專利名稱：用微球體包埋活組織細胞的制作方法
技術領域：
本發明領域屬于微球體包埋活組織細胞。一種已知的合成無定型硅膠微球的方法包括在一個容器里放入一種有機硅前體和強酸溶液以及用溶劑化物諾丹明從無定型硅膠微球上洗去多余的有機硅前體的步驟。有機硅前體和強酸溶液是不混溶的。合成無定型硅膠微球的方法還包括加入一種選自諾丹明-6G、-B、銪3+、熒光素、香豆素-120、香豆素-314T、硫堇、鈾、和鈾敏感的銪的摻雜物，攪拌有機硅前體和強酸溶液，在強酸溶液中形成有機硅前體滴液，其中強酸溶液中的水水解有機硅前體滴液形成無定型硅膠微球，并且用一種溶劑洗滌除去多余的有機硅前體。產物呈熒光性。
在另一個已知的方法中，活的動物組織細胞和微生物細胞，例如，酵母細胞被包埋在由有機硅制備的無機的膠中。組織細胞的包埋是通過用一種有機硅前體與一種強酸水溶液混合，水解有機硅前體而提供一種成膠液，冷卻成膠液，形成一種活組織細胞和亨克氏平衡鹽溶液的混合物，堿液加入到成膠液，隨后，立刻將含有組織細胞的混合液加入成膠液中，然后，把產物混合物倒入一種容器中形成一種無機膠包埋的組織細胞。有機硅前體可以是四乙氧基硅烷、四丁氧基硅烷、四甲氧基硅烷、或四丙氧基硅烷。微生物細胞的包埋采用的是類似的方法，其中成膠液的制備是采用把一種鹼加入到用濃酸水溶液水解有機硅產生的溶液中得到的，微生物細胞的分散液與成膠液混合，將產生的混合物倒進一個容器中形成一種無機膠包埋的微生物細胞。
本發明總的來說涉及微球體包埋活組織細胞的方法。用許許多多微球體包埋活組織細胞的這種方法包括的步驟有一種有機金屬前體和一種水解液混合形成成膠液；活組織細胞和鹽溶液混合，形成一種含有活組織細胞的溶液；含有活組織細胞的溶液和成膠液混合，形成一種一定比重的混合物。
本發明第一個獨立的方面，是本方法也包括混合物在一個含有一種油的容器中混合的步驟，攪拌混合物形成許多的微球，而每個微球都包埋著一些活組織細胞。這種油與混合物是不相溶的，它的比重與混合物相比較低。
本發明的第二個獨立的方面，這種方法也包括將混合物形成滴液；和將滴液放入一種有油的柱子中的步驟。這種油和混合物是不相溶的，油與混合物相比它的比重較低，在混合物其頂部形成許多微球，而每個微粒體包埋著一些活組織細胞。
本發明的第三個獨立的方面，有機硅前體是選自四乙氧基硅烷、四丁氧基硅烷、四甲氧基硅烷和四丙氧基硅烷所組成的一組有機硅。
本發明的第四個獨立的方面，所指的活組織細胞是來自一種動物。
本發明的第五個獨立的方面，所指的活組織細胞是來自一種植物。
本發明的第六個獨立的方面，所指的活組織細胞是來自真菌。
本發明的第七個獨立的方面，所指的活組織細胞是來自細菌。
用這種包埋活組織的方法創造了一種新的藥物投送系統，能使活的分泌治療化合物的細胞移植在體內，而勿需免疫抑制。陶瓷材料(無機非金屬)可以用于包埋能分泌治療藥物，而且被移植在寄主(病人)體內摸擬真實的器官投送治療藥物的活組織細胞。
為提高或完成所需要的結果，活組織可通過遺傳工程進行改造。陶瓷材料孔隙的大小要足以使治療的藥物分子通過，但孔隙又要足以使移植的細胞與寄主的免疫系統分隔開。非有機的包埋材料在生物學上是惰性的，可減少免疫或自體免疫響應的風險。
通過參照如下詳細的描述，其它方面以及伴隨的許多優點會更容易看出，同樣也更容易被理解。
本發明被認為是新穎的一些特征在附后的權利要求中予以陳述。


；圖1．是一個容器和一個攪拌棒的側視圖。容器中含有一種油和按照本發明第一個實施方案由活組織細胞的溶液與成膠液形成的混合物的混合物。
圖2．是滴加器和油柱的側視圖。其油柱中含有按照本發明第二個實施方案由活組織細胞的溶液與成膠液形成的混合物的混合物。
