驟。在另一實施例中，第一生物樣品來自健康者，第二生物樣品來自某種病癥的患者。樣品可選自例如血液、尿液、血清和組織。以在患者樣品中增加的分析物作為候選診斷標記。通常，確認一種診斷標記需在多個受試者中檢測到該標記物。
本發明的另一方面內容提供鑒定某受體的配體的方法。該方法包括a)提供包含結合受體的吸附劑的基質；b)在允許受體與配體之間發生結合的條件下將被結合的受體與含配體的樣品接觸；和c)用解吸譜法檢測被結合的配體。
本發明的另一方面內容提供用于測定藥物是否調節靶分析物與某吸附劑之間的結合的篩選方法。這是一種用于藥物開發的組合型方法。該方法包括a)提供包含靶分析物在洗脫條件下與之結合的吸附劑的基質；b)在允許靶分析物與吸附劑相互結合的洗脫條件下將基質與靶分析物和藥物接觸；c)用解吸譜法定量檢測靶分析物與吸附劑之間的結合；和d)確定測得的量是否與對照結合量不同，在對照中，基質在不含藥物的洗脫條件下與靶分析物接觸。測得量與對照量之間的差異說明藥物調節了結合作用。
本

發明內容
之一提供一種檢測基因組件(genetic package)的方法，基因組件中包含一段編碼特異性結合靶吸附劑的多肽的聚核苷酸。就某一方面而言，這是一種用于從展示文庫中挑選出分析物的特異性噬菌體的組合型方法，包括使用通過測定滯留圖而分離得到的靶蛋白或在原位通過體外轉錄和翻譯產生的靶蛋白。該方法包括a)提供包含靶吸附劑的基質；b)提供包含多種不同基因組件的展示文庫，不同的基因組件各自包含一段所含核酸序列編碼某種多肽的聚核苷酸，而且，不同的基因組件各自具有展示所編碼多肽的表面；c)在允許多肽與靶吸附劑特異性結合的洗脫條件下將基質與展示文庫接觸，使得含有多肽的基因組件滯留在基質上；和d)用解吸譜法檢測滯留在基質上的基因組件。
該方法的實施例之一中，展示文庫是噬菌體文庫。另一實施例中，噬菌體是M13。另一實施例中，多肽是單鏈抗體。另一實施例中，靶分析物是在不同表型的細胞內差異表達的多肽分析物。另一實施例中，基質包含細胞或細胞膜。
實施例之一中，提供靶吸附劑的步驟包括i)提供包含吸附劑的基質，所述的吸附劑在某種洗脫條件下保留靶分析物；和ii)在允許靶分析物被吸附劑保留的洗脫條件下將吸附劑與靶分析物接觸，靶分析物由此變成靶吸附劑。在實施例之一中，靶分析物是靶多肽，步驟ii)接觸吸附劑包括通過體外翻譯編碼靶多肽的聚核苷酸在吸附劑上原位產生靶多肽的步驟，還可以包括在吸附劑上原位擴增靶多肽序列。
在另一實施例中，基質包含(1)結合錨定多肽的吸附劑和(2)至少一個具有展示錨定多肽的表面和靶吸附多肽的靶基因組件，靶基因組件所含的聚核苷酸含有編碼靶吸附劑的核酸序列，靶基因組件通過錨定多肽與吸附劑結合。
在另一實施例中，該方法包括任意以下步驟檢測編碼多肽的核酸序列；分離滯留的基因組件或產生多肽。
本發明的另一方面內容提供用于解吸譜法的基質，它包含結合展示于基因組件表面的錨定多肽的吸附劑，所述的基因組件表面還展示靶多肽，所述的基因組件包含具有編碼靶多肽的核酸序列的聚核苷酸。
本發明的另一方面內容提供檢測聚核苷酸翻譯的方法。所述方法包括a)提供用于解吸譜法的包含吸附劑的基質；b)將基質與編碼多肽的聚核苷酸和體外翻譯聚核苷酸所需的物質接觸，由此產生多肽；c)基質與洗脫劑接觸使得多肽被吸附劑保留；和d)用解吸譜法檢測滯留的多肽。檢測多肽就是檢測聚核苷酸的翻譯。
附圖簡述

圖1是包含多個吸附劑位點的條形基質。基質條有6組根據引力基礎(疏水力，離子力，配位共價鍵及混合作用)來區分的不同吸附劑。基質條針對不同吸附劑各有多個位點，允許在不同的時刻用不同的洗脫劑來檢查這些位點，或用于記錄和后繼分析。
圖2是吸附劑(表面相互作用潛力)位于預定可定址位置上的正交排列。排列也可以呈板式。排列中包含多種吸附劑。在與分析物接觸后，各條可用不同的洗脫劑(選擇閥值修飾劑)洗滌。分析不同選擇性條件下的滯留情況得到滯留圖或識別概況。
圖3表示通過將分析物從排列的給定位置上解吸進行的分析物的定量分析和用激光解吸質譜法進行的解吸分析物的定量分析。
圖4A顯示的是用來執行分析本發明數據所用軟件的計算機系統。圖4A顯示的計算機系統1包括顯示器3，顯示屏5，機箱7，鍵盤9和鼠標11。鼠標11可具有一個或多個按鍵，例如鼠標鍵13。機箱7內包含CD-ROM驅動器15和硬盤驅動器(未顯示)，它們可用來存儲和檢索包含本發明代碼的計算機程序。雖然顯示了一個CD-ROM17作為計算機可讀記錄介質，但也可以使用包括軟盤、DRAM、硬盤、內存(flash memory)、磁帶等在內的其他計算機可讀存儲介質。機箱7內還有諸如處理器、存儲器等常規計算機組件(未顯示)。
圖4B顯示的是用于執行使用本發明數據的軟件的計算機系統1的系統圖。如圖4A所示，計算機系統1包括顯示器3和鍵盤9。計算機系統1還包括諸如中央處理器102、系統存儲器104、I/O控制器106、顯示卡108、可換磁盤112、固定磁盤116、網絡界面118和話筒120等子系統。可換磁盤112代表了諸如軟盤、磁帶、CD-ROM、可換硬盤、內存(flash memory)等可換的計算機可讀存儲介質。固定磁盤116代表內置硬盤驅動器、DRAM等。適用于本發明的其它計算機系統可能還包括更多或更少的子系統。例如，其它計算機系統可具有一個以上處理器102(即，多處理器系統)或高速緩沖存儲器。
圖5A-5F是溶菌酶在6種不同吸附劑和數種不同洗脫劑組成的選擇性條件下的滯留圖。
圖6A-6B是用固定化金屬吸附劑分辨人血清中的低分子量和高分子量分析物。
圖7A-7B是用不同吸附劑和相同洗脫劑分辨人血清中的低分子量和高分子量分析物。
圖8A-8B是用不同吸附劑并以水為洗脫劑分辨早產嬰兒尿液中的低分子量和高分子量分析物。
圖9顯示用疏水性苯基吸附劑和三種洗脫劑分辨早產嬰兒尿液中的分析物，結果發現Tween洗滌選擇性保留一種分析物(*)。
圖10A-10D是分辨兩不同乳腺癌細胞系的細胞培養液中的分析物。
圖11顯示早產嬰兒尿液在6種吸附劑和3種洗脫劑組成的選擇性條件下的混合物滯留圖。
圖12顯示早產嬰兒尿液的兩維度聚丙烯酰胺凝膠(pI和表觀分子量)。
圖13顯示用噬菌體文庫篩選表面蛋白特異性結合靶分析物的噬菌體的方法。上方的基質顯示，通過檢測噬菌體所含的許多包被蛋白，即使少量的特異性結合噬菌體也能夠用解吸譜法檢測出來。下方，本發明開發了具有數個吸附劑位置使得靶分析物與之特異性結合的的基質。使噬菌體接觸這些位點，用解吸譜法檢測結合的噬菌體。可以分離出與另一位置結合的噬菌體并進行培養。
圖14顯示如何用篩選法鑒定的配體(此處為一種單鏈抗體)作為吸附劑固定用于蛋白-蛋白相互作用研究的靶蛋白。原位純化靶蛋白(位置2)并用來篩選噬菌體展示文庫(位置4)。分離出單鏈抗體，作為吸附劑與基質結(位置6)。然后，靶蛋白與單鏈抗體結合。這就固定了靶蛋白，可用于研究蛋白-蛋白相互作用(位置8)。
圖15顯示篩選能干擾蛋白質結合配體(此處為一種單鏈抗體)的候選藥物的方法。通過例如自身可經蛋白A或蛋白G固定的抗噬菌體抗體將某靶蛋白的特異性單鏈抗體固定于基質上的某一位置。使該單鏈抗體接觸靶蛋白和候選藥物，用解吸譜法來檢測藥物結合蛋白分析物和干擾配體結合分析物的能力。
圖16顯示篩選能干擾蛋白質結合配體的候選藥物的方法。該方法與上一圖中的相似，所不同的是通過解吸譜法檢測藥物本身與配體的結合來檢測藥物干擾分析物結合的能力。
圖17顯示篩選能干擾靶蛋白(靶蛋白I)結合第二配體(靶蛋白II)的候選藥物的方法。和前兩圖一樣，靶蛋白被固定在基質上，本身由此變成配體的吸附劑。此處，分析物通過單鏈抗體被固定。然后，靶蛋白與配體和候選藥物接觸。用解吸譜法檢測藥物干擾分析物與配體之間結合(通過例如與靶分析物結合)的能力。
圖18是從鑒定差異表達的mRNA或多肽開始，至產生特異性結合用于解吸譜法檢測的多肽的診斷平臺結束的流程圖。
圖19A-19D顯示嗜血桿菌(Hemophilus)裂解液在某吸附劑排列上的滯留圖。圖19A陰離子吸附劑；圖19B常態吸附劑；圖19CNi(II)吸附劑；圖19D疏水性吸附劑。
圖20A-20C顯示嗜血桿菌裂解液中某分析物的逐步分辨。吸附劑都是陰離子吸附劑。圖20A第一步，在接觸樣品后，用150μl 20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，pH7.0洗滌該位置。第二步，在一組常數特征中加入吸附劑和洗脫劑的磷酸鈉特征。圖20B除20mM磷酸鈉，pH7.0之外，還用0.05％Triton X100和0.15M NaCl(總共150μl)洗滌該位置。圖20C除20mM磷酸鈉，pH7.0之外，還用100mM咪唑，0.15M NaCl(總共150μl)洗滌該位置。
圖21A-21D顯示常人血清和患病血清中成分的比較結果。圖21A正常血清在吸附劑排列(Cu(II))位置上的滯留圖。圖21B患病血清在吸附劑排列(Cu(II))位置上的滯留圖。圖21C將兩種血清樣品中的滯留分析物重疊。為了簡化表示，各滯留分析物峰轉化成條柱，虛線柱代表正常血清中被滯留的分析物，實心柱代表疾病血清中被滯留的分析物。圖21D為了更清楚地區分兩樣品，繪制了一張比較圖，計算并顯示了兩樣品中滯留分析物之比。用“*”標記的兩分析物顯示在疾病血清中明顯增加(增加5至10倍)。
圖22A-22D顯示的是對照、疾病和藥物治療的小鼠的尿液在Cu(II)吸附劑上的滯留圖的比較，以及對疾病和藥物處理尿液中標記的定量。
圖23A-23D顯示以“凝膠視圖(gel view)”形式顯示的4名癌癥患者尿液中分析物的滯留圖。患者1，2和3之間的差異圖顯示有兩種共有分析物在患者尿液中增加。
圖24A-24E顯示通過檢測基因VIII包被蛋白用激光解吸質譜法檢測M13噬菌體。對原來的1012噬菌體/ml進行1∶10至1∶100,000,000的稀釋。
圖25A-25B為解吸譜法顯示的以抗M13抗體為吸附劑捕獲M13。圖22A顯示被捕獲的M13噬菌體，其中的峰代表基因VIII和基因III蛋白。圖22B是對照，其中的峰代表抗體吸附劑(單倍和雙倍帶電)。
圖26A-26D顯示帶有抗-tat單鏈抗體的M13噬菌體被tat蛋白吸附劑吸附的情況。只顯示了噬菌體稀釋度為1∶10至1∶10,000時的強度。
圖27A-27B顯示濃度為1μg/ml(圖27A)和100ng/ml(圖27B)時，TGF-β結合固定化TGF-β受體融合蛋白的滯留圖。實線代表沒有游離TGF-β受體時的結合。虛線代表有游離TGF-β受體時的結合。
圖28至31顯示滯留層析的分辨能力。圖28A-28C顯示用疏水性，陽離子和Cu(II)吸附劑分辨嗜血桿菌裂解液中分子量范圍從0kD至30kD的蛋白質。各滯留分析物均以條柱表示，條柱高度代表滯留分析物的強度。圖29A-29C顯示用疏水性，陽離子和Cu(II)吸附劑分辨嗜血桿菌裂解液中分子量范圍從30kD至100kD的蛋白質。圖30顯示三種吸附劑聯合分辨0kD至30kD的嗜血桿菌蛋白。圖31顯示三種吸附劑聯合分辨的30kD至100kD的嗜血桿菌蛋白。
圖32顯示GST融合蛋白與普通吸附劑的結合。
圖33A-33B顯示特異性配體與固定在吸附劑排列上的GST融合蛋白受體的結合(圖33A)，配體與沒有GST融合蛋白的排列不結合(圖33B)。
本發明的詳細說明I.定義除非另作定義，本發明所用技術和科學術語的含義都是本領域技術人員所熟知的。以下參考文獻為本領域技術人員提供了本發明所用許多術語的一般解釋Singleton等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2ed.1994)；TheCambridge Dictionary of Science and Technology(Walder編，1988)；The Clossary ofGenetics，5thed.，R.Rieger等編，Spring Verlag(1991)；和Hale & Marham，TheHarper Collins Dictionary of Biology(1991)。除非另作定義，本發明中以下術語的定義為“分析物”樣品中需要滯留和檢測的組分。它可以表示樣品中單獨一種組分或一組組分。
“吸附劑”任何能夠吸附分析物的物質。“吸附劑”在此即表示分析物所接觸的單獨一種物質“單吸附劑(monoplex adsorbent)”(例如一種化合物或官能團)，又表示樣品所接觸的多種物質“多重吸附劑(multiplex adsorbent)”。多重吸附劑中的吸附性物質稱為“吸附劑種類”。例如，基質上某可定址位置可包含以多種具有不同結合特性的不同吸附劑種類(例如，陽離子物質，金屬螯合劑或抗體)為特征的多重吸附劑。
“吸附”表示用洗脫劑(選擇閾值修飾劑)洗滌前或后，吸附劑與分析物之間可被測得的結合。
“基質”吸附劑結合或沉淀所在的固相。
“結合特性”指導致吸附劑吸引分析物的化學和物理特征。如果在相同的洗脫條件下，兩種吸附劑結合相同分析物的親合性程度不同，則這兩種吸附劑具有不同的結合特征。結合特性包括，例如，鹽促相互作用程度，疏水性相互作用程度，親水性相互作用程度，靜電相互作用程度等。
“結合條件”指分析物所接觸的結合特性。
“洗脫劑”指用來介導分析物被吸附劑吸附的物質，通常是一種溶液。洗脫劑又稱“選擇閾值修飾劑”。
“洗脫特性”指造成特定洗脫劑(選擇閾值修飾劑)能夠介導某分析物與某吸附劑之間吸附作用的特征。如果兩種洗脫劑與分析物和吸附劑接觸時，分析物與吸附劑之間的親合性不同，則這兩種洗脫劑具有不同的洗脫特性。洗脫特征包括，例如，pH，離子強度，水結構的修飾，除垢劑強度，疏水相互作用的修飾等。
“洗脫條件”指分析物所接觸的洗脫特性。
“選擇特征”指具有特定結合特性的吸附劑與具有特定洗脫特性的洗脫劑相結合，產生的特異性使得分析物在用洗脫劑洗滌后仍然滯留的特征。
“選擇性條件”指分析物所接觸的選擇特征。
“引力基礎”指使得分子彼此吸引的化學和/或理化特征。
“引力強度”分子彼此吸引的強度(又稱親合力)。
“分辨”“分辨作用”或“分析物的分辨”指對樣品中至少一種分析物的檢測。分辨包括通過先分離然后差異性檢測來檢測樣品中的多種分析物。分辨不要求將一種分析物與混合物中的其余分析物完全分離。相反，任何分離只要能夠區分至少兩種分析物就足夠了。
“高信息分辨”指分辨分析物的方式不僅能檢測出分析物，還可評價分析物的至少一種理化性能，例如分子量。
“解吸譜法”是一種檢測分析物的方法，其中，分析物接觸能量后，從固定相解吸到氣相中，被解吸的分析物或其可區別性部分直接被檢測器測得，不需要將分析物捕捉到第二固定相上的中間步驟。
“檢測”指鑒定待測物質是否存在或存在量。
“滯留”指經洗脫劑洗滌后分析物被吸附劑所吸附。
“滯留數據”指表明檢測到在特定選擇性條件下分析物被保留的數據(可包括檢測質量)。
“滯留圖”指說明多種選擇性條件下被保留的某分析物的滯留信息的數據組。
“識別概況”指說明某分析物在多種選擇性條件下相對滯留作用的數據組。
“復合物”指兩種或兩種以上聯合而成的分析物。
“片段”指分析物的化學，酶法或物理降解產物。片段可能是中性的，也可能是離子態的。
“差異表達”指某分析物的存在在質與量上可測得的差異。
“生物樣品”指來自病毒，細胞，組織，器官或生物體的樣品，包括但不限于細胞，組織或器官裂解物或勻漿，或體液樣品，例如血液，尿液或腦髓液。
“有機生物分子”指具有生物來源的有機分子，例如甾體，氨基酸，核苷酸，糖，多肽，聚核苷酸，復合糖或脂質體。
“有機小分子”指與藥學中常用有機分子大小相當的有機分子。它不包括有機生物聚合物(例如蛋白質，核酸等)。較好的有機小分子最大約5000Da，最大約2000Da，或者，最大約1000Da。
“生物聚合物”指生物來源的聚合物，例如多肽，聚核苷酸，多糖或聚甘油酯(例如二或三甘油酯)。
“多肽”指由氨基酸殘基、相關天然結構變體及其非天然合成類似物通過肽鍵連接而成的聚合物，及其天然變體和非天然合成類似物。可以用自動多肽合成儀來合成合成多肽。“蛋白質”一般指大多肽。“肽”一般指短多肽。
“聚核苷酸”指由核苷酸單元構成的聚合物。聚核苷酸包括諸如脫氧核糖核酸(“DNA”)和核糖核酸(“RNA”)的天然核酸和核酸類似物。核酸類似物包括非天然堿基和核苷酸以非天然磷酸二酯鍵與其它核苷酸連接的哪些，或包含以非磷酸二酯鍵連接的堿基的哪些。這樣，核苷酸類似物包括但不限于磷酸硫酯，磷酸二硫酯，磷酸三酯，磷酸甲芐咪唑，磷酸硼烷酯，磷酸甲酯，手性-磷酸甲酯，2-O-甲基核糖核苷酸，肽-核酸(PNA)等。這些聚核苷酸可以用例如自動DNA合成儀來合成。“核酸”一般指大的聚核苷酸，“寡核苷酸”一般指短的聚核苷酸，一般不超過50個核苷酸。可以理解的是，當用DNA序列(即，A，T，G，C)表示核苷酸序列時，也包括以“U”代替“T”的RNA序列(即，A，U，G，C)。
“可測部分”或“標記”指可以用分光學，光化學，生物化學，免疫化學或化學方法測定的組分。例如，有用的“標記”包括32P，35S，熒光顏料，電子-密度(electron-dense)試劑，酶(例如ELISA中常用的那些)，生物素-鏈霉親和素，分子氧(dioxygenin)，可以得到其抗血清或單克隆抗體的半抗原或蛋白質，或者序列與靶分子互補的核酸分子。這些可測部分通常產生一個可測信號，例如放射性、生色性或熒光信號，這些信號可用來確定樣品中可測部分被結合的量。可測部分可以通過共價鍵、離子引力，范德華力或氫鍵摻入或結合引物或探針，例如，摻入放射性核苷酸或可被鏈霉親和素識別的生物素化核苷酸。可測部分可能直接可測或間接可測。間接可測可能涉及將第二直接可測或間接可測部分與原可測部分結合。例如，原可測部分可以是與結合伴侶特異性雜交的配體，例如作為鏈霉親和素結合伴侶的生物素，或作為互補序列結合伴侶的一段核苷酸序列。結合伴侶本身可能是直接可測的，例如抗體本身可被熒光分子所標記。結合伴侶也可能是間接可測的，例如，具有互補序列的核酸可能是分支DNA分子的一部分，后者再通過與其它經標記核酸分子雜交而被測得。(參見，PD.Fahrlander & A.Klausner，Bio/Technology(1988)61165)。信號定量可通過例如閃爍計數，測密度或流動細胞計數來進行。
“多”表示不少于2。
“純化”表示去除待純化組合物中至少一種雜質。純化并不要求純化后的化合物100％純。
“配體”是與靶分子特異性結合的化合物。
“受體”是與配體特異性結合的化合物。
“抗體”指主要由一個或多個免疫球蛋白基因編碼的多肽配體，或其片段，它們特異性地結合并識別某表位(例如抗原)。已知的免疫球蛋白基因包括κ和λ輕鏈恒區基因，α、β、δ、ε和μ重鏈恒區基因，以及眾多的免疫球蛋白變區基因。抗體是，例如，完整的免疫球蛋白或各種肽酶消化所產生、并已經被充分描述的片段之一。包括Fab’和F(ab)2’片段。本文中的“抗體”還包括修飾完整抗體而產生的或用重組DNA方法全新合成的抗體片段。它還包括單克隆抗體，多克隆抗體，嵌合抗體，和人源化抗體。抗體的“Fc”部分指包含一個或多個重鏈恒區CH1，CH2和CH3，不包括重鏈變區的重鏈部分。