優選的實施方案的詳細描述一種合成溶膠包埋活組織細胞的方法，包括在第一個容器放入一種有機金屬前體和一種水解液，攪拌溶液直到溶液變清，清液在冰浴中冷卻，在第二個容器中放入活組織細胞和平衡的鹽溶液形成一種組織溶液的步驟。
收獲活組織細胞。活組織細胞放入一種平衡鹽溶液中形成一種組織溶液。用于人細胞的溶液可以是普通的醫用鹽水溶液。用于包埋活細胞的鹽濃度需要充分平衡以免細胞破碎。U．S．專利No．4，797，213在第六列第10行給出所使用亨克氏平衡鹽溶液。活組織細胞可以來自一種植物、一種動物、細菌、真菌或者酵母。
有機金屬前體可以是一種有機硅前體，水解液可以是摩爾濃度在0．05至2．5范圍的一種強酸。本方法也包括加一種分子濃度在0．05至2．5范圍的鹼溶液到清溶液中。隨后，立刻把組織溶液加入清溶液和鹼溶液中，攪拌清液、鹼液和組織溶液，形成成膠液，處理該成膠液，得到無機膠包埋活組織細的所需要物理結構。溶液加鹼充分中和避免在極端pH下細胞破損。
有機硅前體可以選自四乙氧基硅烷、四丁氧基硅烷、四甲氧基硅烷、四丙氧基硅烷、和甲基三甲氧基硅烷。
有機金屬前體可以選自三-正-丙氧基鋁、三仲丁氧基鋁、乙酰乙酸酯螯合二仲丁氧基鋁、三仲丁氧基鋯、丁氧基硼、甲氧基硼、丁氧基鈦(iv)、異丙氧基鈦和異丙氧基鋯。強酸選自由硝酸和鹽酸。其它可被使用的強酸包括硫酸。在優選的實施方案中，鹼溶液是氫氧化鋁。請參閱C．J．Brinker，Journalof Non-Crystaline Solutions，volume48，page48 and volume63，page45．由Jeffrey W．Pollard和John M．Walker編輯的在位于Clifton New Jersey的Humana出版社出版的題目為動物細胞培養一書的第十三章141頁描述亨克氏平衡液。
根據K．Lindsey編輯和由Humana出版社出版的題目為植物組織培養手冊原理和應用。可以從磨碎的葉子的碎片中得到一種植物組織細胞，將這種葉子的碎片放入平衡鹽溶液中形成植物組織溶液。
由Jeffrey W．Pollard和John M．Walker編輯的位于Clifton的New JerseyHumana出版社出版的題目為“動物組織細胞培養”一書的第十三章141頁也描述了一種動物組織細胞的制備。
從包括人在內的哺乳動物的肝、胰、甲狀腺、甲狀旁腺、腦垂體腺體、腎皮質可以獲得一種動物的組織細胞。包埋這些組織細胞其中之一的一種溶膠可以用于一種人造器管，例如，一種人造肝臟或一種人造胰臟。
例如，已從牛肝(牛的肝細胞)獲得活的動物組織細胞。將牛肝切成小塊是分散活的動物組織細胞的標準程序。取大約10克小塊的牛肝放入60毫升的亨克氏平衡鹽溶液中放置半小時，目的是為了從牛肝除去血紅蛋白。除去亨克氏平衡鹽溶液。40毫克的膠原酶和60毫克的中性蛋白酶溶解于亨克氏平衡鹽溶液。中性蛋白酶和膠原酶是酶。搖動亨克氏平衡鹽溶液半小時，沉淀后成為一種組織溶液。組織溶液是一種有單個的活肝細胞分散在其中的上清液。本發明人已經用一種有機膠包埋了肝細胞。
U．S．專利No．5，270，192給出一種肝細胞反應器，一種生物人工肝，它包括一個具有注入口和注出口的保護外殼，一種基質填充在保護外殼中，以便截留保護外殼內的肝細胞聚集物，同時允許基質流動。
U．S．專利No．4．391．909給出組織細胞如胰島郎罕氏細胞或肝細胞，它們被包埋在一種用分子量大于3000的多聚物與有酸性基團的多糖交聯的一種球形的半滲透膜中。在微膠粒中的細胞是能生存的，健康的，具有生理活性、有進行代謝的能力。包埋的細胞可被移植在哺乳動物體內，以產生活體組織中該細胞特有的物質和化學變化。本發明人用一種有機膠已經包埋了胰島郎罕氏細胞。