在確定包含多種化合物的樣品中是否存在分析物的試驗中，當配體或受體發生作用時就會與分析物化合物“特異性結合”或“發生特異性免疫反應”。這樣，在設計好的試驗(例如免疫試驗)條件下，配體或受體優先結合特定的分析物，與樣品中的其它化合物則基本上不結合。例如，一段聚核苷酸在雜交條件下特異性結合一段包含互補序列的聚核苷酸分析物；一種抗體在免疫試驗條件下特異性結合帶有激發該抗體的表位的抗原分析物；吸附劑在合適的洗脫條件下特異性結合某種分析物。
“制劑”指一種化合物，化合物的混合物，組成尚不確定的樣品，小分子組合而成的排列，生物大分子，噬菌體肽展示文庫，噬菌體抗體(例如scFv)展示文庫，聚核糖體展示文庫，或由細菌、植物、真菌、或動物細胞或組織等生物材料制備的提取物。合適的技術包括噬菌體或類似載體上重組抗體文庫的挑選。參見，Huse等，(1989)Science 2461275-1281；和Ward等，(1989)Nature 341544-546。Huse的方法與噬菌體展示文庫聯用更有效。參見，例如，Dower等，WO91/17271和McCafferty等，WO92/01047。
“重組聚核苷酸”指包含的序列在天然條件下并不連接在一起的聚核苷酸。可將擴增或組裝而成的重組聚核苷酸包含在合適的載體內，再用該載體轉化合適的宿主細胞。含有重組聚核苷酸的宿主細胞被稱為“重組宿主細胞”。然后在重組宿主細胞內表達基因，產生例如“重組多肽”。重組聚核苷酸也可以是非編碼功能的(例如，啟動子，復制起點，核糖體結合位點等)。合適的單細胞宿主包括常用于表達真核或哺乳動物聚核苷酸的哪些，包括例如大腸桿菌的原核細胞；包括酵母之類真菌的真核細胞；包括昆蟲細胞(如sf9)和諸如CHO，R1.1，B-W，L-M，非洲綠猴腎細胞(例如COS1，COS7，BSC1，BSC40和BMT10)等動物細胞和培養的人細胞的哺乳動物細胞。
“表達調控序列”指聚核苷酸內一段調節與之操作性連接的核苷酸序列的表達(轉錄和/或翻譯)的核苷酸序列。“操作性連接”指兩個部分之間的一種功能性關系，在這種關系中，一部分的活性(例如調節轉錄的能力)對另一部分產生作用(例如序列的轉錄)。表達調控序列包括但不限于啟動子序列(例如誘導型，抑制型或組成型)，增強子，轉錄終止子，起始密碼子(即ATG)，內含子的剪接信號和終止密碼子。
“表達載體”指包含重組聚核苷酸的載體，該聚核苷酸又包含與待表達核苷酸序列操作性連接的表達調控序列。表達載體含有足量的順式作用表達元件；其它表達元件可由宿主細胞或體外表達系統提供。表達載體包括所有本領域已知的那些，例如含有重組聚核苷酸的粘粒、質粒(例如裸露的或被脂質體包被的)和病毒。
“編碼”指聚核苷酸內特殊核苷酸序列(例如基因，cDNA或mRNA)的遺傳特性，即作為模板在生物過程中合成具有確切核苷酸序列(即rRNA，tRNA和mRNA)或確切氨基酸序列以及由此產生的生物特性的其它聚合物或大分子。所以，如果在細胞或其它生物系統內由基因產生的mRNA經轉錄和翻譯產生了蛋白質，則稱該基因編碼該蛋白。某基因或cDNA的編碼鏈(核苷酸序列與mRNA的一致而且通常顯示在序列表內的鏈)和非編碼鏈(用作轉錄模板的鏈)都可以稱為編碼該基因或cDNA的蛋白或其它產物。除非另做說明，“編碼某氨基酸序列的核苷酸序列”包括編碼相同氨基酸序列的所有簡并版本。編碼蛋白質和RNA的核苷酸序列可包含內含子。
“吸能分子”指在解吸分光光譜儀中從能源吸收能量使得分析物從探針表面解吸的分子。MALDI中所用的吸能分子常稱為“基體(matrix)”。在生物有機分子激光解吸中常用肉桂酸、cinapinic酸和二羥基苯甲酸作為吸能分子。II.滯留層析滯留層析是一種多維度分辨樣品中分析物的方法。該方法包括(1)在多種不同的吸附劑/洗脫劑組合(“選擇性條件”)下將樣品中的分析物吸附到基質上和(2)用解吸譜法檢測被吸附分析物的滯留情況。各選擇性條件提供分離的第一維度，將被吸附分析物與不被吸附的那些分離。解吸質譜提供分離的第二維度，根據質量將吸附分析物與其它的分離。因為滯留層析使用多種不同的選擇性條件，所以可以獲得分離的許多維度。兩種選擇性條件下一種或多種分析物的相對吸附也可以確定。這種多維度分離既分辨了分析物又對它們進行了描述。
而且，由此分離的分析物仍然滯留為一張滯留圖，便于以后用來檢測(例如)分析物的結構和/或功能。而且，固定分析物本身可以用作吸附劑固定接觸基質的其它分析物。總之，本發明提供了一種迅速、多維度而且高信息分辨分析物的方法。
本發明方法可采用多種形式。實施例之一中，分析物在兩個不同的物理位置被兩種不同的吸附劑吸附，每種吸附劑用相同的洗脫劑(選擇閾值修飾劑)洗滌。另一實施例中，分析物在兩個不同的物理位置被相同的吸附劑吸附，每種吸附劑用不同的洗脫劑洗滌。另一實施例中，分析物在不同的物理位置被兩種不同的吸附劑吸附，并用兩種不同的洗脫劑洗滌。另一實施例中，分析物先用一種吸附劑吸附，用第一洗脫劑洗滌，檢測滯留情況；然后用不同的第二洗脫劑洗滌，再檢測滯留情況。
A.進行滯留層析的方法1.分析物與選擇性條件接觸a.基質的制備在滯留層析過程中，被吸附劑保留的分析物被呈遞給基質上的能源。含分析物的樣品可在吸附劑固定于用于向解吸機制呈遞分析物的基質之前或之后與吸附劑接觸。為了接觸，吸附劑可以是液態或固態(即位于基質上或呈固相)。具體地說，吸附劑的形式可以是溶液，懸浮液，分散系，油包水乳液，水包油乳液，或微乳液。當吸附劑的形式是懸浮液，分散系，乳液或微乳液時，可以有合適的表面活性劑存在。在這樣的實施例中，可以通過將液態樣品與液態吸附劑相互混合來使樣品與吸附劑接觸。或者，樣品可以位于固體支持物上，則可通過含樣品的支持物在液體吸附劑中的淋浴、浸泡或蘸來完成接觸。此外，可用液體吸附劑噴涂或洗滌固體支持物上的樣品來進行接觸。在這種實施例中，不同吸附劑可用不同容器提供。
在實施例之一中，吸附劑位于基質上。基質可以是能夠結合或固著吸附劑的任何材料。通常，基質包含玻璃；陶瓷；導電聚合物(例如炭化PEEK)；TEFLON包被的材料有機聚合物；天然生物聚合物；金屬(例如鎳，銅，鋼或鋁)；薄膜；多孔和無孔交聯聚合物微珠(例如瓊脂糖，纖維素或葡聚糖)；其他不溶性聚合物；或以上的組合。
在實施例之一中，基質的形式是插在解吸檢測器內的探針或樣品呈遞機制。例如，見圖1，基質是條形的。固定在基質上的吸附劑可以呈線形排列的位點，位點各自與分析物接觸。可將數條基質連在一起，許多吸附劑由此形成在確定列中具有30個分開的位點的排列。基質還可以是板型的，具有水平和垂直的吸附劑列，形成諸如正方形、矩形或圓等規則的幾何圖案。
可如下生產探針。基質可以是任何合適的固體材料，例如不銹鋼、鋁或硅薄片。然后，可用能修飾表面的材料包被金屬基質。例如，可用二氧化硅、二氧化鈦或金包被金屬表面。
然后用雙官能接頭修飾表面。雙官能接頭一端具有的官能團能夠共價結合表面上的官能團。這樣，該官能團可以是無機氧化物或針對金的巰基。接頭的另一端通常具有一個氨基官能團。有用的雙官能接頭包括氨基丙基三乙氧基硅烷或氨基乙基二硫化物。
一旦與表面結合，接頭用作為吸附劑的基團進一步衍生。通常，吸附劑被加在探針上的可定址位置。在一種探針中，直徑約3mm的位點排列成相互垂直的陣列。吸附劑本身可以是雙官能分子的一部分，該雙官能分子包含一個與可得氨基反應的基團和另一個作為吸附劑的官能團。官能團包括正常相(氧化硅)，反相(C18脂肪烴)，季胺和磺酸酯。還可以用其它雙官能分子，例如碳二酰亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，進一步修飾表面形成一張預-活化毯。可用生物有機吸附劑(例如核酸，抗體和其它蛋白質配體)將這類毯官能化。生物聚合物能夠通過胺殘基或巰基殘基結合毯上的官能團。在實施例之一中，吸附劑與交聯聚合物(例如薄膜)結合，交聯聚合物本身則通過可得官能團與探針表面結合。這類聚合物包括纖維素，葡聚糖，羧甲基葡聚糖，聚丙烯酰胺和以上的混合物。固定有吸附劑的探針就可供使用了。
在另一實施例中，吸附劑固定在提供固定相的第一基質(例如聚合物或玻璃微珠)上，第一基質再位于用于向解吸檢測器的解吸能呈遞樣品的第二基質上。例如，第二基質可以呈板式，在預定的可定址位置具有一系列孔。這些孔可以作為經吸附劑衍生的第一基質(例如用吸附劑衍生的聚合物珠)的容器。這種實施例的一個優點是分析物可以以一種物理關系吸附于第一基質，再轉移到樣品呈遞基質上進行解吸譜分析。
通常，將基質改變成可用本發明方法中的檢測器來檢測與吸附劑結合并被保留的分析物。在實施例之一中，基質以非固定方式插在一解吸檢測器內，能量源在此擊中位點并解吸分析物。可使基質適合水平和/或垂直安裝在一可平移管內，從而沿一條路徑水平和/或垂直移動基質到連續的預定的吸附劑的可定址位置上，接受能量源的詢問，檢測結合在位置上的分析物。基質的形式可以是常規的質譜探針。
條、板或探針形式的基質可用常規技術來制造。然后，在與含分析物的樣品接觸前，吸附劑可直接或間接偶聯、裝配或沉積在基質上。可用各種合適的固著或固定化方法將吸附劑與基質直接或間接偶聯。例如，可用吸附劑衍生基質使得吸附劑通過共價或非共價鍵與基質直接結合來將吸附劑與基質直接偶聯。
吸附劑在基質上的固著可通過多種機制實現。可用制備完全的吸附劑來衍生基質，即將預先制備好的吸附劑與基質連接。或者，可將前體分子固定在基質上，然后再向靠第一前體分子結合在基質上的成長鏈添加其它前體分子，由此在基質上形成吸附劑。這種在基質上構建吸附劑的方法尤其適用于聚合物，特別是諸如DNA或RNA分子等生物聚合物的吸附劑。可用本領域已知的寡核苷酸芯片技術，通過向固著于基質上的第一堿基連續添加堿基來制成生物聚合物吸附劑。參見，美國專利5,445,934(Fodor等)。
如圖2所示，可與一片基質偶聯少到2種多達10種，100種，1000種10,000種或更多種吸附劑。吸附劑位點的大小可根據實驗設計和實驗目的而不同。但是不能超過沖擊能源的直徑(例如激光點的直徑)。連續的位點上可以是相同或不同的吸附劑。有時，宜使同一吸附劑位于基質的多個不同位置，以允許用多種不同的洗脫劑進行評價或保存被吸附的分析物以備后用或參考(可能是在第二過程中)。提供帶有多種不同吸附劑的基質就能利用由不同吸附劑與一種樣品組合而產生的多種結合特性結合和檢測多種不同的分析物。在基質上用多種不同的吸附劑評價一種樣品基本上等同于用不同的層析柱同時進行的多個層析，但是本方法的優點在于只需要一個系統。
當基質包含多種吸附劑時，特別有用的是使吸附劑位于預定的可定址位置。吸附劑在預定的可定址位置上就能夠在預定第一可定址位置用第一洗脫劑洗滌吸附劑，在預定第二可定址位置用第二洗脫劑洗滌吸附劑。由此，可在以不同方式修飾吸附劑結合特性的不同洗脫劑存在下評價一種吸附劑對分析物的結合特性。可定址位置可排列成各種形式，但以規則圖案為宜，例如線形、矩形或如圓等規則曲線。同樣，當基質包含多種吸附劑時，可為了評價某給定吸附劑在洗脫劑存在下的結合特性而就各種不同吸附劑評價一種洗脫劑。還可以在不同洗脫劑存在下評價不同吸附劑的結合特性。
(1)遞增或梯度吸附表面通過在基質上合成不同的聚合吸附劑，可提供一系列具有不同結合特性的吸附劑。將一個前體分子固定在基質上，引發聚合反應，然后在各吸附劑完成不同程度時終止反應，如此可提供不同的聚合吸附劑。還可以與聚合物的末端官能團反應以便用不同的親合性試劑(例如-NH3或COO-)對其進行不同程度的化學衍生。通過終止聚合或衍生反應產生出聚合或衍生程度不同的吸附劑。不同的聚合或衍生程度使各種不同的聚合吸附劑具有不同的結合特性。該實施例尤其適合在基質上提供多種不同的吸附劑。
如果需要，可以在容器中而不是就在基質上進行聚合反應。例如，可以在聚合/衍生反應進行過程中從反應器中抽取等份的產物，得到具有不同結合特性的聚合吸附劑。在聚合/衍生反應過程中不同時刻收取的各等份將表現出不同的聚合/衍生程度，由此得到多種不同的吸附劑。然后，可將不同等份的產物用作具有不同結合特性的吸附劑。或者，可以順次重復終止反應的步驟，抽取等份的產物，然后重新啟動聚合/衍生反應，由此產生多種不同的吸附劑。在不同終止點抽取的產物將具有不同的聚合/衍生程度，由此產生多種具有不同結合特性的吸附劑。
實施例之一中，基質是被一種或多種結合特性呈單維或雙維梯度改變的吸附劑所包被的條形或板形。例如這樣的含吸附劑的條形，其一端為弱疏水性，另一端為強疏水性。或者這樣的板形，其一角為弱疏水性陰離子性，對角為強疏水性陰離子性。可通過有控噴涂或令材料按時間流經表面從而在梯度方向上逐步完成反應來形成這樣的吸附梯度。可以在垂直方向上重復這一過程，從而形成相同或不同結合特性的不同吸附劑的正交梯度。
可在吸附劑定位在基質上之前或之后，用能令分析物與吸附劑結合的合適方法讓含分析物的樣品接觸吸附劑。可簡單地將吸附劑與樣品混合或合并。樣品與吸附劑接觸可以通過將基質浸浴或浸漬在樣品中，或基質蘸涂以樣品，或將樣品噴涂在基質上，用樣品淋洗基質，或在與吸附劑的接觸中產生樣品或分析物。此外，樣品與吸附劑的接觸還可以通過將樣品溶于某種洗脫劑或與其混合，然后用上述技術(即浸浴，浸漬，蘸涂，噴涂或淋洗)使洗脫劑和樣品溶液與吸附劑接觸。
b.分析物與吸附劑接觸在分析物結合吸附劑前先讓樣品接觸洗脫劑，這具有在樣品接觸吸附劑的同時改變吸附劑選擇性的作用。結合吸附劑并因此滯留的樣品組分將只包括能夠在與樣品混合的特定洗脫劑存在下結合吸附劑的那些，而不是在沒有洗脫劑修飾吸附劑選擇性時能結合吸附劑的所有組分。
樣品必須與吸附劑接觸足夠長的時間以令分析物與吸附劑結合。通常，樣品與吸附劑接觸約30秒至12小時。較好的是樣品與吸附劑接觸約30秒至15分鐘。
樣品接觸吸附劑時的溫度與具體樣品和選用的吸附劑有關。通常，樣品在常溫常壓條件下接觸吸附劑，但是有些樣品可能需要改變溫度(通常在4℃至37℃之間)和壓力條件，這可由本領域熟練技術人員方便地加以確定。
本發明方法與常規方法相比的另一優點在于本發明能夠在少量樣品上進行許多不同的實驗。通常，含數埃摩爾至100皮摩爾分析物的1微升至500微升樣品就足以與吸附劑結合了。分析物可在與吸附劑結合后被保存，以用于以后的實驗，因為沒有經歷解吸和檢測所有滯留分析物這些步驟的位置將仍然保留分析物。所以，如果只有小部分樣品可供分析，本發明就提供了能夠在不同時間用不同吸附劑和/洗脫劑進行多個實驗而不浪費樣品的優點。
c.用洗脫劑洗滌吸附劑在樣品與吸附劑接觸使得分析物與吸附劑結合后，用洗脫劑洗滌吸附劑。通常，為了進行多維度分析，每個吸附劑位置至少用不同的第一和第二洗脫劑洗滌。洗脫劑洗滌改變了滯留在特定吸附劑上的分析物的量。吸附劑的結合特性與洗脫劑的洗脫特性結合形成了選擇性條件，控制著洗滌后被吸附劑保留的分析物的量。所以，洗滌步驟從吸附劑上選擇性地去除樣品組分。
可用多種技術進行洗滌步驟。例如前文所述，樣品可在接觸吸附劑前溶于或與第一洗脫劑混合。樣品在接觸吸附劑之前或同時接觸第一洗脫劑中的作用與先讓分析物結合吸附劑再用第一洗脫劑洗滌吸附劑的凈效果最接近。合并后的溶液與吸附劑接觸后，可用第二洗脫劑或后繼洗脫劑洗滌吸附劑。
洗滌結合有分析物的吸附劑可通過在洗脫劑中浸浴、浸漬、或蘸涂帶吸附劑的基質；或用洗脫劑淋洗、噴涂或洗滌來完成。最好用微流體工藝將洗脫劑引入小直徑的親合性試劑位點。
當分析物與一個位置上的吸附劑結合，并在洗滌步驟中使用了多種不同的洗脫劑時，可獲得有關吸附劑在各種洗脫劑存在下的選擇性信息。用第一洗脫劑洗滌，解吸并檢測滯留分析物，然后用第二洗脫劑洗滌，解吸并檢測滯留分析物，可通過如此重復在每次用洗脫劑洗滌后測定與一個位置上的吸附劑結合的分析物。可用相同的吸附劑以多種不同的洗脫劑重復洗滌，然后解吸和檢測。如此，可用多種不同的洗脫劑重復檢測一個位置上滯留有分析物的吸附劑，由此得出一系列有關各次洗滌后滯留的分析物的信息。
以上方法當吸附劑位于多個預定可定址位置時也有用，不論這些吸附劑是否相同。但是，當分析物與不同位置上相同或不同的吸附劑結合時，洗滌步驟可改用包括并行操作的更系統化、更有效的方法進行。即，洗滌步驟可以通過用洗脫劑洗滌第一位置上的吸附劑，再用洗脫劑洗滌第二吸附劑，然后解吸并檢測被第一吸附劑保留的分析物，再解吸和檢測被第二吸附劑保留的分析物。換言之，所有的吸附劑都用洗脫劑洗滌，然后解吸被各種吸附劑保留的分析物，并檢測吸附劑的位置。如有必要，在檢測了各吸附劑的位置后，可進行第二階段的洗滌，然后是第二階段的解吸和檢測。洗滌所有的吸附劑位置，然后在各個吸附劑位置解吸和檢測，可對多種不同的洗脫劑重復進行這些步驟。用這種方法，可用整個陣列有效鑒定樣品中各分析物。不論在第一階段洗滌中是用同一種洗脫劑洗滌所有的吸附劑位置還是用多種不同洗脫劑洗滌多個吸附劑，該方法都有用。
2.檢測洗滌后仍被吸附劑保留的分析物吸附在基質上。用解吸譜法來檢測滯留在基質上的分析物從吸附劑上解吸分析物，然后直接檢測解吸下的分析物。
a.解吸方法從吸附劑上解吸分析物包括令分析物接觸合適的能源。這通常意味著用放射能或能量粒子撞擊分析物。例如，能量可以是激光能(例如UV激光)或閃光燈能形式的光能。或者，能量可以是一股快速原子流。也可以用熱能來誘導/協助解吸。
解吸和/或離子化分析物以便直接分析的方法在本領域是眾所周知的。其中之一稱為由基體協助的激光解吸/離子化或MALDI。MALDI中，分析物溶液與基體溶液混合，混合物沉積在惰性探針表面，然后結晶，分析物因被晶體包埋而解吸。選用的基體吸收激光能并傳遞給分析物，導致解吸和離子化。通常，基體吸收UV范圍內的光。有關大蛋白的MALDI可參見美國專利5,118,937(Hillenkamp等)和美國專利5,045,694(Beabis和Chait)。
由表面強化的激光解吸/離子化或SELDI代表了比之MALDI在特異性，選擇性和靈敏度方面的一大進步。有關SELDI參見美國專利5,719,060(Hutchens和Yip)。SELDI是一種固相解吸法，在其中，分析物被呈遞給表面上的能流，該表面強化分析物的捕獲和/或解吸。相比之下，MALDI是一種液相方法，在其中，分析物與液體物質混合，液體物質包圍著分析物形成結晶。
SELDI的一種方式稱SEAC(由表面強化的親合性捕捉)，包括將分析物呈遞給與一親合性捕捉機構(即吸附劑)偶聯的解吸能。已發現，用這種方法將被吸附的分析物呈遞給解吸能源時，實現目標分析物解吸的機會更大。可向探針添加吸能物質協助解吸。然后可向能源呈遞探針以解吸分析物。
另一種SELDI稱SEND(由表面強化的凈解吸)，包括使用一吸能物質層，上面放以分析物。基質表面有一層與之化學結合的吸能分子，而且/或者基本無晶體。然后將純(即凈)分析物涂在層的表面，不與其發生實質性混合。吸能分子象基體那樣吸收解吸能并使分析物被解吸。這一進步是實質性的，因為由于消除了溶液混合物和隨機結晶的作用，現在可以更簡單更均一的方式將分析物呈遞給能源。這使得結果更統一更可預計，因此可能實現過程的自動化。吸能物質可以是經典基體材料或者是pH被調至中性或堿性的材料。吸能分子可通過共價鍵或非共價鍵與探針結合。
另一種SELDI稱SEPAR(由表面強化的光不穩定附著與釋放)，包括使用光不穩定附著分子。光不穩定分子是一種二價分子，具有一個與固相(例如可作為探針一部分的探針平表面或珠體等其它固相)共價結合的位點，和可與親合性試劑或分析物共價結合的第二位點。當光不穩定附著分子與表面和分析物結合時另含一個可在光照后釋放親合性試劑或分析物的光不穩定鍵。光不穩定鍵可在附著分子內，或者在與分析物(或親合性試劑)或探針表面附著的位置。
b.直接檢測分析物的方法有數種方法可檢測解吸下的分析物。當分析物在解吸過程(例如激光解吸/離子化質譜法)中被離子化時，檢測器可以是離子檢測器。質譜儀一般包括測定解吸離子飛行時間的手段。這一信息被轉化為質量。但是，沒有必要測定解吸離子的質量來分辨和檢測它們離子化的分析物在不同時刻撞擊檢測器這一事實實現了它們的檢測和解吸。
或者，可用例如熒光基團或放射性基團可測性標記分析物。此時，檢測器可以是熒光或放射性檢測器。
可相繼使用多種檢測方法來充分獲得與陣列中各位置上滯留物相關的分析物組分和功能信息。
c.解吸檢測器解吸檢測器具有將分析物從吸附劑上解吸的機構和直接檢測解吸下的分析物的機構。即，解吸檢測器不需要將分析物捕捉到另一固相內然后進行分析的中間步驟就可檢測解吸分析物。檢測分析物一般涉及檢測信號強度。后者反映與吸附劑吸附的分析物的量。
解吸檢測器還具有除上述兩元件外的其它元件。其中之一是加速解吸分析物向檢測器移動的機構。另一元件是測定分析物從解吸到被檢測器測得之間飛行時間的機構。
較好的解吸檢測器是本領域熟知的激光解吸/離子化質譜儀。質譜儀具有一個供插入攜帶被吸附分析物的基質(例如探針)的端口。解吸通過用能量例如激光能撞擊分析物來進行。該設備可具有表面平移機構，使得陣列上的任一點都可與激光束共線。激光撞擊分析物使完整的分析物解吸進入飛行管并被離子化。飛行管一般是一個真空。真空管一段內的帶電板產生一個電勢能，加速離子化的分析物向檢測器移動。由時鐘測定飛行時間，由系統電子設備測定分析物的速度并轉化為質量。本領域技術人員都知道，以上各元件中任何一個都可以與本發明所述的其它元件組合，組裝成利用各種解吸、加速、檢測、時間測定等手段的解吸檢測器。
B.選擇性條件本發明優點之一是能夠令分析物處于多種不同的結合和洗脫條件下，由此既提高了分析物分辨率，又增加了有關它們識別特征形式的信息。和常規層析法一樣，吸附劑保留分析物的能力直接與比之分析物與洗脫劑之間或洗脫劑與吸附劑之間的引力或親合性的分析物對吸附劑的引力或親合性相關。當樣品與吸附劑接觸時，樣品中的某些組分可能因沒有與吸附劑的親合性而不與之結合。因為不能結合吸附劑，它們可立即與待分辨分析物分離。但是，根據樣品的性質和所用的具體吸附劑，許多不同組分在一開始能夠與吸附劑結合。
1.吸附劑吸附劑即結合分析物的物質。滯留層析可使用多種吸附劑。不同的吸附劑表現出大不相同的結合特性，有些不同的結合特性，或略有不同的結合特性。結合特性大不相同的吸附劑一般在引力基礎或相互作用模式上有差異。引力基礎一般是一種化學或生物分子識別功能。吸附劑與分析物之間的引力基礎包括，例如(1)鹽促相互作用，例如疏水性相互作用，親硫性相互作用和固定化染料相互作用；(2)氫鍵和/或范德華力相互作用和電荷轉移相互作用，例如在親水性反應中；(3)靜電相互作用，例如離子電荷相互作用，尤其是正負離子電荷相互作用；(4)分析物與吸附劑中的金屬離子形成配位共價鍵(即形成配位配合物)的能力；(5)酶活位置的結合；(6)可逆共價相互作用，例如二硫鍵互換作用；(7)糖蛋白相互作用；(8)生物特異性相互作用；或(9)上述兩種或兩種以上相互作用方式的組合。即，吸附劑可以表現出兩種或兩種以上引力基礎，即所謂“混合官能”吸附劑。
a.鹽促相互作用吸附劑用于評定鹽促相互作用的吸附劑包括疏水性相互作用吸附劑。疏水性相互作用吸附劑包括具有脂肪烴，尤其是C1-C18脂肪烴的基體；和具有芳香烴官能團例如苯基的基體。疏水性相互作用吸附劑所結合的分析物包括暴露于溶劑中的不帶電氨基酸殘基，特別是常說的非極性、芳香族疏水性氨基酸殘基，例如苯丙氨酸和色氨酸。與疏水性相互作用吸附劑結合的分析物的具體例子包括溶菌酶和DNA。在特定理論之外，DNA被認為是因為其中的芳香性核苷酸，具體地說即嘌呤和嘧啶基團與疏水性相互作用吸附劑結合的。
用于評定鹽促相互作用的其他吸附劑包括親硫性相互作用吸附劑，例如T-GEL，這是Pierce，Rockford，Illinois出售的一種親硫性吸附劑。親硫性相互作用吸附劑吸附(例如)IgG等免疫球蛋白。IgG與T-GEL之間相互作用的機制尚不完全清楚，但暴露于溶劑中的trp基團可能起著一定的作用。
涉及鹽促離子相互作用和疏水性相互作用的第三種吸附劑包括固定化染料相互作用吸附劑。固定化染料相互作用吸附劑包括固定化染料的母質，例如Pharmacia Biotech，Piscataway，New Jersey的CIBACHRONTM藍。固定化染料相互作用吸附劑通常結合蛋白質和DNA。與固定化染料相互作用吸附劑結合的蛋白質的一個具體例子是牛血清白蛋白(BSA)。
b.親水性相互作用吸附劑用于評定基于親水性相互作用的氫鍵和/或范德華力的吸附劑包括包含諸如氧化硅(玻璃)的常態吸附劑的表面。常態或氧化硅表面起著官能團的作用。此外，包含親水性聚合物(例如聚乙二醇，葡聚糖，瓊脂糖或纖維素)修飾表面的吸附劑也可以作為親水性相互作用吸附劑。大多數蛋白質結合親水性相互作用吸附劑，因為許多氨基酸殘基(即親水性氨基酸殘基)通過氫鍵或范德華力的親水性相互作用結合。結合親水性相互作用吸附劑的蛋白質的例子包括肌紅蛋白，胰島素和細胞色素C。
通常，極性或帶電氨基酸比例較高的蛋白質將滯留在親水性表面上。或者，親水性糖基暴露于表面的糖蛋白對親水性吸附劑的親合性也很高。
c.靜電相互作用吸附劑用于評定靜電或離子相互作用的吸附劑包括陰離子吸附劑，例如硫酸根陰離子基體(即SO3-)和羧基陰離子(即COO-)或磷酸根陰離子(即OPO3-)基體。帶有硫酸根陰離子的基體始終帶負電。但是，帶羧基陰離子的基體只有當pH高于其pKa時才帶負電。當pH低于pKa時，基體基本上呈電中性。合適的陰離子吸附劑還包括基體帶有硫酸根和羧基和磷酸根的組合的的吸附劑。這種組合可令負電荷強度隨pH連續變化。這類吸附劑吸引并結合帶正電的蛋白質或大分子，例如核糖核酸酶和乳鐵蛋白。除特定理論之外，據信是吸附劑與正電氨基酸殘基(包括賴氨酸殘基，精氨酸殘基和組氨酸殘基)之間的靜電相互作用造成了結合。
用于評定靜電或離子相互作用的吸附劑還包括陽離子吸附劑。具體例子包括仲胺，叔胺或季胺基體。季胺總是帶正電。但是，仲胺和叔胺所帶電荷具有pH依賴性。當pH低于pKa時，仲胺和叔胺帶正電，當pH高于pKa時，仲胺和叔胺帶負電。合適的陽離子吸附劑還有包含仲胺，叔胺和季胺的組合的基體。這種組合使得正電強度隨pH連續變化。陽離子吸附劑與分子上的陰離子位置結合，所述的分子包括氨基酸殘基(例如天冬氨酸和谷氨酸殘基)暴露于溶劑中的蛋白質。
如果是離子(既包括陰離子也包括陽離子)相互作用吸附劑，常需要使用既包含陰離子又包含陽離子的混合型離子吸附劑。這樣的吸附劑具有與pH相關的連續緩沖能力。這種連續緩沖能力使得多種分析物能夠與含有不同緩沖組分(尤其是pH在2至11之間)的洗脫劑接觸。由此形成由固定化可滴定質子交換基團決定的吸附劑上的局部pH環境。這樣的系統等同于稱為色譜聚焦的固相分離技術。區別主要在于帶電糖組分的促卵泡素異構體是在色譜聚焦吸附劑上分離的。
用于評定靜電或離子相互作用的其它吸附劑包括偶極-偶極相互作用吸附劑，其中的相互作用是靜電力，但是不涉及正規的電荷或可滴定蛋白供體或受體。
d.配位共價鍵相互作用吸附劑用于評定與金屬離子形成配位共價鍵的能力的吸附劑包括帶有(例如)二價或三價金屬離子的基體。固定化金屬離子螯合劑基體提供的固定化合成有機分子具有一個或兩個供電子基團，這些基團形成與過渡金屬離子之間配位共價鍵相互作用的基礎。作為固定化金屬離子螯合劑的基本供電子基團包括氧，氮和硫。金屬離子與固定化金屬離子螯合劑結合，形成留有數個位置與分析物上供電子基團反應的金屬離子配合物。合適的金屬離子一般為例如銅、鎳、鈷、鋅、鐵等過渡金屬離子，以及諸如鋁和鈣等其它金屬離子。除特定的理論之外，金屬離子被認為與肽、蛋白質中的氨基酸殘基或核酸選擇性反應。通常，參與這類相互作用的氨基酸殘基有組氨酸殘基，酪氨酸殘基，色氨酸殘基，半胱氨酸殘基，以及具有氧基的氨基酸例如天冬氨酸和谷氨酸。例如，固定化三價鐵離子與蛋白質上的磷酸絲氨酸，磷酸酪氨酸和磷酸蘇氨酸殘基反應。根據固定化的金屬離子，只有那些上述氨基酸殘基的局部密度足夠大的蛋白質才被保留。某些金屬離子與蛋白質之間的相互作用如此之強以致于無法用常規方法從配合物中切取蛋白質。高度磷酸化的人β酪蛋白與固定化Fe(III)的結合非常強。表達時帶有6-組氨酸標記的重組蛋白與固定化Cu(II)和Ni(II)的結合非常強。
e.酶活位點相互作用吸附劑用于評定酶活位點結合的吸附劑包括蛋白酶(例如胰蛋白酶)，磷酸酯酶，激酶和核酸酶。這種相互作用是分析物(通常是一種生物聚合物)上酶結合位點與酶上催化性結合位點之間的一種序列特異性相互作用。這類酶結合位點包括例如胰蛋白酶上與序列中具有賴氨酸-賴氨酸或賴氨酸-精氨酸的蛋白質和肽相互作用的活性位點。更具體地說，大豆胰蛋白酶抑制劑與固定化胰蛋白酶吸附劑作用并結合。或者，絲氨酸蛋白酶選擇性滯留在固定化L-精氨酸吸附劑上。
f.可逆共價相互作用吸附劑用于評定可逆共價相互作用的吸附劑包括二硫鍵互換作用吸附劑。二硫鍵互換作用吸附劑包括具有固定化巰基(例如巰基乙醇或固定化二硫蘇糖醇)的吸附劑。相互作用的基礎是在吸附劑與分析物上暴露于溶劑中的半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵。這類吸附劑結合具有半胱氨酸殘基的蛋白質或肽以及堿基被修飾成包含還原硫化合物的核酸。
g.糖蛋白相互作用吸附劑用于評定糖蛋白相互作用的吸附劑包括例如內有固定化凝集素(即帶有寡糖的蛋白質)的吸附劑，例如Pharmacia Biotech of Piscataway，New Jersey出售的CONCONAVALINTM。這類吸附劑的作用基礎涉及對大分子上糖部分的分子識別的相互作用。與糖蛋白相互作用吸附劑反應并與之結合的分析物包括例如糖蛋白，特別是富含組氨酸的糖蛋白，全細胞或分離的亞細胞成分。
h.生物特異性相互作用吸附劑用于評定生物特異性相互作用的吸附劑通常稱為“生物特異親合性吸附劑”。如果吸附作用有選擇性，而且親合力至少為10-3M至例如10-5M、10-7M，10-9M，則認為是生物特異性的。生物特異親合性吸附劑的例子包括任何與特定生物分子特異性反應并與之結合的吸附劑。生物特異親合性吸附劑包括例如結合抗原的固定化抗體；結合DNA結合蛋白、DNA和RNA的固定化DNA；結合蛋白質或酶的固定化底物或抑制劑；結合藥物結合蛋白的固定化藥物；結合受體的固定化配體；結合配體的固定化受體；結合DNA和RNA結合蛋白的固定化RNA；結合生物素和生物素化分子的固定化親合素或鏈霉親合素；結合脂質體結合蛋白的磷酸脂質膜和運載體。酶是可用來修飾與之結合的分析物的吸附劑。細胞是有用的吸附劑。它們的表面具有復雜的結合特性。與細胞的吸附可用來鑒定例如結合表面受體的配體或信號分子。病毒和噬菌體也可用作吸附劑。病毒常具有細胞表面受體的配體(例如CD4的gp120)。而且，在噬菌體展示文庫形式中，噬菌體包被蛋白起著與靶分子結合的檢測劑的作用。生物特異性相互作用吸附劑依賴于上述公知的特異性反應。吸附劑可利用的其它生物特異性相互作用的例子對本領域熟練技術人員來說是顯而易見的，而且包括在本發明構思中。
實施例之一中，生物特異性吸附劑還具有某種助劑，或“輔助者”，即不直接參與與靶分析物結合的分子。
i.結合特異性程度通過接觸具有不同相互作用方式的吸附劑，樣品中的組分根據其與不同吸附劑的相互作用被大致區分。這樣，分析物與具有不同相互作用方式的吸附劑之間的引力提供了第一分離參數。例如，通過含分析物的樣品與以疏水性為引力基礎的第一吸附劑和以離子電荷為引力基礎的第二吸附劑接觸，可從樣品中分離出結合疏水性吸附劑的分析物，和分離出結合帶有特定離子電荷的吸附劑的分析物。
具有不同引力基礎的吸附劑能夠低特異性地分辨分析物，因為吸附劑不僅結合分析物，而且結合樣品中以同一引力基礎吸引吸附劑的其它成分。例如，疏水性吸附劑不僅結合疏水性分析物，還結合樣品中其它疏水性成分；負電吸附劑不僅結合正電分析物，還結合樣品中其它正電成分；等等。
通過采用相對中等特異性的結合特性或改變引力強度可以進一步改善以分析物與吸附劑之間的引力為基礎的分析物分辨率。基于中等特異性結合特性的分析物分辨率可用混合官能團吸附劑來實現。當以較低特異性完成分析物的分辨后，可結合多種其它結合和洗脫特性利用吸引感興趣的分析物的結合特性，以去除仍為不需要的組分，由此分辨出分析物。
例如，如果分析物結合疏水性吸附劑，可通過提供以疏水性相互作用為引力基礎之一且另含第二種不同的引力基礎的混合官能吸附劑將分析物進一步與其它疏水性樣品組分分開。混合官能吸附劑可能表現出疏水性相互作用和負電離子相互作用，所以結合帶正電的疏水性分析物。或者，混合官能吸附劑可能表現出疏水性相互作用和與金屬離子形成配合共價鍵的能力，所以結合能與吸附劑上金屬離子形成配位配合物的疏水性分析物。基于以上公開內容和舉例，表現出中等特異性結合特性的其它吸附劑例子對本領域熟練技術人員來說是顯而易見的。
基于中等特異性結合特性分辨分析物可以通過利用較高特異性的結合特性來進一步精細化。利用較高特異性的結合特性可以通過使用引力基礎相同但引力強度不同的多種吸附劑。換言之，雖然引力基礎相同，但是用對分析物親合性程度不同的吸附劑可以進一步將分析物與其它樣品組分區分。
例如，基于自身酸性結合吸附劑的某分析物可用特定酸性pH范圍內對分析物具有親合性的吸附劑將其與其它酸性樣品組分進一步區分。這樣，分辨分析物可以是用一種吸附劑吸引pH1-2的樣品組分，用另一種吸引pH3-4的樣品組分，用第三種吸附劑吸引pH5-6的樣品組分。以這種方式，可以將對結合pH5-6分析物的吸附劑具有親合性的分析物與pH1-4的分析物分辨開來。通過降低引力間隔，即表現出相同引力基礎的吸附劑結合特性間的差異，可以使用更高特異性的吸附劑。
吸附于原吸附劑的原分析物本身可能具有吸附劑性能。此時，吸附于基質的原分析物可變成第二吸附劑用于分離第二分析物。以此類推，滯留的第二分析物可以作為第三吸附劑從樣品中分離第三分析物。以上過程可重復數次。
2.洗脫劑洗脫劑或稱洗滌溶液選擇性地改變分析物與吸附劑之間的吸附閾值。洗脫劑解吸和洗脫已結合分析物的能力與其洗脫特性有關。不同的洗脫劑可能表現出大不相同的洗脫特性，有些不同的洗脫特性或略有不同的洗脫特性。
洗脫劑與吸附劑的接觸溫度與具體的樣品和選用的吸附劑有關。通常，洗脫劑在0℃至100℃間的某溫度接觸吸附劑，以4℃至37℃為佳。但是，對有某些洗脫劑來說，其它溫度更合適，這些，本領域熟練技術人員很容易確定。
和吸附劑一樣，洗脫特性大不相同的洗脫劑通常引力基礎不同。例如，洗脫劑與分析物之間各種引力基礎包括電荷或pH，離子強度，水結構，特定競爭性試劑的濃度，表面張力，介電常數以及上述數者。
a.基于pH的洗脫劑基于pH(即電荷)改變吸附劑選擇性的洗脫劑包括已知的pH緩沖劑，酸溶液和堿溶液。通過用特定pH的緩沖劑洗滌結合的分析物可以改變電荷，所以可能削弱特定pH下吸附劑與分析物之間的結合強度。在洗脫劑的pH下競爭性較低的分析物將從吸附劑上解吸而洗脫，僅留下在洗脫劑的pH下與吸附劑結合更牢固的分析物。
b.基于離子強度的洗脫劑在離子強度上改變吸附劑選擇性的洗脫劑包括各種類型和濃度的鹽溶液。溶于洗脫劑溶液的鹽量影響著洗脫劑的離子強度，相應改變吸附劑的結合能力。低鹽濃度的洗脫劑在離子強度上對吸附劑結合能力的改變較小。高鹽濃度的洗脫劑在離子強度上對吸附劑結合能力的改變較大。
c.基于水結構的洗脫劑通過改變水結構或濃度來改變吸附劑選擇性的洗脫劑包括尿素和離液性鹽溶液。通常，尿素溶液包括濃度在0.1至8M的溶液。可用來提供洗脫劑的離液鹽包括硫氰化鈉。基于水結構的洗脫劑因水合作用或結合水的改變而改變吸附劑的吸附能力。這類洗脫劑包括例如甘油，乙二醇和有機溶劑。離液陰離子提高非極性成分的水溶性因而降低分析物與吸附劑之間的疏水作用。
d.基于除垢劑的洗脫劑在表面張力和分析物結構上改變吸附劑選擇性的洗脫劑包括除垢劑和表面活性劑。適合用作洗脫劑的除垢劑包括離子型和非離子型除垢劑，例如CHAPS，TWEEN和NP-40。基于除垢劑的洗脫劑改變吸附劑結合分析物的能力是因為，當引入了除垢劑的疏水性和親水性基團時，疏水相互作用被改變。分析物和吸附劑之間以及分析物內部的疏水相互作用被改變并且引入了帶電基團，例如，離子型除垢劑SDS引起蛋白質變性。
e.基于疏水性的洗脫劑在介電常數上改變吸附劑選擇性的洗脫劑是在疏水相互作用方面改變吸附劑選擇性的洗脫劑。具有此種能力的洗脫劑的合適實例有尿素有機溶劑(0.1-8M)，例如丙醇、乙腈、乙二醇和甘油，還有前文所述的除垢劑。乙腈常在反相層析中用作洗脫劑。在洗脫劑中包含乙二醇能夠從用親硫型吸附劑進行的鹽促反應中洗脫免疫球蛋白。
f.組合洗脫劑合適的洗脫劑可以是選自以上的任何一種，也可以由以上兩種或兩種以上組合而成。包含兩種或兩種以上上述洗脫劑的洗脫劑能夠基于多種洗脫特性改變吸附劑對分析物的選擇性。
3.兩參數的可變性通過選用不同吸附劑來提供不同吸附特性的能力和通過用不同洗脫劑洗滌來提供不同洗脫特性的能力允許兩參數各自改變，各自都能影響分析物結合吸附劑的選擇性。這兩個參數能夠作較大范圍的改變提供了一個較大范圍的結合引力和洗脫條件，使得本發明方法能夠用于結合并由此檢測多種不同類型的分析物。
即使尚不知道分析物的性質，在分析特定樣品時吸附劑和洗脫劑的選擇仍取決于樣品的性質和有待描述的具體分析物或分析物所屬類別。通常，較適宜的是提供一個表現出多種結合特性和多種洗脫特性的系統，尤其是在樣品組成未知時。通過提供選擇特性范圍較寬的系統，目標分析物被一種或多種吸附劑保留的可能性將顯著提高。
化學或生物化學分析領域的技術人員都能夠確定用于通過提供具有廣泛結合和洗脫特性的系統來保留特定分析物的選擇性條件，并評定出提供最佳分析物分辨率的結合和洗脫特性。因為本發明提供了具有多種選擇性條件的系統，無需過多的試驗，本領域熟練技術人員就能夠方便地確定特定分析物的最適結合和洗脫特性。
C.分析物本發明能夠基于分析物的多種生物、化學、或理化特性通過合適的選擇性條件利用這些特性來分辨分析物。眾多通過合適的選擇性條件可加以利用的分析物特性包括疏水性指數(或分析物中疏水性殘基的量度)，等電點(即分析物不帶電時的pH)，疏水性力矩(分析物的兩性量度或極性與非極性殘基分布的不對稱性)，側向偶極力矩(或分析物內電荷分配布的不對稱性)，分子結構因子(引起分析物分子表面構形改變，例如沿分子骨架大側鏈的分布改變)，二級結構組成(例如螺旋、平行和反平行平面)，二硫鍵，暴露于溶劑的供電子基團(例如His)，芳香性(或分析物內芳香基之間pi-pi相互作用的量度)和帶電原子間的線性距離。