U．S．專利No．5．166．058給出了純化了的BMP-2蛋白質可以用于骨和軟骨缺欠，傷口醫治和有關組織修復治療。對于骨和／或軟骨的形成，包括一種具有投送BMP-2A、BMP-2B或其它的BMP蛋白質到骨質和／或軟骨損傷的能力的基質的組合物，為骨和軟骨的發育提供一種結構，而且可任選地被吸收進體內，這樣的基質目前使用的材料可以形成可用于其它的編碼骨誘誘導蛋白質的移植醫用DNA序列的應用。基質材料的選擇要根據生物性、生物降解性、機械性、外觀裝飾性、界面的性質而定。BMP-2的特定應用決定合適的配方。用于這種組合物的潛在的基質可以是生物可降解的和化學上確定的硫酸鈣、三磷酸鈣、羥基磷灰石、聚乳酸和聚酐。其它潛在的材料是生物可降解的，而且生物學上已確切表征的，例如，骨骼或者表皮膠原。其它的基質是由純蛋白質或細胞外的基質成份組成。其它潛在的基質是非生物降解的和化學上確定的，諸如，燒結的羥基磷灰石、生物玻璃、鋁酸鹽或其它的陶瓷。基質可以包含上述類型材料的任何的組合，例如，聚乳酸和羥基磷灰石、或者膠原和三磷酸鈣。生物陶瓷在其組成可能改變，例如，鈣-鋁酸鹽-磷酸鹽，和在加工過程中進行改變，以改變孔的大小、顆粒大小、顆粒的形狀和可生物降解的能力。根據改變BMP-2蛋白質作用的各種因素，即，希望形成的骨骼的重量，骨骼損傷的部位，骨損傷的狀況，受傷的程度，損傷組織類型，病人的年令、性別和飲食，任何嚴重的感染，給藥時間以及其它的臨床因素，由醫生決定用量方式。用藥量可隨組合物中BMP蛋白質的類型和用于重新構成的基質類型來改變。在終組合物中已知的生長因子，如；IGFI(類胰島素生長因子I)的加入也可影響用藥量。
U．S．專利No．5，453，368的生物物質包括PC-12細胞，該細胞在標準RPMI培養基中培養，用移液管取出細胞放入離心管中，然后離心沉淀細胞。將這些細胞稀釋至2毫升，細胞濃度大約為每毫升2×106～5×106。含有液體的細胞被放入無菌Hamilton注射器中，而且放在一個注射泵Harvard裝置上。泵是通過規格為18的聚四氟乙烯管連接到一種規格為24的不銹鋼管上，它作為液體滴加的一種裝置。用1．5％藻朊酸鈉溶液(W／V)制備含有牛腎上腺嗜鎘細胞的微膠囊。PBS收集浴容器含有1．5％氯化鈣。培養六周后，微膠囊含有活的細胞。
用上述的方法，在硅膠中成功地包埋了下列細胞，而且保持其活性。真菌釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae顯毛金藻Phanerochaete chrysosporium植物
熱半月孢囊(光合作用海藻)Pyrocystis lunula(photosyntheticmarine)紅蘋果地面復蓋葉細胞(從磨碎葉的懸浮液中提取的含有葉綠體的細胞)Red apple ground cover leaf cells(individual chlorophyl-containing cells extracted from supematent of ground leaves)細菌磷發光細菌(生物發光的海洋細菌)Photobacterium phosphoreum(bioluminescent marine bacteria)，嗜砷地螺旋菌Geospirillum arsenophiluf(MIT-13)，鹽生鹽桿菌Halobacterium halobium．