以上是可用本發明方法通過選擇合適的選擇性特性從樣品中分辨出給定分析物的特性種類的代表性舉例。可作為分辨樣品中特定分析物的基礎的其它合適的分析物特性是本領域熟練技術人員熟知的，并且包括在本發明構思中。
本發明在可分析的樣品類型上沒有限制。樣品可以是固態、液態或氣態，但通常，樣品是液態的。固態或氣態樣品最好用本領域熟知的技術溶于合適的溶劑成為液態樣品。樣品可以是生物組合物，非生物有機組合物或無機組合物。本發明特別適用于分辨生物樣品，尤其是生物液體和提取物中的分析物；還特別適用于分辨非生物有機組合物中的分析物，尤其是有機小分子和無機分子的組合物。
分析物可以是分子，多聚分子復合物，大分子組合物，細胞，亞細胞器，病毒，分子片段，離子或原子。分析物可以是樣品中的單獨一種組分，也可以是具有一個或多個相同特性(例如分子量、等電點、離子電荷、疏水/親水相互作用等)并且具有結構、化學、生物或功能關聯的一類組分。
可用本發明滯留層析法分辨的分析物的具體實例包括生物大分子，例如肽、蛋白質、酶、聚核苷酸、寡核苷酸、核酸、糖、寡糖、多糖；上述生物大分子的片段，例如核酸片段、肽片段和蛋白質片段；上述生物大分子的復合物，例如核酸復合物，蛋白質-DNA復合物，受體-配體復合物，酶-底物、酶抑制劑，肽復合物，蛋白復合物，糖復合物和多糖復合物；生物小分子，例如氨基酸、核苷酸、核苷、單糖(sugar)、甾體、脂質體、金屬離子、藥物、激素、酰胺、胺、羧酸、維生素和輔酶、醇、醛、酮、脂肪酸、卟啉、類胡蘿卜素、植物生長調節素、磷酯和核苷二磷糖、合成小分子，例如藥學或治療上的有效藥物、單體、肽類似物、甾體類似物、抑制劑、誘變劑、致癌物、抗有絲分裂藥、抗生素、離子載體、抗代謝藥、氨基酸類似物、抗菌劑、轉運抑制劑、表面活性劑、線粒體和葉綠體功能抑制劑、供電子體、運載體和受體，合成的蛋白酶底物，磷酸酶底物，酯酶和脂酶的底物，和蛋白質修飾劑；以及合成的聚合物、寡聚物和共聚物，例如聚烯、聚酰胺、聚(甲基)丙烯酸、聚砜、聚苯乙烯、聚醚、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚羧酸酯、聚鹵乙烯、聚硅烷、POMA、PEG和以上兩者或兩者以上的共聚物。III.信息處理在特定洗脫條件下檢測被吸附劑結合的分析物提供了有關樣品中分析物及其化學特征的信息。吸附作用在一定程度上取決于吸附劑的結合特性。與吸附劑結合的分析物具有使得結合成為可能的特性。例如，在特定pH下是陽離子的分子在具有該pH的洗脫條件下將與陰離子吸附劑結合。強陽離子分子只有在很強的洗脫條件下才從吸附劑上洗脫。具有疏水區的分子將結合疏水性吸附劑，而具有親水區的分子將結合親水性吸附劑。同樣，相互作用的強度在一定程度上取決于分析物包含疏水區或親水區的程度。所以，樣品中特定分析物在特定洗脫條件下結合某種吸附劑的確定不僅通過分析物的彼此分離和與不具有結合所需的相應化學特性的分析物的分離而分辨了混合物中的分析物，而且鑒定出了具有特定化學特性的一類或單個分析物。采集有關分析物在多種洗脫條件下在一種或多種吸附劑上的滯留信息不僅可詳細分辨混合物中的分析物，而且提供有關分析物的化學信息，這些信息本身就可以完成對他們的鑒定。這種數據被稱為“滯留數據”。
用可編程計算機分析滯留試驗得出的數據是最簡便的。計算機程序一般包括一個儲存編碼的可讀介質。某計算機編碼進入存儲，其中包含了基質陣列上各特征點的位置，該處的吸附劑和用來洗滌吸附劑的洗脫條件。程序于是可用這些信息鑒定出陣列上確定某特定選擇性條件的一組特征。計算機還包括這樣的編碼，它們接受來自探針上特定可定址位置的不同分子量的信號強度數據。這些數據指示所測分析物的數量，可能包括所測各分析物的信號強度和測得的分子量。
計算機還具有處理數據的編碼。本發明構思包含了多種處理數據的方法。實施例之一中，處理方法涉及形成一個分析物識別特征概況。例如，可將據分子量測得的特定分析物的滯留情況數據根據特定的結合特性(例如與陰離子吸附劑或疏水性吸附劑結合)分類。收集到的數據提供某特定分析物化學特征的概況。滯留特性反映分析物功能，后者繼而反映結構。例如，在配位共價金屬螯合劑上滯留說明多肽分析物內存在組氨酸殘基。根據不同pH洗脫條件下在多種陽離子和陰離子吸附劑上的滯留水平數據所揭示的信息可以得出某蛋白質的等電點。這進而反映出該蛋白質內離子氨基酸的大致數量。所以，計算機可能包含將結合信息轉化為結構信息的編碼。而且，對分析物的二次處理(例如翻譯后修飾)改變識別特征，這可以由結合或質量差異反映出來。
另一實施例中，在一組相同選擇性閾值下對兩種不同的細胞進行滯留試驗，并將兩次試驗的滯留數據進行比較。滯留圖(即任一特征點信號的存在或強度)內的差異顯示由兩細胞差異表達分析物。這可能包括，例如，形成一個顯示兩次滯留試驗之間結合信號差異的差異圖，由該圖顯示在兩試驗中，那些分析物被吸附劑保留增加或減少。
計算機還可能包含接收程序員輸入的指令的編碼。陣列內特定、預定位置上分析物選擇性解吸的累進和邏輯軌跡是可以預計并編程的。
計算機能夠將數據轉化成另一種格式供顯示。數據分析包括由收集到的數據確定(例如)與特征點位置有關的信號強度，去除“界外值”(偏離預定統計分布的數據)，和由留下的數據計算分析物的相對結合親合力。
得出的數據可以各種格式顯示。一種格式中，信號強度顯示成分子量的函數圖。另一種格式又稱“凝膠格式”，其中，信號強度沿著線性軸以暗度強度值顯示，得出的外觀類似于凝膠上的條帶。另一格式中，達到一定閾值的信號顯示為分子量橫軸上的垂直線或條柱。于是，各條柱代表一種所測分析物。數據還可以顯示成根據結合特性和/或洗脫特性歸類的某分析物的信號強度圖。IV.滯留層析的應用滯留層析涉及多種分離方法的組合，包括并行檢測和描述多種分析物。這些組合方法具有多種用途。這些用途包括但不限于發展靶分析物檢測法；發展蛋白質純化策略；蛋白質純化方法；從噬菌體展示文庫中鑒定出結合靶分析物的特定噬菌體，包括用互補噬菌體展示文庫鑒定靶表位；基于分析物理化特性的蛋白質鑒定；基因表達監測和差異蛋白質展示；毒理學篩選；多種診斷標記的同時檢測；藥物開發；聚合蛋白組裝監測和體外聚核苷酸翻譯檢測。
A.從一樣品中依次抽提分析物的方法滯留層析涉及在多種吸附/洗脫條件下分析某分析物的滯留情況。這種方法的一種改變是依次抽提。在依次抽提中，樣品并不是毫無關聯地與兩種不同的選擇性條件接觸。相反，樣品與第一選擇性條件接觸，從樣品中抽提出某些分析物到吸附劑上，并在洗脫劑中留下未吸附的分析物。然后，該洗脫劑與第二選擇性條件接觸。這進一步從洗脫劑中抽提出各種分析物。通常，如果第一和第二次接觸中的洗脫劑具有不同的引力基礎(例如正常相和疏水性)，吸附劑將從洗脫劑中抽提出一組不同的分析物。第二洗脫劑然后接觸第三選擇性條件，并以此類推。在進行依次抽提的實施例中，吸附劑被置于測試格底以便樣品在它上面混合。在吸附劑中加入某種洗脫劑，樣品中的分析物與吸附劑結合后，收集洗脫劑洗液。集得的洗液然后接觸第二吸附劑，并通過結合從樣品中抽提出分析物。
實施例之一中，依次抽提的目的是制備而不是分析。更具體地說，目標可能是為了抽提樣品中除所需分析物外的所有其它組分。此時，樣品量一般很少，例如一個直徑幾毫米位點上的幾微升。吸附劑的選擇目的是不吸附希望留在樣品中的分析物。數次重復后，最終集得的洗液中沒有不需要的分析物，而留有需要的供以后的分析，例如解吸譜法或傳統的層析法。
另一實施例中，用各種分析技術分析了沒有滯留的樣品本身中的分析物。甚至在一步滯留后，該方法允許對吸附于吸附劑的物質和未吸附的分析物進行檢測。
B.逐步分辨樣品中分析物的方法滯留層析的一個目的是從復雜的樣品混合物中準確地分辨出分析物。這對于臨床診斷、藥物開發和功能性基因組來說特別重要。這些領域可能涉及從生物樣品中鑒定出一種或多種分析物。本發明提供了一種鑒定改善某分析物分辨率的選擇性條件的方法。該方法涉及鑒定這樣一種分析物被保留的選擇性條件，以及在重復過程中，增加選擇性條件的結合特性或洗脫特性，從而提高分析物的分辨率。
一份復雜樣品與選擇性條件接觸的質譜一般包括樣品中許多組分的信號。信號的復雜性會干擾分析物的準確分辨。逐步分辨分析物的方法能夠鑒定出提高分析物分辨率的選擇性條件，從而可準確檢測樣品中的分析物。如果分析物的信號更易于與其他組分的信號相區分，則該選擇性條件表現出與其他選擇性條件相比對某分析物“更高的分辨率”。這可能包括(例如)減少吸附于吸附劑的分析物數量，由此減少信號總數，或提高選擇性條件對該分析物的選擇性，由此比之他信號增強該分析物的信號。當然，當僅有分析物結合吸附劑時，檢測過程中只產生分析物信號。
逐步分辨方法涉及一重復過程，在其中，更多的選擇性(結合或洗脫)特性依次加到已知保留分析物的一選擇性條件常數組中。第一步中，測試一系列選擇性條件以鑒定出保留靶分析物的那個。下一步中，挑選該選擇性條件的一種或多種選擇性特性作為以后試驗中的常數組。
產生一組新的選擇性條件。組中各選擇性條件包括選在常數組中的特性和至少一個常數組中沒有的新條件。例如，常數組包括陰離子吸附劑和低鹽洗脫劑，新條件將包括洗脫劑pH改變。分別測試這些新變量提高分析物分辨率的能力，鑒定出提高分辨率的修飾選擇性條件。后一步中，在常數組中加入提高分辨率的新選擇性條件。
以同樣方法，通過產生包括常數組特性和一組新特性的新的選擇性條件組測試修飾常數組。這樣，在每一步，都挑選選擇性條件，使得分析物的分辨率與前一步的選擇性條件相比有所提高。
實施例對該方法進行了詳細的描述。細胞樣品通常包含數以百千計的蛋白質。人們可能希望準確分辨出樣品中的每一種靶蛋白。第一步，用多種選擇性條件建立靶分析物的滯留圖。例如，吸附劑可以是陰離子交換劑，陽離子交換劑，正常相吸附劑和反相吸附劑。在各種吸附劑上測試的洗脫條件可以是不同的pH水平，不同的離子強度，不同的除垢劑條件和不同的疏水性條件。例如，對各種條件，可進行4種不同洗脫條件的測試。這樣，在該實施例中，測試了16種洗脫劑條件吸附靶分析物的能力。
從該滯留圖可以挑選出至少一種靶分析物被保留的選擇性條件。可以挑選靶分析物發生最大結合的選擇性條件。但是，如果該選擇性條件對靶分析物的選擇性比其他選擇性條件更強，則宜選擇靶分析物吸附并非最大的條件。例如，假設滯留圖分析顯示，在中性pH附近，靶分析物被陰離子交換劑保留，但也弱吸附于親水性吸附劑。
從經鑒定保留分析物的選擇性條件中挑選出一種可變吸附劑或洗脫劑，用于所有此后的選擇性條件。在此，它被說成是加到“選擇性條件常數組”中。
在下一次重復中，測試靶分析物在第二組多選擇性條件下的結合能力。第二組中的各選擇性條件包括選擇性條件常數組的元素。但是，各選擇性還包括其他變量一加入選擇性條件的不同吸附劑或洗脫劑。這樣，限于使用至少一組常數，第二組選擇性條件經選擇仍比第一組更多樣。提高多樣性的方法包括，例如，測試某洗脫條件更細的梯級或測試吸附劑的不同強度。還可以包括，例如，在選擇性條件加入其他選擇性特性。
繼續該實施例，可將陰離子交換劑加入常數組中。現在，用改變更大的變量(例如洗脫劑或吸附劑)測試該條件。被測洗脫劑可包含比之第一次重復梯級更細的不同低pH緩沖劑。例如，第一次重復的被測緩沖液是pH3.0，pH5.0，pH7.0和pH9.0，顯示靶分析物在中性pH附近與陰離子交換劑結合。在第二次重復中，測試緩沖液可以是pH5.0，pH5.5，pH6.0，pH6.5，pH7.0，pH7.5和pH8.0。此外，這些緩沖液還可以各自改變成包含其他洗脫特性，例如離子強度，疏水性等。
分析該階段得到的第二滯留圖常能夠鑒定出比第一輪中鑒定出的選擇性條件分辨率更好的條件。同樣，選擇該選擇性條件的一個變量加入選擇性條件常數組，用于下一次重復的分析。
繼續該實施例，假設第二輪中分辨分析物最佳的選擇性條件使用的是pH6.5的緩沖液。現在可將該洗脫劑加入常數組，其中包括陰離子交換樹脂和pH6.5的緩沖液。在下一輪重復中，選擇性條件包含這一常數組和另一變量。這一變量可能是例如在洗脫劑中加入新的組分，例如不同的離子強度；或者，可將另一種吸附劑加入混合物，例如與陰離子交換吸附劑混合的多種疏水性吸附劑；或者，可以改變陰離子交換樹脂的密度。同樣，從這一組中鑒定出提高分析物分辨率的選擇性條件。
該過程可重復至分析物被純化到完全均一。此時，選擇性條件具有對分析物的專一性。可以看出，增加每一步中被測變量的數目可減少鑒定合適的選擇性條件所需的重復次數。
C.制備性純化分析物的方法另一方面，本發明提供純化分析物的方法。該方法利用了滯留層析快速鑒定吸附某分析物的引力基礎的能力。第一步涉及分析物與多種選擇性條件接觸和用滯留層析測定這些條件下的滯留。由此得出分析物的識別特征概況。用分析物被保留的選擇性條件形成制備性純化分析物的方法。
為了制備性純化分析物，可以在通過分析物結合過程所鑒定的吸附劑/洗脫劑條件中吸附和洗脫分析物。這樣，識別圖可能顯示分析物結合正常相吸附劑和金屬螯合劑。然后，分析物與含有結合分析物的正常相吸附劑的第一層析柱接觸。洗去不結合的物質。用足夠嚴格的洗滌洗脫分析物。然后，洗脫劑與金屬螯合劑柱接觸以結合分析物。洗去不結合的物質。然后，從金屬螯合劑柱上洗脫包括分析物在內的被結合物質。用這種方法分離出制備量的分析物。制備量的樣品至少為10μl，100μl，1ml或10ml。
逐步分辨分析物過程中得到的信息可用來設計大規模的蛋白質純化層析(基于洗脫)。對靶分析物蛋白質的吸附劑引力基礎，結合條件和洗脫條件(即選擇性條件)變成由滯留層析來確定。這一信息可節省目前所用的試差法設計純化方法所浪費的大量時間、能量和昂貴的分析物。這一部分內容還用市售的吸附劑進行了大規模的純化。
D.特異性檢測分析物的探針的制備方法本發明提供用解吸質譜法特異性檢測一種或多種分析物的探針和制備這些探針的方法。這類分析物分辨探針可用在診斷和分析方法中特異性檢測分析物。
制備分辨一種或多種分析物的探針的方法中，第一步是制作分析物在多種不同吸附劑/洗脫劑組合下的滯留圖。例如，可以用全部5種不同洗脫劑洗滌4種吸附劑來測定分析物的分辨情況。這為每種分析物提供了20組滯留數據。對所得滯留圖的分析將指明哪一種或哪一些選擇性條件分辨分析物最佳。更好的是，可以鑒定出準確分辨所有分析物的一種選擇性條件。然后，選取一種或多種選擇性條件用在分辨探針中，使得每種分析物在至少一個吸附劑位點上被分辨。探針還可以包含不結合分析物的吸附劑。這一吸附劑位點被用作對照。挑選具有多個可定址位置吸附劑位點的探針，要求它們具有保留和分辨分析物的能力。此時，選擇能夠在單一洗脫條件下結合分析物的吸附劑。這是有用的，因為在檢測過程中可用一種洗脫劑洗滌整個探針。
得出的特定分析物的滯留圖可用來創制該分析物的定制吸附劑。例如，一種分析物被多種吸附劑保留顯示該分析物的一組引力基礎。可通過制備包括提供引力基礎的吸附劑要素的復合吸附劑來設計定制吸附劑。這樣的定制吸附劑對靶分析物很專一。可能一種或數種定制吸附劑就足以產生分析物的識別圖。例如，若發現，在特定的洗脫條件下，分析物被結合具有一定程度疏水性、正電性和芳香性的物質的吸附劑所保留，就可以通過設計或使用組合性合成法創制具有吸引全部上述三個特征的官能團的定制吸附劑。檢測與這種吸附劑的結合就可鑒定出分析物。
這類探針可用來檢測樣品中的一種或多種分析物。樣品接觸選擇性條件，用解吸質譜法檢測探針。因為探針分辨分析物，分析物的存在可通過查看特征識別概況來測定。這類探針尤其適用于鑒定某患者樣品中的一組診斷標記。
實施例之一中，設計排列來固定特定類型的蛋白質，包括診斷標記以及由功能所確定的分析物。例如，制備能特異性固定細胞表面蛋白，某種類型酶(如激酶)，轉錄因子，細胞內受體等的排列。該吸附劑可能對生物聚合物(例如抗體)有特異性。
實施例之一中，吸附劑是基因組件，例如展示一類蛋白的蛋白質配體的噬菌體。此時，可用一類分子預篩選噬菌體展示文庫，去除與該類分子結合的噬菌體，然后用從中扣除的噬菌體作為吸附劑。
E.診斷探針和診斷方法診斷病理情況一般涉及檢測患者樣品中疾病的一種或多種分子標記。某些病癥可以因存在一種診斷標記而得以診斷。其它病癥的診斷可能涉及檢測多個診斷標記。而且，檢測多個診斷標記可提高診斷的可靠性。所以，本發明提供了用于解吸質譜法的探針，它具有至少一種分辨病理情況的至少一種診斷標記的吸附劑。
制備這類探針包括，首先，選擇待測標記。這可以是任意疾病的標記，例如癌癥，心臟病，自身免疫病，病毒感染，早老性癡呆(Alzheimer氏癥)或糖尿病。例如，前列腺特異性抗原(PSA)檢測很能說明是否前列腺癌。HIV感染可通過檢測數種HIV蛋白的抗體來診斷，例如p17、p24或p55之一和p31、p51或p66之一和gp41或gp120/160之一的抗體。腦髓液中檢測淀粉樣蛋白-β42和tau蛋白很能說明是否早老性癡呆。而且，可用本發明方法檢測分析物在健康者和病者內存在的差異來鑒定上述標記。
下一步，產生保留一種或多種診斷標記的吸附劑。較好的是，制備一種分辨所有分析物的吸附劑。這可以通過創建一個包含數種抗體的位點來實現，所述抗體各自結合所需標記之一。或者，探針可具有多個吸附劑位點，各自能夠在一種選擇性條件下分辨至少一種分析物。實施例之一中，吸附劑是復合吸附劑，包含多種標記的特異性配體。例如，吸附劑可包含特異性結合靶分析物的抗體、多肽配體或聚核苷酸。實施例之一中，抗體是篩選組合文庫鑒定得到的單鏈抗體。可通過本發明中所述的方法篩選噬菌體展示文庫來創制特定標記的特異性單鏈抗體。
另一實施例中，吸附劑具有非有機生物分子組分，它們或者特異性保留靶分析物，或者以足夠的特異性保留分析物，供解吸質譜法進行準確分辨。本發明也說明了制備檢測特異性分析物的吸附劑的方法。
顯然，這類方法中的單個吸附劑位點不必是單一分析物特異性的，所以，不要求生物聚合物介導的靶分析物與吸附劑之間的特異性親合。在此之前的親合性檢測方法主要依賴于生物聚合物與靶分析物之間的特異性結合。這包括，例如抗體與蛋白質，互補聚核苷酸之間或凝集素與糖的的特異性親合。這些特異性是必需的，因為那些檢測方法是間接的鑒定的不是靶分析物，而是通常結合于吸附劑的標記。所以，吸附劑的特異性越高，雜質結合吸附劑干擾特異性檢測的可能性就越小。但是，解吸譜法直接檢測分析物。所以，雜質的存在不干擾特異性檢測，除非雜質信號與靶信號重合。
診斷方法包括，首先，選擇待測的患者樣品。樣品可以是例如組織、血液、尿液、糞便或其他體液(淋巴液、腦髓液、關節內滑液等)。然后，樣品與含有診斷吸附劑的基質在允許診斷標記滯留的條件下接觸。用合適的洗脫劑洗滌吸附劑。然后用解吸譜法(例如質譜法)檢測(例如分辨)標記。
本發明還提供了特異性檢測診斷標記的試劑盒，它具有(1)用在解吸譜法中的基質，具有至少一個可定址位置內的至少一種吸附劑，該吸附劑在至少一種包括吸附劑和洗脫劑的選擇性條件下分辨至少一種診斷標記；和(2)洗脫劑或制備洗脫劑的說明書。在樣品與吸附劑接觸并用洗脫劑洗滌后，即經歷了選擇性條件后，分析物被充分純化或被特異性結合，供解吸譜法分辨。
F.鑒定蛋白質的方法另一方面，本發明提供了一種協助鑒定蛋白質的方法。該方法涉及用滯留層析法測定蛋白質分析物理化特征的匹配參數和檢索蛋白質數據庫以鑒定出具有匹配參數的蛋白質。由基于滯留特性的信息得出理化特性的方法已在前文說明過。數據庫一般提供各蛋白質的氨基酸序列和/或編碼氨基酸序列的核苷酸序列。由這些信息可方便地得出諸如分子量、疏水性、pI、片段質量等結構特征。分析物蛋白質將只與數據庫中一個子集的蛋白質具有相同的特定結構特征。所以，根據與分析物蛋白質相同的結構特征將蛋白質分類，就能夠找到候選特征。這樣，就鑒定參比物一種或多種理化特性固有的準確性、特異性程度或可靠性程度來看，數據庫中的蛋白質與參比物的所有特征不可能完全吻合。所以，可以設定匹配參數來鑒定例如蛋白分析物特征與數據庫中參比多肽特征的近似程度。
隨著鑒定基因組中基因的增多，蛋白分析物在數據庫中成為參比多肽的機會也隨之增加。所以，該方法能夠迅速分辨樣品中感興趣的蛋白質，得到該蛋白質的結構信息，然后用這種信息鑒定蛋白質。
G.組裝多聚分子的方法吸附劑固定所需分子的能力可用來構件多聚分子和評價影響其組建的化合物。多聚分子的一個單元與吸附劑結合。然后接觸含有多聚分子其他單元的樣品。接觸可以在多種條件下進行以測定結合參數。可用解吸譜法來監測亞基與多聚物的結合。然后，可用相同的方法測試下一亞基的結合。可用本發明所述的藥物篩選法來測試試劑干擾這種組裝的能力。所以，過程中某一階段的分析物在下一階段變成吸附劑。
H.進行酶試驗的方法本發明還提供了進行酶試驗的方法。酶試驗通常包括在酶呈活性的條件下將待測樣品與酶底物接觸。任酶作用于底物后，檢測酶反應的產物。在定量試驗中，測定的是產物量。通常將該量與對照或標準曲線比較，得出樣品中酶活的量。
本發明提供了檢測樣品中一種酶的方法，包括檢測酶活的量。該方法利用了這一事實，即，酶活性通常產生質量與原底物不同的產物。在該方法中，制備含有結合底物的吸附劑的固相。一定量的底物與吸附劑結合。然后，吸附劑在一定條件下與樣品接觸一段時間，讓酶作用于底物。然后，用解吸譜法檢測被結合的物質。檢測具有酶活產物分子量特征的分析物可說明酶的存在。信號強度將與樣品中酶活量相關聯。
I.鑒定生物材料間差異表達的分析物的方法本發明的另一方面內容提供了鑒定在兩種或兩種以上樣品中差異表達的有機生物分子，特別是蛋白質的方法。“差異表達”指兩樣品間分析物量或質上的差異。這些差異可能緣于蛋白質表達的任一階段，即從轉錄到翻譯后修飾。該方法利用了滯留層析的超常分辨能力和靈敏度。首先，使用同一組選擇性條件制備來自兩種生物樣品的分析物的識別概況圖。所用選擇性條件越多，樣品中分析物的分辨率越高，所以，可比較的分析物數量也越多。然后，比較識別圖以鑒定被兩組吸附劑差異保留的分析物。差異滯留包括定量滯留。這提示表達的正調控或負調控。差異滯留還包括分析物質的差異。例如，蛋白質翻譯后修飾的不同會造成識別圖的不同，檢測時表現為結合特性差異(例如，如果蛋白質被糖基化則與凝集素結合將不同)或質量差異(例如翻譯后切割的不同)。這種分析也可以用可編程計算機進行。
該方法特別適用于檢測兩種細胞差異表達的基因。兩種細胞可以是正常細胞和病理細胞例如癌細胞，或不同水平的細胞，或不同發育或分化階段的細胞，或細胞周期內不同部分的細胞。但是，該方法也可用來檢測不同條件下的兩同種細胞。在這樣的方法中，一份生物樣品與測試試劑接觸，另一份不接觸。然后，比較兩者的滯留圖。根據滯留特性或質量的不同，該方法可以顯示蛋白質或其他生物分子表達的增加或減少，或發生了某種改變。
利用由滯留圖獲得的差異表達蛋白質理化特性信息，用本發明方法可測定蛋白質的候選特征。
本方法適用于鑒定疾病的診斷標記。與正常樣品或細胞相比，患者樣品或病理培養細胞中差異表達的蛋白質可能就是診斷標記。一般，最好將來自具有統計意義的患者群的樣品與正常樣品比較。這樣，可將信息集合起來鑒定出對于表現出疾病的所有個體或大多數個體來說共同的診斷標記。
I.通過分解代謝信號擴增提高靈敏度將大蛋白分裂成小片段然后檢測這些小片段能夠顯著提高檢測大蛋白在復雜混合物中差異存在(例如，因為差異表達)的靈敏度。靈敏度的提高有幾個原因。首先，當樣品中所有蛋白都被(例如)酶解而片段化時，大蛋白可能產生更多片段而不是小蛋白。其次，解吸譜法的整體靈敏度在低分子量時高于高分子量時。第三，蛋白片段化增加了來自靶分析物的信號數量，因此提高了測得靶分析物的可能性。第四，蛋白片段化提高了捕獲可能性，因此提高了測得蛋白至少一種片段的可能性。第五，如果蛋白質在兩種樣品中差異存在，那么通過增加來自該蛋白的信號數量，量的差異更可能被測得。
而且，該方法是反直觀的。通常，人們希望在分析前降低分析物混合物的復雜性。片段化卻提高了這種復雜性。
所以，在本發明實施例之一中，在檢測前將分析物轉化為低分子量片段提高了檢測靈敏度。片段化可以用本領域已知方法進行。例如，可用內切蛋白酶將蛋白分析物片段化。可用糖苷酶將糖分析物片段化。可用內切核酸酶將核酸片段化。樣品的片段化可在用吸附劑固定之前或之后進行。
J.鑒定受體的配體的方法生物系統的功能性路徑常涉及受體與配體間的相互作用。例如，轉錄激活中的結合常涉及在此之前配體與某轉錄因子的結合。許多病理情況與受體與其配體間異常的相互作用有關。阻斷受體與配體間的相互作用常是藥物開發的目的之一。但是，某受體的配體的特征經常是未知的；受體是“孤兒”受體。
本發明提供了一種用滯留層析來鑒定受體的配體的方法。該方法涉及將受體固定于吸附劑。然后，可能含有該受體配體的樣品在適合受體與配體間結合的洗脫條件下與固定化受體接觸。然后，用解吸譜法檢測與受體結合的配體。該方法能夠利用解吸譜法的靈敏度來檢測固定于吸附劑的少量物質。
將受體固定于吸附劑需要鑒定一種保留，最好是特異性結合受體的吸附劑。本發明已經描述了鑒定特異性結合蛋白質的吸附劑的方法。在方法之一中，吸附劑含有該受體的特異性抗體。另一實施例中，受體是生產出的融合蛋白，具有一個特異性結合部分。例如，受體可與抗體的Fc部分融合。Fc部分可與蛋白A結合，后者可摻入吸附劑中。
由操作者考慮用來檢測是否存在某配體的樣品。例如，如果受體是核受體，則樣品可以是核提取物。如果受體是細胞質受體，則樣品可以是細胞質提取物。如果受體是細胞表面受體，則樣品可以是來自細胞所接觸表面的液體，例如用于上皮細胞表面受體的血清。
樣品一般與受體在生理條件下培育足夠的時間以允許結合，例如37℃數小時。然后，洗去不結合的物質。該方法能夠迅速鑒定出常規技術需數月鑒定的配體。
滯留層析允許并行處理數個吸附劑位點上的樣品。所以，該方法可能涉及檢測多種樣品中是否存在某配體，以及在多種培育和洗脫條件下測試一種樣品。
通過測定鑒定到的配體的質量和各種理化特性，用基因組數據庫中的信息能夠正確鑒定配體。
本發明另一實施例中制備了一組探針，它們已經接觸過并固定了某細胞中的蛋白質。這種探針本身可以用作第二探針來鑒定細胞中與固定化分子結合的分子。在由探針制備滯留圖后，探針再與測試物質接觸，條件嚴謹性一般低于制備第二探針時的條件，分析可定址位置。新結合探針的分子即結合已固定分子的那些。
K.藥物開發方法鑒定干擾受體與配體間結合的分子是藥物品開發中的重要步驟。本發明提供了篩選化合物調節吸附劑與分析物(例如受體吸附劑和配體分析物)之間結合能力的方法，這是通過將吸附劑和分析物與測試化合物接觸，用解吸譜法檢測吸附劑與分析物之間的結合。
迅速篩選組合文庫以找出候選藥物要求能使靶分子受數以千計藥物的作用，并鑒定出干擾或促進該作用的藥物。滯留層析能夠將配體/受體對的成員之一固定到基質上作為第二吸附劑。然后，在該成員接觸其伴侶和藥物后，可用解吸譜法測定伴侶是否結合以及結合程度。滯留層析篩選分子的優點包括能夠通過吸附劑將受體特異性固定于基質，能夠將受體迅速布置在許多吸附劑位點以進行并行處理，和因為通過解吸譜法讀結果而加速完成。
1.篩選試驗該方法包括提供一種吸附劑；在有和沒有藥物存在下，在一種或多種選擇性條件下，將吸附劑與靶分析物接觸；測定有和沒有藥物存在下的結合量。結合量是用解吸譜法測定的(例如通過制作識別圖)。實驗中有不加藥物的對照，或加有不同量或不同種藥物的對照，用外推法確定零點量。結合量上的統計學顯著差異(p＜0.05)說明測試藥物調節結合。
該方法特別適用于篩選作為靶候選藥物的分析物(例如蛋白質)。在由血清或其他種類靶細胞形成蛋白滯留圖或識別圖后，藥物與滯留分析物陣列在它們的可定址位置上接觸。結合后，洗脫或洗去不結合的藥物。用解吸質譜法直接鑒定特定選擇性條件下保留被結合藥物的那些分析物，因為藥物本身表現為滯留圖上的新組分(即，解吸藥物并直接檢測)。該方法尤其適用于篩選候選藥物(包括活化劑和拮抗劑)結合分析物或調節一種或多種生物過程的能力。
2.受體與配體吸附劑與靶分析物不必發生特異性結合。但是，在特別有用的方法中，吸附劑和靶分析物是配體/受體對。
實施例之一中，配體/受體對是激素和細胞表面受體或胞內受體。吸附劑可以是完整細胞，或者，如果是細胞膜結合受體則可以是細胞膜。可用蛋白受體或其他靶候選藥物作用吸附劑篩選組合物藥物文庫。可將數百種或數千種藥物作用于一種受體或可定址位置。在去除不結合或弱結合的候選藥物后，檢測結合的藥物并用解吸譜法鑒定。
另一實施例中，吸附劑是結合并修飾靶底物的酶。篩選藥物酶轉化分析物的能力。例如，可以檢測酶活，因為分析物的識別圖將因為酶活而不同于產物。差異滯留說明藥物改變結合。
受體/配體可以多種方式滯留在基質上。方法之一中，受體/配體被非特異性吸附劑直接滯留。另一方法中，吸附劑是受體/配體特異性的。例如，吸附劑可含有對受體/配體的特異性抗體。受體/配體可以是融合蛋白，其中的融合部分特異性結合吸附劑，例如，Fc片段結合蛋白A。一方法中，表面具有特異性結合受體/配體的多肽的基因組件，例如噬菌體展示文庫中的一個噬菌體，與基質結合。該配體被多肽捕獲。而且，吸附劑可以是已經固定在基質上的分析物，即，它可以是第二吸附劑、第三吸附劑等。
本發明提供了特別適用于評價藥物(或其他物質)結合靶分析物后直接和間接效果的方法。在由一種靶細胞的蛋白質得出的滯留圖上鑒定一種或多種分析物會因物質(例如候選藥物)的以下作用而改變1)對結合靶分析物的蛋白質本身的作用，2)對其他分析物(非藥物結合蛋白)的作用，或3)對基因表達的作用(正調或負調)。是滯留層析的高分辨率和高信息性檢測出了這些改變即，藥物誘導了基因滯留圖或識別圖在有和沒有藥物時的差異，使得該方法成為用于蛋白質、功能性基因組、藥物開發、治療藥物檢測和臨床診斷最有效的方法之一。
3.測試藥物將有待篩選其調節凝血酶原(prothymosin)表達的能力的測試藥物給予受試動物或體外培養的細胞。待檢藥物的選擇由醫師的處方決定。但是，考慮到藥物多樣性和給藥方便，優選小分子作為測試藥物。
a.化學待測藥物可選自多種來源。例如，可得到分子的組合文庫用于篩選。用這類文庫可篩選數千分子的調控活性。一優選實施例中，高處理量的篩選方法涉及提供一個包含大量潛在治療性化合物(候選化合物)的文庫。然后，如本發明所述，在一個或多個試驗中篩選這樣的“組合化學文庫”，鑒定表現出所需特征活性的成員(特定種類或亞類的化學物質)。由此鑒定出的化合物可作為常規“引導”化合物，或其本身就可用作潛在或實際治療藥。
制備和篩選組合化學文庫是本領域熟練技術人員所熟知的。這類組合化學文庫包括但不限于肽文庫(參見美國專利5,010,175，Furka(1991)Int.J.Pept.Prot.Res.，37487-493，Houghton等(1991)Nature，35484-88)。肽合成絕不是本發明唯一考慮和準備使用的方法。產生化學多樣性文庫的其它化學機制也可以使用。這些機制包括但不限于類肽(peptoid)(PCT公開WO91/19735，1991年12月26日)，編碼的肽((PCT公開WO93/20242，1993年10月14日)，隨機生物寡聚物(PCT公開WO92/00091，1992年1月9日)，苯并二吖庚因(美國專利5,288,514)，乙內酰脲、苯并二吖庚因和二肽之類diversomer(Hobbs等，(1993)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 906909-6913)，插烯類(vinylogous)多肽(Hagihara等，(1992)J.Amer.Chem.Soc.1149217-9218)，具有β-D-葡萄糖骨架的非肽類擬肽(Hirschmann等，(1992)J.Amer.Chem.Soc.1149217-9218)，小化合物文庫的同類有機合成(Chen等，(1993)J.Amer.Chem.Soc.，1162661)，寡聚氨基甲酸酯(Cho等，(1993)Science2611303)，和/或磷酸肽酯(Campell等(1994)J.Org.Chem.59658)。一般參見，Gordon等，(1994)J.Med.Chem.371385，核酸文庫，肽核酸文庫(參見美國專利5,539,083)，抗體文庫(參見，Vaughn等，(1996)Nature Biotechnology，14(3)309-314)，和PCT/US96/10287)，糖文庫(參見，Liang等(1996)Science 2741520-1522，和美國專利5,593,853)，和小有機分子文庫(參見，苯并二吖庚因，Baum(1993)C&EN，Jan 18，p.33，異戊二烯化合物，美國專利5,569,588，噻唑烷酮(thiazolidinone)和間噻嗪烷酮(metathiazanone)，美國專利5,549,974，吡咯烷酮，美國專利5,525,735和5,519,134，嗎啉化合物，美國專利5,506,337，苯并二吖庚因，5,288,514，等)。
制備組合文庫的設備可以購買(參見，375MPS，390MPS，Advanced Chem Tech，Louisville KY，Symphony，Rainin，Woburn，MA，433A Applied Biosystems，FosterCity，CA，9050 Plus，Millipore，Bedford，MA)。
L.產生特異性結合分析物的制劑的方法本發明提供了產生特異性結合靶分析物的制劑(例如單鏈抗體)的方法。這些制劑可用作特異性診斷試劑在配體/受體相互作用研究中用于固定靶分析物。該方法特別適用于產生只可能分離到少量的針對靶分析物的物質，通過免疫動物來獲取它們是不可能或不可行的。該方法涉及提供附著有靶分析物的基質；提供展示待篩選物質的基因組件展示文庫；將文庫與靶分析物接觸，通過與靶分析物的反應選擇性保留基因組件；和用解吸譜法檢測滯留的基因組件。
可以對復雜樣群中的大量候選吸附劑-分析物并行進行以上步驟，沒有分開選擇和檢測過程中的轉移損耗和混淆，這些步驟包括間接檢測方法中的離線擴增和標記。
1.提供基質該方法的第一步是提供包含吸附劑的基質，該吸附劑是待篩選文庫中某多肽的作用靶。實施例之一中，提供的基質具有已經附著的靶吸附劑。另一實施例中，基質的提供是提供具有結合靶分析物的吸附劑的基質，在使得分析物滯留的洗脫條件下將吸附劑與分析物接觸，將靶吸附劑用作展示文庫的目標。實施例之一中，目標在進行比較的兩種細胞內差異表達。例如，目標可以來自差異表達的mRNA或者可以是差異表達的多肽。前文已經說明了用滯留層析鑒定這種差異表達的蛋白的方法。
差異表達的蛋白一旦得以鑒定，就可以形成準確分辨分析物的選擇性條件。更好的是，分析物的滯留是特異性或唯一性的。前文中逐步分辨分析物的方法能夠鑒定出特異性結合復雜樣品中某靶分析物的選擇性條件。實施例之一中，結合的靶分子可能被修飾，例如被酶修飾。
或者，該方法可以從mRNA或EST階段開始。這種方法中，用常規方法鑒定差異表達的mRNA或EST。然后，體外和在吸附劑上原位轉錄和翻譯這些分子以供固定。例如，制備具有許多吸附劑位點的用于解吸譜法的基質。基質上置一根試管，由它形成一格，吸附劑位于格底。在該格中加入用于體外轉錄和翻譯差異表達的mRNA的試劑(一般是cDNA的形式)。(有關方法參見，Sambrook等，Molecular Cloning-A Laboratory Mannual，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1989)和Current Protocools in Molecular Biology，F.M.Ausubel等編輯，(Current Protocools是Green Publishing Association Inc.和John Wiley &Sons，Inc.的聯合企業))。mRNA或EST的翻譯產生了被吸附的多肽。移去試管，用洗脫劑洗滌吸附劑位點，鑒定保留多肽分析物的選擇性條件。
2.提供展示文庫第二步是提供展示文庫。展示文庫由在表面展示各種肽組合文庫(多肽)的基因組件組成。但較好的是單鏈抗體，因為它們能夠用于以后的免疫試驗。
本領域已知多種展示文庫及其用途。展示方法的一個基本概念是建立待選多肽配體與編碼多肽的可回收聚核苷酸之間的物理聯系。這種物理聯系是由多聚分子復合物提供的，在這里是基因組件，例如噬菌體顆粒，它展示作為衣殼組成部分的多肽，衣殼內包含編碼多肽的噬菌體基因組。建立多肽與其基因材料之間的物理聯系允許對帶有不同多肽的大量基因組件同時進行質量篩選。展示的多肽對靶分子具有親合性的基因組件與靶分子結合，并通過與靶分子的親合性篩選富集這些基因組件。可根據對應的基因組來鑒定這些基因組件所展示的多肽的特征。用這些方法，然后可以用常規方法大量合成經鑒定與所需分析物具有結合親合性的多肽。
展示文庫最常用的基因組件是噬菌體，尤其是絲狀噬菌體，特別是噬菌體M13、Fd和F1。大多數工作將編碼待展示多肽的文庫插入這些噬菌體的gIII或gVIII形成融合蛋白。參見Dower，WO91/19818；Devlin，WO91/18989；MacCafferty，WO92/01047(基因III)；Huse，WO92/06204；Kang，WO92/18619(基因VIII)。還可參見Cwirla等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，6378-6382(1990)；Devlin等，Science249，404-406(1990)，Scott & Smith，Science 249，386-388(1990)；Ladner等的U.S.5,223,409和Ladner等的U.S.5,571,698。這樣的融合蛋白具有一段通常來自分泌蛋白而不是噬菌體包被蛋白的信號序列，待展示多肽和基因III或基因VIII的蛋白或其片段。常將外源編碼序列插入基因III或基因VIII的N末端或附近，但也可以插入在其它插入位置。有些絲狀噬菌體載體經基因工程改造而產生了基因III或基因VIII的第二拷貝。這類載體中，外源序列只插入在兩拷貝之一中。其它拷貝的表達有效地稀釋了噬菌體內的融合蛋白，這對減少針對多肽(對噬菌體生長有害)的選擇操作是有利的。在感染細菌的病毒(噬菌體)表面展示抗體片段可以產生具有多種親合性和動力學特征的人sFv。
在另一種改變形式中，將外源多肽序列克隆入編碼噬菌體包被蛋白和噬菌體包裝序列但不能復制的噬菌粒中。將噬菌粒轉染到細胞內，通過輔助噬菌體感染進行包裝。用噬菌粒的效果還在于稀釋了融合蛋白，該融合蛋白由包被蛋白和展示的帶有輔助噬菌體表達的包被蛋白的野生型拷貝的多肽形成。參見Garrard，WO92/09690。
可以類似的方法用真核病毒展示多肽。例如，Han等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，9747-9751(1995)中報道了與Moliney小鼠白血病病毒的gp70融合的人heregulin。孢子也可以用作可復制的基因組件。此時，多肽由孢子的外表面展示。例如，據報道可用枯草桿菌孢子。這些孢子的包被蛋白的序列參見Donovan等，J.Mol.Biol.196，1-10(1987)。
也可用細胞作為可復制基因組件。展示多肽被插入在編碼細胞表面蛋白的基因。細菌細胞包括鼠傷寒沙門氏菌，枯草桿菌，綠膿桿菌，霍亂弧菌，肺炎克雷伯氏桿菌，淋病奈瑟氏菌，腦膜炎奈瑟氏菌，結節狀類桿菌(Bacteroides nodosus)，牛莫拉氏菌，和優選的大腸桿菌。有關外表面蛋白的細節參見Lander等，美國專利5,571,698和Georgiou等，NatureBiotechnology 1529-34(1997)和其中的參考文獻。例如，合適的有大腸桿菌的λ蛋白。
3.篩選展示文庫第三步是篩選展示文庫，鑒定特異性結合靶分子的配體。在適合多肽與靶分子特異性結合的洗脫條件下讓帶有靶分子的基質與展示文庫接觸。具有靶分子識別物質的基因組件與已經附著在基質上的靶分子結合。與洗脫條件接觸后去除了沒有結合的粒子，保留了結合的粒子。
在基質上引入每mL含約1011噬斑形成單位的基因組件群(在這里是M13噬菌體)，基質具有結合靶吸附劑(例如蛋白質)的可定址陣列。接觸后，選出對靶吸附劑(即選擇性閾值修飾劑或洗脫劑)來說的最適選擇性條件，以便只選擇性保留全部噬菌體基因型中的一個小子集，最好少于5-10個。注意，通過接觸干擾除最具選擇性的分析物-靶吸附劑相互作用之外所有其他相互作用的洗脫劑，去除不結合靶吸附劑(即不與靶吸附劑結合的噬菌體)或結合松散的噬菌體。展示與靶吸附劑具有最高親合性的多肽的噬菌體被選擇性保留。
4.檢測含有特異性結合靶分子的物質的基因組件第四步中，用解吸譜法檢測基因組件(M13噬菌體)與靶分子的結合。例如，M13噬菌體具有一種包被蛋白的數千拷貝。在解吸譜法中，用激光撞擊噬菌體，包被蛋白于是被釋放而可以被測得。這樣可以測定文庫是否包含具有靶分子結合物質的噬菌體。為了獲得用于以后分析的基因組件，篩選步驟可在探針上多個不同位置同時進行，或者，可使基質足夠大使激光不至于釋放所有結合于表面的基因組件。該方法特別有效，因為少量噬菌體與分析物結合也能被測得。
以M13為例，較好的檢測方法是用解吸譜法監測作為“標記”蛋白信號的基因gIII包被蛋白的出現。用這種方式，我們已經測得了結合少至5個噬菌體顆粒(pfu)的“陽性”靶吸附劑(噬菌體顆粒數量是根據已知稀釋度估算的)。其它噬菌體標記依照優先次序包括基因V，基因X和基因III(包括它們的融合產物)。
檢測了最高親合性吸附劑的位置(即接觸高選擇性條件后陣列內保留噬菌體最少的位置)后，就可將結合的基因組件作為跳離點用于其它用途。
5.分離基因組件實施例之一中，該方法還涉及分離基因組件供以后分析。這種分析可能涉及復制基因組件和從中分離聚核苷酸。可用常規方法復制分離后的噬菌體。例如，可讓滯留的噬菌體與生物擴增載體例如大腸桿菌接觸，加入營養培養基令基因組件生長，以供以后分析。可進一步檢測單個集落結合滯留于基質的分析物的能力。
6.編碼多肽的核苷酸序列的測序對結合基因組件中編碼多肽的核苷酸序列測序，提供了用于生產多肽的信息。測序包括從吸附劑上分離基因組件，復制，分離聚核苷酸和用現有方法測定核苷酸序列。另一方法中，將基質與合適的物質(例如會被基因組件感染的細胞)接觸可原位復制該基因組件。另一實施例中，測序原位進行。該方法包括裂解基因組件，用已知方法(例如PCR)擴增核苷酸序列。可能有幾個不同的基因組件與表面上不同的表位結合。此時，可以改變洗脫條件使得只有一種噬菌體與一種表位結合。
7.生產多肽有價值的下一步是生產多肽。分離后的多肽可用作吸附劑在診斷中特異性檢測靶分子或用于研究配體/受體相互作用。
方法之一中，生產多肽涉及首先進行編碼多肽的核苷酸序列測序。氨基酸序列衍生自該核苷酸。可用上述方法測序。序列是重組法或化學合成多肽的基礎。
另一方法中，多肽可通過復制基因組件來生產。這在基因組件包含多肽的多份拷貝時特別有效。基因組件可在原位分離或復制。
一種重組法生產多肽的方法可如下進行。用所述的方法測序或分離編碼多肽的核苷酸序列。然后，將核苷酸序列包含在表達載體中。表達載體含有與編碼多肽的核苷酸序列操作性連接的調控序列。然后用本領域熟知的方法，用表達載體重組表達多肽。
已知，靶分子具有一個或多個表位。所以，該方法能夠生產對靶分子具有特異性的一種以上多肽。
然后可將靶特異性多肽作為探針的吸附劑用于臨床診斷或藥物開發。即，因為這樣的探針表面具有特異性結合靶分子的多肽，它們可用來從復雜的混合物(例如生物樣品)中分離靶分子，和用解吸譜法檢測靶分子。而且，因為多肽與靶分子間的相互作用可能是生物特異性的，所以很可能所涉及的兩者間的親合性比用前述逐步分辨法獲得的吸附劑更高。
8.分離靶分子的肽表位在一種形式中，該方法允許分離靶分析物上的肽表位。該方法采用類“抗獨特型”法。概括地說，用(例如)噬菌體展示文庫篩選靶分析物的表位。分離后的噬菌體含有例如識別分析物上表位的單鏈抗體。接著，用這些噬菌體篩選第二展示文庫。第二展示文庫中結合第一文庫中單鏈抗體的噬菌體含有展示的多肽，它們具有與單鏈抗體所識別的表位相似的結構。
這種方法的實施例之一中，用編碼一種結合靶分析物的多肽的核苷酸序列產生M13噬菌體，多肽在其中展示為與基因VIII的融合體。這樣，該噬菌體的外表面上具有靶多肽的數百份拷貝。然后將該噬菌體固定在基質上。固定可通過例如結合基因III的配體實現，或者可將基因III修飾成具有基質表面配體的受體。然后，該噬菌體與第二展示文庫接觸。如前所述檢測文庫中結合固定噬菌體的基因組件并分離。較好的是，第二展示文庫具有某種質量標記，使得它們的基因VIII蛋白能夠與固定于基質的噬菌體的基因VIII的相區別。這樣，某物質是“靶分析物”還是吸附劑取決于是否用結合的吸附劑再結合其它物質。可以看出，可以繼續將物質與已固定的物質結合，就象鑒定分離最終結合物質的選擇性條件的方法一樣。
實施例以下實施例用于說明而非限定。
以下實施例中，使用的以下產品和術語。雞蛋白溶菌酶(1μl稀釋成10pmol/μl水溶液)，購自Sigma Chemical Company，St.Louis，MO。“人血清”指1μl血清在pH7.0，0.5M NaCl的20mM磷酸鈉緩沖液中的1至5倍稀釋液。
本發明中，“mg”表示毫克；“ml”表示毫升；“μl”表示微升；“cm”表示厘米；“nm”表示納米；“M”表示摩爾濃度；“mM”表示毫摩爾濃度；“min”表示分鐘；“％”表示重量百分比，除非另作說明；“NaCl”表示氯化鈉；“TFA”表示三氟乙酸。I.滯留層析方案以下方案是進行滯留層析的實施例。
A.制作滯留圖的方案(用層析系列陣列)1.樣品處理將生物樣品稀釋在0.01％的Triton X100 HEPES溶液或磷酸鈉溶液中，pH7.2。視需要離心澄清樣品。
2.上樣將樣品點樣在陰離子，正常相或TED-Cu(II)吸附劑陣列的一個位點上。如果是疏水性吸附劑陣列，事先用0.5μl含0.5％TFA的乙腈潤濕各位點。在乙腈干燥前將樣品加到該位點。任樣品在位點上濃縮(幾乎變干)。
3.洗滌a.陰離子吸附劑陣列位點1，用pH7.2的20mM HEPES或磷酸鈉洗滌。在樣品完全干燥前將第一份2μl洗滌溶液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留15秒。用移液管吸進吸出10次。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份2μl洗滌溶液重復以上步驟。位點2，用NaCl在20mM磷酸鈉中所成的0.2M、pH7.2溶液如上洗滌。位點3，用NaCl在20mM磷酸鈉中所成的1M、pH7.2溶液如上洗滌。位點4，用20mM、pH8.5 TrisHCl如上洗滌。位點5，用0.1M、pH4.5乙酸鈉如上洗滌。位點6，用Triton X100在20Mm HEPES或磷酸鈉中所成的0.05％、pH7.2溶液如上洗滌。位點7，用尿素在20Mm HEPES或磷酸鈉中所成的3M、pH7.2溶液如上洗滌。位點8，用10％的乙腈水溶液如上洗滌。用水徹底洗滌整個陣列。自然干燥芯片。加0.3μl吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸制備的標準溶液)。自然干燥芯片。用激光解吸/離子化飛行時間質譜儀分析滯留于各位點的蛋白質。
b.正常相吸附劑陣列位點1，用pH7的5mM HEPES洗滌。在樣品完全干燥前將第一份2μl洗滌溶液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留15秒。用移液管吸進吸出10次。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份2μl洗滌溶液重復以上步驟。位點2，用20mM磷酸鈉，0.15M NaCl，pH7.2，如上洗滌。位點3，用20mM磷酸鈉，0.5M NaCl，pH7.2，如上洗滌。位點4，用0.1M乙酸鈉，pH4.0如上洗滌。位點5，用Triton X100在20Mm磷酸鈉中所成的0.05％溶液、0.15M NaCl，pH7.2如上洗滌。位點6，用尿素在20Mm磷酸鈉中所成的3M溶液，0.15M NaCl，pH7.2，如上洗滌。位點7，用1％TFA如上洗滌。位點8，用30％的異丙醇∶乙腈(1∶2)水溶液如上洗滌。用水徹底洗滌整個陣列。自然干燥芯片。加0.3μl吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸制備的標準溶液)。自然干燥芯片。用激光解吸/離子化飛行時間質譜儀分析滯留于各位點的蛋白質。
c.TED-Cu(II)吸附劑陣列位點1，用pH7.2，0.5M NaCl，20mM磷酸鈉洗滌。在樣品完全干燥前將第一份2μl洗滌溶液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留15秒。用移液管吸進吸出10次。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份2μl洗滌溶液重復以上步驟。位點2，用咪唑在20mM磷酸鈉所成的20mM溶液，0.5M NaCl，pH7.2，如上洗滌。位點3，用咪唑在20mM磷酸鈉所成的100mM溶液，0.5M NaCl，pH7.2，如上洗滌。位點4，用0.1M乙酸鈉，0.5M NaCl，pH4.0如上洗滌。位點5，用Triton X100在20Mm磷酸鈉中所成的0.05％溶液、0.15M NaCl，pH7.2，如上洗滌。位點6，用尿素在20mM磷酸鈉中所成的3M溶液，0.15M NaCl，pH7.2，如上洗滌。位點7，用1％TFA如上洗滌。位點8，用10％的乙腈水溶液如上洗滌。用水徹底洗滌整個陣列。自然干燥芯片。加0.3μl吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸制備的標準溶液)。自然干燥芯片。用激光解吸/離子化飛行時間質譜儀分析滯留于各位點的蛋白質。
d.疏水性吸附劑陣列位點1，用乙腈在0.1％TFA中所成的5％溶液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份2μl洗滌溶液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留15秒。用移液管吸進吸出10次。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份2μl洗滌溶液重復以上步驟。位點2，用乙腈在0.1％TFA中所成的50％溶液如上洗滌。位點3，用Triton X100在20mM磷酸鈉中所成的0.05％溶液、0.15M NaCl，pH7.2，如上洗滌。位點4，用尿素在20Mm磷酸鈉中所成的3M溶液，0.15M NaCl，pH7.2，如上洗滌。用水徹底洗滌整個陣列。自然干燥芯片。加0.3μl吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸制備的標準溶液)。自然干燥芯片。用激光解吸/離子化飛行時間質譜儀分析滯留于各位點的蛋白質。
B.抗原-抗體試驗；受體-配體試驗的方案(用預先活化的吸附劑陣列)1.抗體在預先活化的吸附劑陣列上的固定將一預先活化的吸附劑陣列置于一潔凈的平整表面上。該陣列上各位點預先用0.5μl異丙醇潤濕，然后將抗體或受體或對照點樣在各位點上(在異丙醇干燥前加1μl抗體/點)。在濕潤的培養箱中孵育(4℃或室溫培養2-18小時)。用移液管去除各點上殘留的溶液。在整個芯片上各殘留活性位點位置加1ml pH7.4的1M乙醇胺PBS溶液進行封閉，并在濕潤的培養箱中孵育(室溫30分鐘)。用1％的Triton X-100 PBS溶液洗滌芯片兩次。在15ml塑料錐形試管中將芯片浸沒在9ml洗滌溶液中，在臺式(benchtop)攪拌儀上振搖至少15分鐘。用NaCl在0.1M乙酸鈉中所成的0.5溶液，pH4.0如前洗滌。用NaCl在0.1M TrisHCl中所成的0.5溶液，pH8.0如前洗滌。用PBS如前所述進行漂洗。然后PBS覆蓋整個芯片，使用前于4℃保存。
2.抗原或配體的結合溫和抖去或粘去芯片上的PBS。在各點加以1-5μl樣品。對于抗原或配體濃度很低的樣品，將吸附劑陣列放入生物處理儀(bioprocessor)中。用200μl PBS兩次洗滌芯片上的各點和生物處理儀的各格。在各格加300μl樣品。用膠帶密封。振蕩孵育(4℃或室溫下1-18小時)。
3.洗滌去除位點上的樣品，用2μl 0.1％的Triton X100 PBS溶液，pH7.2洗滌各格兩次。將第一份2μl洗滌溶液加到位點。洗滌溶液在位點上至少停留15秒。用移液管吸進吸出10次。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份2μl洗滌溶液重復以上步驟。然后用NaCl在0.1M HEPES中所成的0.5M溶液，pH7.4洗滌。用水徹底洗滌整個陣列。
4.滯留蛋白的分析自然干燥芯片。加0.3μl吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸制備的標準溶液)。自然干燥芯片。用激光解吸/離子化飛行時間質譜儀分析滯留于各位點的蛋白質。II.溶菌酶的識別特征概況我們用高信息分辨滯留層析得到溶菌酶的識別特征概況。所述的概況包括用6種吸附劑，各自在多種不同選擇性閾值修飾劑存在下分辨溶菌酶。結果得到40幅不同的譜圖，以不同方式描述了溶菌酶的理化特性。
A.用親水性吸附劑陣列的溶菌酶識別概況將雞蛋白溶菌酶加到不銹鋼基質上氧化硅層析系列吸附劑陣列的不同位點。在一濕潤培養箱中室溫孵育15分鐘后，分別用以下洗脫劑(選擇性閾值修飾劑)洗滌不同的各點(1)20mM磷酸鈉緩沖液，pH7.0，(2)NaCl在20mM磷酸鈉緩沖液所成的0.2M溶液，pH7.0，(3)NaCl在20mM磷酸鈉緩沖液所成的0.4M溶液，pH7.0，(4)25mM乙酸鈉緩沖液，0.125M NaCl，pH4.5，(5)1％TFA，(6)10％乙腈水溶液，(7)20％乙腈水溶液，(8)Tween20在20mM磷酸鈉緩沖液所成的0.05％溶液，0.15M NaCl，pH7.0，和(9)尿素在20mM磷酸鈉緩沖液所成的3M溶液，pH7.0。
每次洗滌都包括用1μl洗滌溶液在吸附劑位點上吸進吸出3次。用一份新鮮的洗滌溶液重復以上過程。然后，用1μl水洗滌各吸附劑位點2次。加一份0.3μlsinapinic酸(5mg/ml 50％乙腈0.5％TFA)，任其自然干燥。用質譜儀，用氮激光儀(335nm)和60cm飛行管分析陣列。用計算機分析數據，輸入GRAMS/32c(購自Galactic Industries Corporation)進行數據重疊展示。
圖5A顯示了正常相層析系列吸附劑陣列上的溶菌酶識別概況組分質譜。底下的譜線顯示，僅用pH7的緩沖液洗滌后，溶菌酶信號強度保留在氧化硅吸附劑上。在選擇性閾值修飾劑中加進氯化鈉(0.2-0.4M)減少了溶菌酶的滯留。這表明，溶菌酶(堿性蛋白)與氧化硅吸附劑(在pH7時帶負電)的相互作用涉及離子交換機制。將選擇性閾值修飾劑的pH降低至例如乙酸鈉溶液的pH4.5或1％TFA的pH 2以下，氧化硅吸附劑上的負電幾乎完全消除，不再有溶菌酶滯留。在選擇性閾值修飾劑中加進極性調節劑，有機溶劑(例如乙腈)或除垢劑(例如Tween20)或尿素，也削弱溶菌酶與氧化硅吸附劑之間的相互作用。這表明，其它作用機制包括親水性相互作用。
B.用疏水性吸附劑陣列的溶菌酶識別概況將雞蛋白溶菌酶加到氧化硅包被的不銹鋼基質上的聚乙烯(C3疏水性)吸附劑包被的層析系列吸附劑陣列的不同位點。在一濕潤培養箱中室溫孵育15分鐘后，分別用以下洗脫劑(選擇性閾值修飾劑)洗滌不同的各點(1)0.1％TFA，(2)乙腈在0.1％TFA中所成的10％溶液，(3)乙腈在0.1％TFA中所成的20％溶液，(4)乙腈在0.1％TFA中所成的50％溶液，(5)Tween20在20mM磷酸鈉緩沖液所成的0.05％溶液，0.15M NaCl，pH7.0，和(6)尿素在20mM磷酸鈉緩沖液所成的3M溶液，0.15M NaCl，pH7.0。
每次洗滌都包括用1μl洗滌溶液在位點上吸進吸出3次。用一份新鮮的洗滌溶液重復以上過程。然后，用1μl水洗滌各吸附劑位點2次。加一份0.3μlsinapinic酸(5mg/ml 50％乙腈0.5％TFA)，任其自然干燥。用質譜儀，用氮激光儀(335nm)和60cm飛行管分析陣列。用計算機分析數據，輸入GRAMS/32c(購自GalacticIndustries Corporation)進行數據重疊展示。
圖5B顯示C3疏水性層析系列吸附劑陣列上的溶菌酶識別概況組分質譜。底下的譜線顯示，僅用0.1％TFA洗滌后，溶菌酶信號強度保留在C3疏水性吸附劑上。在選擇性閾值修飾劑中加進極性調節劑(例如乙腈)減少溶菌酶在C3疏水性吸附劑上的滯留。將溶菌酶從C3疏水性吸附劑上洗脫的乙腈濃度范圍是20-50％。在選擇性修飾劑中加進除垢劑(Tween20)，或尿素沒顯著減少溶菌酶在C3疏水性吸附劑上的滯留。
C.用苯基疏水性吸附劑陣列的溶菌酶識別概況將雞蛋白溶菌酶加到氧化硅包被的不銹鋼基質上的聚苯乙烯(苯基疏水性)吸附劑陣列的不同位點。在一濕潤培養箱中室溫孵育15分鐘后，分別用以下洗脫劑(選擇性閾值修飾劑)洗滌不同的各點(1)0.1％TFA，(2)乙腈在0.1％TFA中所成的10％溶液，(3)乙腈在0.1％TFA中所成的20％溶液，(4)乙腈在0.1％TFA中所成的50％溶液，(5)Tween20在20mM磷酸鈉緩沖液所成的0.05％溶液，0.15M NaCl，pH7.0，和(6)尿素在20mM磷酸鈉緩沖液所成的3M溶液，0.15M NaCl，pH7.0。
每次洗滌都包括用1μl洗滌溶液在位點上吸進吸出3次。用一份新鮮的洗滌溶液重復以上過程。然后，用1μl水洗滌各吸附劑位點2次。加一份0.3μlsinapinic酸(5mg/ml 50％乙腈0.5％TFA)，任其自然干燥。用質譜儀，用氮激光儀(335nm)和60cm飛行管分析陣列。用計算機分析數據，輸入GRAMS/32c(購自GalacticIndustries Corporation)進行數據重疊展示。
圖5C顯示疏水性苯基層析系列吸附劑陣列上的溶菌酶識別概況組分質譜。底下的譜線顯示，僅用0.1％TFA洗滌后，溶菌酶信號強度保留在疏水性苯基吸附劑上。在選擇性閾值修飾劑中加進極性調節劑(例如乙腈)減少溶菌酶滯留。將溶菌酶從C3疏水性吸附劑上洗脫的乙腈濃度范圍是20-50％，但是，比較20％乙腈洗滌條件下滯留在C3和苯基表面上的溶菌酶強度峰值時，溶菌酶與苯基吸附劑的相互作用較弱。在選擇性閾值修飾劑中加進除垢劑(Tween20)，或尿素也明顯減少溶菌酶在疏水性苯基吸附劑上的滯留。
D.用陰離子吸附劑陣列的溶菌酶識別概況將雞蛋白溶菌酶加到氧化硅包被的不銹鋼基質上的陰離子吸附劑陣列(SO3-，即陰離子交換吸附劑)的不同位點。在一濕潤培養箱中室溫孵育15分鐘后，分別用以下洗脫劑(選擇性閾值修飾劑)洗滌不同的各點(1)20mM磷酸鈉緩沖液，pH7.0，(2)NaCl在20mM磷酸鈉緩沖液中所成的0.1M溶液，pH7.0，(3)NaCl在20mM磷酸鈉緩沖液中所成的0.2M溶液，pH7.0，(4)NaCl在20mM磷酸鈉緩沖液中所成的0.4M溶液，pH7.0，(5)25mM乙酸鈉緩沖液，0.125M NaCl，pH4.5，(6)Tween20在20mM磷酸鈉緩沖液所成的0.05％溶液，0.15M NaCl，pH7.0，和(7)尿素在20mM磷酸鈉緩沖液所成的3M溶液，pH7.0。
每次洗滌都包括用1μl洗滌溶液在位點上吸進吸出3次。用一份新鮮的洗滌溶液重復以上過程。然后，用1μl水洗滌各吸附劑位點2次。加一份0.3μlsinapinic酸(5mg/ml 50％乙腈0.5％TFA)，任其自然干燥。用質譜儀，用氮激光儀(335nm)和60cm飛行管分析陣列。用計算機分析數據，輸入GRAMS/32c(購自GalacticIndustries Corporation)進行數據重疊展示。
圖5D顯示陽離子交換層析系列陣列上的溶菌酶識別概況組分質譜。底下的譜線顯示，僅用pH7.0的緩沖液洗滌后，溶菌酶信號強度保留在陰離子吸附劑上。隨著選擇性閾值修飾劑中氯化鈉濃度的升高(0.1-0.4M)，溶菌酶滯留減少。這表明，溶菌酶(堿性蛋白)與陰離子吸附劑的相互作用涉及離子交換機制。洗脫溶菌酶所需的氯化鈉濃度為0.4M。將選擇性閾值修飾劑的pH降低至乙酸鈉緩沖液的pH4.5不影響溶菌酶在強陰離子吸附劑上的滯留。在選擇性閾值修飾劑中加進極性調節劑(例如除垢劑Tween20，或尿素)削弱溶菌酶與陰離子吸附劑的相互作用。這表明，疏水性溶菌酶蛋白與陰離子吸附劑間的相互作用受洗脫劑極性的調節。
E.用陽離子吸附劑陣列的溶菌酶識別概況將雞蛋白溶菌酶加到氧化硅包被的不銹鋼基質上的陽離子吸附劑(季胺)陣列的不同位點。在一濕潤培養箱中室溫孵育15分鐘后，分別用以下洗脫劑(選擇性閾值修飾劑)洗滌不同的各點(1)20mM磷酸鈉緩沖液，pH7.0，(2)NaCl在20mM磷酸鈉緩沖液中所成的0.1M溶液，pH7.0，(3)NaCl在20mM磷酸鈉緩沖液中所成的0.2M溶液，pH7.0，(4)NaCl在20mM磷酸鈉緩沖液中所成的0.4M溶液，pH7.0，(5)25mM乙酸鈉緩沖液，0.125M NaCl，pH4.5，(6)Tween20在20mM磷酸鈉緩沖液所成的0.05％溶液，0.15M NaCl，pH7.0，和(7)尿素在20mM磷酸鈉緩沖液所成的3M溶液，pH7.0。
每次洗滌都包括用1μl洗滌溶液在位點上吸進吸出3次。用一份新鮮的洗滌溶液重復以上過程。然后，用1μl水洗滌各吸附劑位點2次。加一份0.3μlsinapinic酸(5mg/ml 50％乙腈0.5％TFA)，任其自然干燥。用質譜儀，用氮激光儀(335nm)和60cm飛行管分析陣列。用計算機分析數據，輸入GRAMS/32c(購自GalacticIndustries Corporation)進行數據重疊展示。
圖5E顯示陽離子(陰離子交換)吸附劑層析系列吸附劑陣列上的溶菌酶識別概況組分質譜。堿性溶菌酶在陽離子吸附劑上的滯留很弱。改變選擇性閾值修飾劑對溶菌酶滯留的作用極小。
F.用固定化金屬離子吸附劑陣列的溶菌酶識別概況將雞蛋白溶菌酶加到氧化硅包被的不銹鋼基質上的固定化金屬(亞氨基乙酸Cu)吸附劑陣列的不同位點。在一濕潤培養箱中室溫孵育15分鐘后，分別用以下洗脫劑(選擇性閾值修飾劑)洗滌不同的各點(1)20mM磷酸鈉緩沖液，0.5M NaCl，pH7.0，(2)咪唑在20mM磷酸鈉緩沖液中所成的5mM溶液，0.5M NaCl，pH7.0，(3)0.1M乙酸鈉緩沖液，0.5M NaCl，pH4.5，(4)Tween20在20mM磷酸鈉緩沖液所成的0.05％溶液，0.15M NaCl，pH7.0，或(5)尿素在20mM磷酸鈉緩沖液所成的3M溶液，0.5M NaCl，pH7.0。
每次洗滌都包括用1μl洗滌溶液在位點上吸進吸出3次。用一份新鮮的洗滌溶液重復以上過程。然后，用1μl水洗滌各吸附劑位點2次。加一份0.3μlsinapinic酸(5mg/ml 50％乙腈0.5％TFA)，任其自然干燥。用質譜儀，用氮激光儀(335nm)和60cm飛行管分析陣列。用計算機分析數據，輸入GRAMS/32c(購自GalacticIndustries Corporation)進行數據重疊展示。
圖5F顯示固定化金屬層析系列吸附劑陣列上的溶菌酶識別概況組分質譜。底下的譜線顯示，僅用pH7.0的緩沖液洗滌后，溶菌酶信號強度保留在固定化銅離子吸附劑上。在選擇性閾值修飾劑中加入結合氨基酸的競爭性親合配體(例如咪唑)消除了溶菌酶的滯留。這表明溶菌酶(在序列中僅有一個組氨酸殘基)與固定化銅離子吸附劑的相互作用涉及形成配位共價鍵的機制。將選擇性閾值修飾劑的pH降低至乙酸鈉緩沖液的pH4.5也減少溶菌酶在固定化銅離子吸附劑上的滯留。據信這是因為溶菌酶上組氨酸的質子化抑制配位共價相互作用。加除垢劑(Tween20)不影響此相互作用。加進尿素完全消除溶菌酶在固定化銅吸附劑上的滯留。III.人血清中分析物的分辨我們用多種吸附劑和洗脫劑分辨人血清中的分析物。結果顯示，分析物被不同的吸附劑差異保留，滯留層析圖能夠在低分子量和高分子量時提供信息。
A.用固定化金屬離子吸附劑陣列的人血清蛋白識別概況將人血清蛋白加到氧化硅包被的不銹鋼基質上的固定化金屬離子(三(羧基甲基)亞乙基二胺-Cu)吸附劑陣列的不同位點。在一濕潤培養箱中室溫孵育15分鐘后，分別用以下洗脫劑(選擇性閾值修飾劑)洗滌不同的各點(1)20mM磷酸鈉緩沖液，0.5M NaCl，pH7.0，(2)咪唑在20mM磷酸鈉緩沖液中所成的5mM溶液，0.5M NaCl，pH7.0，(3)0.1M乙酸鈉緩沖液，0.5M NaCl，pH4.5，(4)Tween20在20mM磷酸鈉緩沖液所成的0.05％溶液，0.15M NaCl，pH7.0，或(5)尿素在20mM磷酸鈉緩沖液所成的3M溶液，0.5M NaCl，pH7.0。
每次洗滌都包括用1μl洗滌溶液在位點上吸進吸出3次。用一份新鮮的洗滌溶液重復以上過程。然后，用1μl水洗滌各吸附劑位點2次。加一份0.3μlsinapinic酸(5mg/ml 50％乙腈0.5％TFA)，任其自然干燥。用質譜儀，用氮激光儀(335nm)和60cm飛行管分析陣列。用計算機分析數據，輸入GRAMS/32c(購自GalacticIndustries Corporation)進行數據重疊展示。
圖6A和6B顯示低分子量和高分子量時，固定化金屬層析系列吸附劑陣列上的血清蛋白識別概況組分質譜。底下的譜線顯示，僅用pH7.0的緩沖液洗滌后，血清蛋白滯留在固定化銅吸附劑上。在選擇性閾值修飾劑中加入結合氨基酸的競爭性親合配體(例如咪唑)，或除垢劑(例如Tween20)，或尿素，或將選擇性閾值修飾劑的pH降低至pH4.5不同程度地加強或削弱復雜蛋白質混合物中不同組分在相同吸附劑上的滯留。
G.用不同吸附劑的人血清蛋白識別概況將人血清加到以下不同吸附劑組成的吸附劑陣列的不同位點(1)C3疏水性，(2)苯基疏水性，(3)陰離子交換，(4)陽離子交換，(5)固定化金屬(三(羧基甲基)亞乙基二胺-Cu)。
將各吸附劑涂在氧化硅包被的不銹鋼基質上。在濕潤的培養箱中孵育15分鐘后，用Tween20在20mM磷酸鈉緩沖液中所成的0.05％溶液，0.15M NaCl，pH7.0作為選擇性閾值修飾劑洗滌各位點。
每次洗滌都包括用1μl洗滌溶液在位點上吸進吸出3次。用一份新鮮的洗滌溶液重復以上過程。然后，用1μl水洗滌各吸附劑位點2次。加一份0.3μlsinapinic酸(5mg/ml 50％乙腈0.5％TFA)，任其自然干燥。用質譜儀，用氮激光儀(335nm)和60cm飛行管分析陣列。用計算機分析數據，輸入GRAMS/32c(購自GalacticIndustries Corporation)進行數據重疊展示。
圖7A和7B顯示層析系列吸附劑陣列內不同吸附劑上血清蛋白識別概況的組分質譜。對不同的吸附劑(結合特征不同)使用同一種選擇性閾值修飾劑不同程度地加強或削弱復雜蛋白質混合物中不同組分在不同吸附劑上的滯留。IV.早產(preterm)嬰兒尿液中分析物的分辨我們用不同的吸附劑和洗脫劑分辨早產嬰兒尿液中的分析物。結果顯示，因為吸附劑差異保留分析物，使用不同的吸附劑具有很強的分辨能力。它們還能夠鑒定出優先保留特定分析物的吸附劑，這可以用于開發純化方法。
A.用不同吸附劑和相同的洗脫劑(水)分辨早產嬰兒尿液中的分析物將早產嬰兒的尿液(2μl)加到用以下不同吸附劑包被的碳化PEEK聚合物基質的不同位點(1)C8疏水性(辛基瓊脂糖，購自Sigma)，(2)苯基疏水性(苯基瓊脂糖，購自Sigma)，(3)陰離子交換(Q瓊脂糖，購自Sigma)，(4)陽離子交換(S瓊脂糖，購自Sigma)，(5)固定化金屬(IDA-Cu，螯合瓊脂糖，購自Pharmacia)，和(6)固定化金屬(三(羧基甲基)亞乙基二胺-Cu瓊脂糖)在濕潤的培養箱中孵育15分鐘后，用水作為選擇性閾值修飾劑洗滌各吸附劑位點。每次洗滌都包括用1μl洗滌溶液在位點上吸進吸出3次。用一份新鮮的洗滌溶液重復以上過程。加一份0.3μlsinapinic酸(5mg/ml 50％乙腈0.5％TFA)，任其自然干燥。用購自Hewlett Packard的激光解吸/離子化-飛行時間質譜儀(2030型)，用氮激光儀(355nm)和150cm飛行管分析陣列。用HP MALDI TOF軟件分析數據，輸入GRAMS/32c進行重疊展示。
圖8A和8B顯示在低分子量和高分子量時，層析系列不同吸附劑上早產嬰兒尿液蛋白識別概況的組分質譜。對不同吸附劑(結合特性不同)使用同一種洗脫劑(即水)不同程度地加強或削弱復雜蛋白質混合物中不同組分在不同吸附劑上的滯留。
B.用與基質間接偶連的疏水性苯基吸附劑和三種不同洗脫劑分辨早產嬰兒尿液中的分析物將早產嬰兒的尿液(2μl)加到苯基疏水性吸附劑(苯基瓊脂糖，購自Sigma)包被的碳化PEEK聚合物基質的不同位點。在濕潤的培養箱中孵育15分鐘后，各吸附劑位點用以下洗脫劑(選擇性閾值修飾劑)之一洗滌(1)水(2)尿素在20mM磷酸鈉緩沖液中所成的2M溶液，0.15M NaCl，pH7.0，和(3)Tween20在20mM磷酸鈉緩沖液中所成的0.1％溶液，0.15M NaCl，pH7.0。
每次洗滌都包括用1μl洗滌溶液在位點上吸進吸出3次。用一份新鮮的洗滌溶液重復以上過程。然后，用1μl水洗滌各吸附劑位點2次。加一份0.3μlsinapinic酸(5mg/ml 50％乙腈0.5％TFA)，任其自然干燥。用用購自Hewlett Packard的激光解吸/離子化-飛行時間質譜儀(2030型)，用氮激光儀(355nm)和150cm飛行管分析陣列。用HP MALDI TOF軟件分析數據，輸入GRAMS/32c進行重疊展示。
圖9顯示層析系列疏水性苯基吸附劑上早產嬰兒尿液蛋白識別概況的組分質譜。對同一種吸附劑使用洗脫特性不同的不同洗脫劑不同程度地加強或削弱復雜蛋白質混合物中不同組分的滯留。當以0.1％Tween20 PBS溶液作為洗脫劑時，組分之一被疏水性苯吸附劑選擇性保留(以*標記)。V.兩種不同細胞的培養基中蛋白質的鑒定本實施例說明用吸附劑陣列層析系列鑒定由細胞差異表達的蛋白質。
兩種乳腺癌細胞系在常數組成的培養基中培養相同的時間。在過濾濃縮后，各取1μl培養基加到氧化硅包被的不銹鋼基質上固定化金屬(三(羧基甲基)亞乙基二胺-Cu)吸附劑陣列(Ciphergen Biosystems，Inc.，Palo Alto，CA)的不同位點。在濕潤的培養箱中室溫孵育15分鐘后，各吸附劑位點用以下洗脫劑(選擇性閾值修飾劑)之一洗滌(1)20mM磷酸鈉緩沖液，0.5M NaCl，pH7.0，(2)咪唑在20mM磷酸鈉緩沖液中所成的20mM溶液，0.5M NaCl，pH7.0，(3)0.1M乙酸鈉緩沖液，0.5M NaCl，pH4.5，(4)Tween20在20mM磷酸鈉緩沖液中所成的0.1％溶液，0.15M NaCl，pH7.0，(5)尿素在10mM磷酸鈉緩沖液中所成的3M溶液，0.5M NaCl，pH7.0，或(6)1％TFA 。
每次洗滌都包括用1μl洗滌溶液在位點上吸進吸出3次。用一份新鮮的洗滌溶液重復以上過程。然后，用1μl水洗滌各吸附劑位點2次。加一份0.3μlsinapinic酸(5mg/ml 50％乙腈0.5％TFA)，任其自然干燥。用激光解吸/離子化-飛行時間質譜儀(2030型)，用氮激光儀(355nm)和60cm飛行管分析陣列。用計算機軟件分析數據，輸入GRAMS/32c(Galactic Industries Corporation)進行重疊展示。
圖10A顯示固定化金屬(Cu)層析系列吸附劑陣列上細胞系1分泌蛋白識別概況的組分質譜。對同一吸附劑使用不同選擇性閾值的洗脫劑不同程度地加強或削弱復雜蛋白質混合物中不同組分的滯留。
圖10B顯示固定化金屬(Cu)層析系列吸附劑陣列上兩細胞系分泌蛋白識別概況的組分質譜。用同一洗脫劑，0.1％Tween20+尿素在10mM磷酸鈉緩沖液中所成的3M溶液，0.5M NaCl，pH7.0洗去未滯留的物質。標記為7532Da的峰是細胞系1分泌蛋白的主滯留峰，細胞系2不表達該蛋白。
圖10C顯示固定化金屬(Ni)層析系列吸附劑陣列上細胞系1分泌蛋白識別概況的組分質譜。用同一洗脫劑，0.1％Tween20+尿素在10mM磷酸鈉緩沖液中所成的3M溶液，0.5M NaCl，pH7.0，但用表面反應能力不同的另一吸附劑(即固定化Ni而不是固定化Cu)，7532Da峰是細胞系1所有分泌蛋白中唯一滯留的蛋白。插入的圖顯示放大后的同一質譜。3766 Da小峰是同一種蛋白帶雙電荷的形式。
圖10D顯示在胰蛋白酶原位消化前(下圖)和后(上圖)，固定化金屬(Ni)層析系列吸附劑陣列上細胞系1分泌蛋白識別概況的組分質譜。用純蛋白產生的肽圖是該蛋白的指紋，可用于鑒定。VI.滯留層析與2D凝膠電泳的比較滯留層析的優點之一是能夠以不同維度迅速分辨分析物，得到有關多種理化特性的高信息內容。相反，2D凝膠電泳只提供2維度的分辨。
圖11顯示層析系列苯基疏水性吸附劑上的早產嬰兒尿液識別概況。用不同的洗脫劑和吸附劑得到多維度的信息。使用不同選擇性條件不同程度地加強或削弱復雜蛋白質混合物(例如早產嬰兒尿液)中不同組分的滯留，得到分析物的詳細分辨。
相反，圖12顯示早產嬰兒尿液中蛋白質根據pI和分子量的兩維度分辨。與在滯留層析中用作吸附劑的6維度相比，凝膠提供有關兩個維度的信息。位點的分辨不及質譜法，分子量很高和很低時的分辨率很有限。VII.從樣品中依次提取分析物可以通過樣品與選擇性條件的依次接觸然后收集未滯留的樣品從樣品中依次提取分析物。
在10％乙二醇50mM EDTA中制備嗜血桿菌(Hemophilus)敲除突變株裂解液。離心后，將上清液以1∶3稀釋在0.01％Triton X100的25mM HEPES，pH7.4溶液中。取一份2μl稀釋樣品加到吸附劑陣列陰離子部位的一個位置上。室溫孵育30分鐘后，將陰離子位置上滯留的樣品轉移到吸附劑陣列正常相部位的一個位置上。陰離子位置用2μl 0.01％Triton X100 25mM HEPES洗滌2次。每次洗滌都是用移液管將洗滌溶液吸進吸出10次。將各洗液與最初加到正常相位點的樣品合并。
室溫孵育30分鐘后，將正常相位置上滯留的樣品轉移到吸附劑陣列Ni(II)部位的一個位點。該正常相位點用2μl磷酸鹽緩沖液洗滌2次。每次都是用移液管將洗滌溶液吸進吸出10次。將各份洗液與最初加到Ni(II)位點的樣品合并。
樣品在Ni(II)位點上濃縮近干燥后，用2μl100mM咪唑磷酸鹽緩沖液溶液洗滌2次，回收未結合的分析物。每次都是用移液管將洗滌溶液吸進吸出10次。將各份洗液轉移到吸附劑陣列脂肪族疏水性部位的一個位點。
樣品在脂肪族疏水性吸附劑位點上濃縮近干燥后，用2μl乙腈在0.1％三氟乙酸中所成5％溶液洗滌2次，去除未結合的分析物。每次都是用移液管將洗滌溶液吸進吸出10次。
陰離子、正常相、Ni(II)和疏水性部位各位點用2μl水洗去殘留的緩沖液。在各位點加一份0.3μl以50％乙腈0.5％三氟乙酸配成的sinapinic酸溶液。用激光解吸/離子化飛行時間質譜儀分析各部位上的滯留分析物。
圖19A-19D顯示吸附劑陣列上嗜血桿菌(Hemophilus)裂解液的滯留圖。在吸附劑上，可觀察到質量在3000至25000Da范圍內的多個峰。注意，每種吸附劑表現出對樣品中不同分析物的不同保留作用。VIII.逐步分辨一種分析物給分辨一種分析物的選擇性條件增加新的結合或洗脫特性可以形成分辨分析物更好的的選擇性條件。在該實施例中，樣品與Cu(II)吸附劑結合，并與第一和第二洗脫劑接觸。第二洗脫劑與第一洗脫劑的區別在于增加了另一洗脫條件。每一種新加的條件都改善對分析物的分辨。
在10％乙二醇中制備的嗜血桿菌(Hemophilus)野生型穩定期裂解液以1∶1稀釋在20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，pH7.0中。離心后，取一份150μl上清液與生物處理儀中吸附劑陣列Cu(II)部位的各位點一起孵育。低溫混合30分鐘后，除去樣品。各位點用不同的裂解液洗滌。第一點用150μl 20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，pH7.0洗滌。第二點用150μl Triton X100在20mM磷酸鈉中所成的0.05％溶液，0.15M氯化鈉，pH7.0洗滌。第三點，用150μl咪唑在20mM磷酸鈉中所成的100mM溶液，0.15M氯化鈉，pH7.0洗滌。每次洗滌包括洗滌溶液與各位點混合孵育5分鐘。重復洗滌2次。用水洗滌各位點，去除除垢劑和緩沖液。
從生物處理儀中取出吸附劑陣列。在各點加一份0.3μl以50％乙腈和0.5％三氟乙酸配成的sinapinic酸溶液。0.3μl以50％乙腈和0.5％三氟乙酸配成的sinapinic酸溶液。圖20A-20C顯示在上述3種洗脫條件下洗滌后，嗜血桿菌(Hemophilus)裂解液在吸附劑陣列Cu(II)部位的滯留圖。在2000-18000Da質量范圍內可觀察到多個峰。在圖20A滯留圖中，用“*”標記的蛋白只是一個次要組分。當選擇性條件因相同的緩沖液中增加一種除垢劑(TritonX100)而改變時(圖20B)，蛋白“*”的滯留比其他分析物都好，分辨得更好。當選擇性條件因相同的緩沖液中增加一種親合性取代物而改變時(圖20C)，在滯留圖中，蛋白“*”與其它分析物高度區分。
這種逐步鑒定更好地分辨某種分析物的選擇性條件的策略可用來開發從全嗜血桿菌裂解液中逐步純化該蛋白的方法。IX.分析物的差異表達標記蛋白的開發A.人血清每份0.5μl正常和疾病人血清用等體積20mM磷酸鈉，0.5M NaCl，pH7.0稀釋。將各等份加在吸附劑陣列Cu(II)部位的不同位點上。4℃孵育1小時后，各位點用2μl 20mM磷酸鈉，0.5M NaCl，pH7.0洗滌2次。每次洗滌都是用移液管將洗滌溶液吸進吸出10次。最后用2μl水洗滌各點，去除殘留的緩沖液。在各點加一份0.3μlsinapinic酸在50％乙腈和0.5％三氟乙酸中所成的溶液。0.3μl以50％乙腈和0.5％三氟乙酸配成的sinapinic酸溶液。用激光解吸/離子化飛行時間質譜儀分析各部位上的滯留分析物。
在圖21D中，疾病血清中蛋白“*”的量顯著高于正常血清。結果顯示了一種開發可用于臨床診斷的疾病標記的方法。
B.鼠尿每份1μl正常、疾病或藥物治療過的鼠尿加在吸附劑陣列Cu(II)部位的不同位點上。室溫孵育10分鐘后，各點用2μl咪唑在20mM磷酸鈉所成的100mM溶液，0.15M NaCl，pH7.0洗滌2次。每次洗滌都是用移液管將洗滌溶液吸進吸出10次。最后用2μl水洗滌各點，去除殘留的緩沖液。在各點加一份0.3μl以50％乙腈和0.5％三氟乙酸配成的sinapinic酸溶液。用激光解吸/離子化飛行時間質譜儀分析各部位上的滯留分析物。
圖1顯示了正常(對照)、疾病和藥物治療過的鼠的尿的滯留圖。發現有一種分析物在疾病鼠尿(中圖)中較多，該分析物在正常鼠尿(上圖)中沒有，在藥物治療的鼠的尿中少得多(下圖)。可用該分析物作為潛在的疾病標記。為了體現定量診斷試驗的可行性，計算了滯留蛋白峰的面積，并顯示在表格中。在疾病和藥物治療過的鼠的尿之間可觀察到明顯的量差。為了補償實驗的不穩定性使用了一個內標分析物。底下的分圖顯示了各鼠尿樣品校正后的疾病標記峰面積(即標記峰面積除以內標峰面積)。在藥物治療后，疾病尿液中的標記減少至少10倍。
C.人尿將常人和癌癥患者的尿液以1∶2稀釋在Triton X100在磷酸鹽緩沖液中所成的0.01％溶液中。每份1.5μl的正常或疾病人尿加在吸附劑陣列脂肪族疏水性部位的不同位點，這些位點預先用0.5μl異丙醇/乙腈(1∶2)0.1％三氟乙酸潤濕。4℃孵育30分鐘后，各點用2μl乙二醇在10Mm TrisHCl中所成的50％溶液，0.05M NaCl，pH7.5洗滌2次。每次洗滌都是用移液管將洗滌溶液吸進吸出10次。最后用2μl水洗滌各點，去除殘留的乙醇和緩沖液。在各點加一份0.3μl以50％乙腈和0.5％三氟乙酸配成的sinapinie酸溶液。用激光解吸/離子化飛行時間質譜儀分析各部位上的滯留分析物。
圖23A顯示了4名癌癥患者和1名常人的尿液的滯留圖。用乙二醇在Tris/NaCl緩沖液中所成50％溶液洗滌后，有多個滯留在吸附劑陣列疏水性部位的蛋白峰。為了鑒定出可能的疾病標記，繪制了各患者以及與常人尿液之間的差異圖。差異圖中基線以上的各條柱代表分析物在患者尿液中存在更多。(圖23B-23D)。患者差異圖模式的變動反映了群體中的個體波動性。但是，5000Da附近的一種分析物(以“*”標記)和7500 Da附近的一簇分析物被發現在所有患者中總是較多，所以，這些可鑒定為潛在疾病標記。X.從噬菌體展示文庫中捕捉噬菌體可用解吸譜法檢測吸附于蛋白芯片表面的病毒。用抗病毒外被蛋白的抗體作為吸附劑可以捕獲病毒。用作吸附劑的靶蛋白可以捕獲展示抗靶蛋白單鏈抗體的噬菌體。
A.吸附劑基質檢測噬菌體展示的抗體的靈敏度在Triton X100在25mM HEPES所成0.01％溶液，pH7.4中，連續稀釋生長培養基中的M13噬菌體(1012粒/ml)。每份0.25μl的稀釋噬菌體懸浮液加到吸附劑陣列脂肪族疏水性部位的位點上。加一份0.3μl以50％乙腈和0.5％三氟乙酸配成的CHCA酸溶液。用激光解吸/離子化飛行時間質譜儀分析樣品。
在陣列上，可以高靈敏度地檢測到M13噬菌體基因VIII蛋白。圖24A-24E。當噬菌體懸浮液稀釋10,000,000倍時可以獲得可測信號(信號/干擾≥2)。
B.用吸附劑陣列鑒定M13噬菌體將兔抗M13抗體(Strategene)固定在蛋白A Hyper D(BioSepra)上，用pH7.0的磷酸鹽緩沖液徹底洗滌。每份1-10μl M13噬菌體生長培養基懸浮液(1012顆粒/ml)與每份1μl的固定化抗M13抗體4℃孵育通宵。用0.05％的Tween20 pH7.0磷酸鹽緩沖液溶液洗滌，然后用水洗去除垢劑和緩沖液，在sinanipic酸存在下，用激光解吸/離子化飛行時間質譜儀分析每份捕獲的噬菌體。
抗M13抗體對照只顯示抗體信號(單一和雙電荷)。圖25A。當M13噬菌體被抗體捕獲，最容易鑒定的噬菌體蛋白峰是基因VIII蛋白和與單鏈抗體融合的基因VIII蛋白。圖25B。因為本方法以高度靈敏度檢測到了M13噬菌體基因VIII蛋白，所以它可以用作捕捉噬菌體的靈敏檢測劑。
C.特異性捕捉展示單鏈抗體的M13噬菌體HIV-1 Tat蛋白(McKesson BioSerivces)與預先活化的基質偶合。用乙醇胺封閉后，先后用0.005％的Tween20 pH7磷酸鹽緩沖液溶液，和0.1％BSApH7磷酸鹽緩沖液溶液洗滌。展示抗Tat蛋白單鏈抗體的M13噬菌體系列稀釋液與Tat蛋白吸附劑陣列4℃孵育通宵。陰性對照，即不展示抗Tat蛋白單鏈抗體的M13噬菌體系列稀釋液也與Tat蛋白吸附劑陣列同法孵育。依次用0.05％的Tween20磷酸鹽緩沖液溶液，1M的尿素pH7磷酸鹽緩沖液溶液洗滌陣列，最后用水洗去緩沖液和尿素。加一份0.3μl以50％乙腈和0.5％三氟乙酸配成的CHCA酸溶液。用激光解吸/離子化飛行時間質譜儀分析滯留的噬菌體。
可以觀察到展示抗Tat蛋白單鏈抗體的M13噬菌體的特異性結合呈濃度依賴方式(實線)。圖26A-26D。非特異性M13噬菌體在吸附劑陣列上的非特異性結合極小(虛線)。這證明了一種檢測噬菌體的高靈敏度方法，所述的噬菌體包含編碼特異性識別靶分析物的單鏈抗體的基因。XI.篩選測定化合物是否抑制受體與配體間的結合本發明方法可用來測定某測試物質是否調節配體與受體的結合。在該實施例中，我們證明滯留層析能夠檢測游離TGF-β受體對于TGF-β與結合的TGF-β受體(作為吸附劑)結合的抑制作用。
TGF-β重組受體-Fc融合蛋白(R&D，Minnesota)特異性地結合在蛋白G吸附劑陣列上。將TGF-β(R&D，Minnesota)以細胞條件培養基(2.5倍濃縮)連續稀釋，與受體-Fc蛋白G吸附劑陣列4℃孵育通宵。另一組TGF-β以細胞條件培養基連續稀釋液在調節劑存在下與受體-Fc蛋白G吸附劑陣列一起孵育。此處的調節劑是游離TGF-β受體。相同條件孵育后，先后用0.05％Triton X100的PBS溶液和3M尿素PBS溶液洗滌芯片。在各位點加每份0.3μlsinanipic酸，并用激光解吸/離子化飛行時間質譜儀分析。
圖27A顯示1μg/ml TGF-β特異性結合受體-Fc蛋白G吸附劑陣列(實線)。細胞條件培養基中沒有發現有蛋白質結合。圖27B顯示100ng/ml TGF-β特異性結合受體-Fc蛋白G吸附劑陣列(實線)。當TGF-β與受體-Fc蛋白G吸附劑陣列在調節劑(游離TGF-β受體)存在下孵育時，100ng/ml TGF-β時的吸附完全消除(圖27A，虛線)，1μg/ml TGF-β時只有微量結合(圖27B，虛線)。在此，調節劑(同一受體)對配體具有高度特異性結合親合力，所以高效競爭靶分析物的結合。在其它時候，有和沒有調節劑時結合于吸附劑的靶分析物之比體現調節劑的效率。XII.滯留層析的分辨能力本實施例證明滯留層析通過不同選擇性條件下的并行處理分辨樣品中蛋白質的能力。
在10％乙二醇中制備嗜血桿菌流感裂解液。離心后，將上清液以1∶3稀釋在Triton X100在25mM HEPES中所成的0.01％溶液，pH7.4中。將每份2μl稀釋樣品加到吸附劑陣列陽離子部位的一位點上。室溫孵育30分鐘后，用25mMHEPES，pH7.4洗滌位點。另一份2μl稀釋樣品加到吸附劑陣列脂肪族疏水性部位的一位點上。室溫孵育30分鐘后，用水洗滌位點。第三份2μl稀釋樣品加到吸附劑陣列Cu(II)部位的一位點上。室溫孵育30分鐘后，用0.05％的Triton X100pH7.4磷酸鹽緩沖液溶液洗滌。在各位點加一份0.3μl以50％乙腈0.5％三氟乙酸中配成的sinapinic酸溶液。用激光解吸/離子化飛行時間質譜儀分析各位點上滯留的分析物。
結果顯示在圖28-31中。滯留分析物總計約550。結果證明了一種組合性分離方法，包括并行分離和檢測多種分析物。XIII.依次組裝多聚結構本實施例說明在初始吸附劑上構建第二吸附劑的方法。然后，第二吸附劑可以作為靶分析物的特異性吸附劑。
將GST融合受體稀釋于20mM Tris，100mM氯化鈉，0.4％NP40，pH7.2中，取一份0.5μl加到吸附劑陣列正常相部位的一位點上。任溶液在此位點上濃縮到接近干燥。位點用2μl 10mM Tris，50mM氯化鈉，pH7.2洗滌3次。每次洗滌將洗滌溶液吸進吸出5次。各位點最后用水洗滌2次去除殘留緩沖液。在各位點加一份0.3μl以50％乙腈0.5％三氟乙酸中配成的sinapinic酸溶液。用激光解吸/離子化飛行時間質譜儀分析各位點上滯留的分析物。(圖32)。
將GST融合受體溶于20mM Tris，100mM氯化鈉，0.4％NP40，pH7.2，取一份0.5μl加到吸附劑陣列正常相部位的一位點上。將只含GST(沒有受體)蛋白的樣品加到另一個位點作為陰性對照。任溶液在此位點上濃縮到接近干燥。在各位點加0.5 mM Tris，50mM氯化鈉，pH7.2。室溫靜置10秒后去除溶液。
立即在各位點加1μl含有文庫(另有96種其它配體)中一種特異性配體溶液。吸附劑陣列在濕潤的培養箱中室溫孵育1小時。各點用2μl異丙醇∶乙腈(1∶2)的30％水溶液洗滌兩次。每次洗滌將洗滌溶液吸進吸出10次。在各點加0.3μl以50％乙腈0.5％三氟乙酸中配成的α-氰基-4-羥基肉桂酸溶液。用用激光解吸/離子化飛行時間質譜儀分析被受體捕獲的配體。
圖33A顯示另含96種其它配體的文庫中一種特異性配體與GST融合受體的結合，它被吸附劑陣列的正常相部位捕獲。圖33B顯示該陪同與同一陣列上作為陰性對照的純GST蛋白不結合。
本發明提供了滯留層析的新材料和新方法。雖然以上給出了具體的實施例，但這些是說明性的而不是限制性的。根據以上說明，許多修改對本領域技術人員來說是顯而易見的。所以，本發明的范圍并不限于以上說明，相反，它是參照后文權利要求限定的，并包括與之對等的全部范圍。
本申請對引用的全部出版物和專利文獻都按照它們各自的內容進行了同等程度的全面的參考。雖然在此引用的大量文獻，但是申請人不認為任何一處參考是覆蓋本發明的“現有技術”。
權利要求
1.一種鑒定受體的配體的方法，它包括a)提供包含吸附有受體的吸附劑的基質；b)在允許受體配體結合的條件下，結合受體與含配體樣品接觸；和c)用解吸譜法檢測被結合的配體。
2.一種檢測含有編碼特異性結合靶吸附劑的多肽的聚核苷酸的基因組件的方法，包括的步驟有a)提供含有靶吸附劑的基質；b)提供展示文庫，其中包含多種不同的基因組件，各種不同的基因組件包含聚核苷酸，聚核苷酸具有一段編碼多肽的核苷酸序列，而且各種不同的基因組件具有展示所編碼的多肽的表面；c)基質與展示文庫在允許多肽與靶吸附劑特異性結合的洗脫條件下接觸，包含多肽的基因組件因此滯留在基質上；d)用解吸譜法檢測滯留在基質上的基因組件。
3.根據權利要求2所述的方法，其中的展示文庫是噬菌體文庫。
4.根據權利要求2所述的方法，其中提供含有吸附劑的基質的步驟包括i)提供含有吸附劑的基質，所述的吸附劑在一種洗脫條件下保留一種靶分析物；和ii)吸附劑與靶分析物在允許靶分析物被吸附劑保留的洗脫條件下接觸，靶分析物因此變成靶吸附劑。
5.根據權利要求2所述的方法，還包括步驟(e)測定編碼多肽的核苷酸序列。
6.根據權利要求2所述的方法，還包括步驟(e)分離滯留的基因組件。
7.根據權利要求2所述的方法，還包括步驟(e)生產多肽。
8.根據權利要求2所述的方法，其中的基質包含(1)結合錨定多肽的吸附劑和(2)至少一種具有展示錨定多肽的表面的靶基因組件和一種靶吸附劑多肽，靶基因組件含有聚核苷酸，聚核苷酸具有編碼靶吸附劑的核苷酸序列，其中的靶基因組件通過錨定多肽與吸附劑結合。
9.根據權利要求2所述的方法，其中的基質包括細胞或細胞膜。
10.根據權利要求2所述的方法，其中的靶吸附劑包含在不同表型細胞間差異表達的多肽。
11.根據權利要求3所述的方法，其中的噬菌體是M13噬菌體。
12.根據權利要求4所述的方法，其中的靶分析物是靶多肽，其中的步驟ii)接觸吸附劑包括通過體外翻譯編碼靶多肽的聚核苷酸，在吸附劑上原位生成靶多肽。
13.根據權利要求5所述的方法，其中的測序步驟包括在基質上原位擴增聚核苷酸序列。
14.根據權利要求7所述的方法，其中的生產步驟包括增殖滯留的展示多肽的基因組件。
15.根據權利要求7所述的方法，包括由表達載體表達多肽，表達載體含有與編碼多肽的核苷酸序列操作性連接的表達調控序列。
16.根據權利要求7所述的方法，還包括生產含有含多肽吸附劑的基質。
17.根據權利要求8所述的方法，其中的至少一種靶基因組件選自一個靶展示文庫，在該文庫中篩選結合至少一種初始靶分析物的基因組件，其中的吸附劑包含初始靶分析物。
18.根據權利要求11所述的方法，其中的多肽是單鏈抗體。
19.根據權利要求12所述的方法，其中的靶多肽是通過體外翻譯編碼靶多肽的聚核苷酸原位產生的。
20.根據權利要求14所述的方法，其中的增殖步驟是在基質上原位進行的。
21.根據權利要求19所述的方法，其中編碼靶多肽的聚核苷酸是通過體外轉錄原位產生的。
22.一種用于解吸譜法的基質，它包含結合展示在基因組件表面的錨定多肽的吸附劑，其中基因組件的表面還展示靶多肽，其中的基因組件包含聚核苷酸，聚核苷酸具有編碼靶多肽的核苷酸序列。
23.根據權利要求22所述的基質，其中的基因組件是M13噬菌體。
24.根據權利要求22所述的基質，其中的錨定多肽是與基因III蛋白的融合多肽，靶多肽是與基因VIII蛋白的融合多肽。
25.一種含有吸附劑的基質，所述的吸附劑含有特異性結合靶分析物的多肽，所述多肽由權利要求33所述的方法鑒定。
26.根據權利要求25所述的基質，其中的多肽是單鏈抗體。
27.一種檢測聚核苷酸翻譯的方法，它包括a)提供用于解吸譜法的含有吸附劑的基質；b)將基質與編碼多肽的聚核苷酸并與體外翻譯聚核苷酸所需物質接觸，由此產生多肽；c)基質接觸洗脫劑，使得多肽被吸附劑保留；和d)用解吸譜法檢測滯留的多肽；多肽的檢測提供了檢測聚核苷酸的方法。
28.一種方法，包括的步驟有a)第一樣品與原吸附劑和洗脫劑接觸，使得第一分析物被吸附劑保留，用解吸譜法檢測被吸附的分析物，滯留的第一分析物因此變成第二吸附劑；b)第二樣品與第二吸附劑和洗脫劑接觸，使得第二分析物被第二吸附劑保留，用解吸譜法檢測被吸附的第二分析物，滯留的第二分析物因此變成第三吸附劑。
29.根據權利要求28所述的方法，還包括對下一份或多份樣品重復步驟(b)至少1次。
30.一種測定物質是否調節靶分析物與吸附劑之間結合的篩選方法，包括的步驟有a)提供含有吸附劑的基質，靶分析物在洗脫條件下與所述吸附劑結合；b)基質與靶分析物和物質在允許靶分析物與吸附劑結合的條件下接觸；c)用解吸譜法檢測靶分析物與吸附劑之間的結合量；d)確定測得的量是否與當基質與靶分析物在無物質洗脫條件下接觸時的對照結合量不同；測得量與對照量之間的差異說明物質調節結合。
31.根據權利要求30所述的方法，其中的吸附劑包含特異性結合靶分析物的配體。
32.根據權利要求30所述的方法，其中的吸附劑包含具有展示多肽配體的表面的基因組件，所述的多肽配體特異性結合靶分析物。
33.根據權利要求30所述的方法，用于篩選制劑組合文庫，包括將文庫中的各種制劑分別與每一種吸附劑接觸。
34.根據權利要求31所述的方法，其中的配體是酶，靶分析物是酶的底物或抑制劑，反之亦然。
35.根據權利要求31所述的方法，其中的配體是激素，靶分析物是該激素的細胞表面受體或胞內受體，反之亦然。
全文摘要
本發明提供了用滯留層析分辨樣品中分析物的方法。該方法涉及在多種選擇性條件下讓分析物吸附于基質上,和用解吸譜法檢測滯留在基質上的分析物。這些方法可用于生物學和醫藥學,包括臨床診斷和藥物開發。
文檔編號G06F19/00GK1266538SQ98808083
公開日2000年9月13日 申請日期1998年6月19日 優先權日1997年6月20日
發明者T·W·赫琴斯, T·-T·耶 申請人:賽弗根生物系統股份有限公司