動物鼠胰島郎格罕氏細胞Murine islets of Langerhans，豬胰島郎格罕氏細胞Porcine islets of Langerhans，牛肝細胞Bovine hepatocytes，豬肝細胞Porcine hepatocytes，人白血球細胞Human white blood cells，人紅血球細胞Human red blood cells，大鼠PC-12細胞(來自嗜鉻細胞瘤)Rat PC-12cells(from ratpheochromocytoma)，Lac-z轉染鼠間質干細胞(基因工程哺乳動物組織細胞)Lac-ztransfected murine mesenchymal stem cells(genetically engineedmammalian tissue cells)，大鼠成纖維細胞Rat fibroblasts，人成纖維細胞Human fibroblasts，人骨肉瘤細胞Human osteosarcoma cells，中國倉鼠卵巢細胞Chinese hamster ovarian(CHO)cells．圖1．所涉及的是公開的一種用微球體包埋活組織細胞的方法。本方法是用許多微球包埋活的組織細胞，它包括有機金屬前體和水解液混合形成成膠液；活組織細胞和鹽溶液混合形成含有活組織細胞的溶液；含有活組織細胞的溶液和成膠液混合形成一種一定比重的混合物。活組織細胞可以是來自一種動物或來自一種植物。本方法也包括混合物在含有油12的容器11中混合，然后用攪棒13攪拌混合物，形成許多微球體14。每個微球體14包埋著一些活的組織細胞。油12與混合物是不相混溶的，它的比重與混合物的比重相比較輕。有機金屬前體可以是一種有機硅前體。有機硅前體可以從四乙氧基硅烷、四丁氧基硅烷、四甲氧基硅烷和四丙氧基硅烷一組中挑選。
圖2．所涉及的是公開的一種用微球體包埋活組織細胞的方法。本方法用許多微球包埋活的組織細胞，包括，有機金屬前體和水解液混合形成成膠液；活的組織細胞和鹽溶液混合形成含有活細胞的溶液和含有活的組織細胞的溶液與成膠液混合形成一定比重的混合物。活組織細胞可以是來自一種動物或來自一種植物。該方法也包括混合物形成滴液和將滴液加入到一種含有油112的一個柱11l中的步驟。油112與混合物是不相混溶的，其比重低于混合物的比重，在頂部的位置形成許多微球，每個微球114包著一些活組織細胞。有機金屬前體可以是一種有機硅前體。有機硅前體可以從四乙氧基硅烷、四丁氧基硅烷、四甲氧基硅烷和四丙氧基硅烷組成的一組中挑選。
從前述部分可以看出，用一種溶膠包埋一種有活性的生物材料，包括已經給以描述過的動物和微生物的組織細胞。因此，前述的公開將被認為僅僅是對本發明原理的一種解釋。
權利要求
1．用許多微球包埋活組織細胞的方法包含a．使一種有機金屬的前體和一種水解液組合形成一種成膠液；b．使活組織細胞和一種鹽溶液組合形成含有活組織細胞的一種溶液；c．使從b步驟得到的含有活組織細胞的溶液與從a步驟得到的成膠液組合形成一種一定比重的混合物；d．將c步驟產生的混合物混入與c步驟產生的混合物不相溶的，比重小于從c步驟產生的混合物的一種油中，形成許多包埋著一些所說的活組織細胞的微球。
2．根椐權利要求1所述的方法，混合步驟包括將這種油和步驟c得到的混合物進行攪拌。
3．根椐權利要求1所述的方法，混合步驟包括將c步驟產生的混合物形成滴液和將滴液滴入油柱頂部。
4．根椐權利要求1、2或3所述的方法，在有機金屬前體和水解液相組合的步驟中，該有機金屬前體是有機硅前體。
5．根椐權利要求4所述的方法，該有機硅前體選自四乙氧基硅烷、四丁氧基硅烷、四甲氧基硅烷和四丙氧基硅烷。
6．根椐權利要求1、2或3的方法，該方法還包含e．由步驟b產生的含有活組織細胞的溶液與成膠液組合之前，由步驟a產生的成膠液與一種鹼組合，以充分中和成膠液，避免極端pH損傷活組織細胞。
全文摘要
一種用許多微球包埋活組織細胞的方法,包括:有機金屬前體和水解液混合形成成膠液;活組織細胞和鹽溶液混合形成含有活組織細胞的一種溶液;產生的含有活組織細胞的溶液和產生的成膠液混合形成一定比重的混合物。用許多微球包埋活組織細胞的方法,也包括:將混合物混入一個含有一種油的容器,而且攪拌混合物形成許多微球,每一微球包埋著活組織細胞。這種油和混合物是不相溶的,而且比重低于混合物。
文檔編號C09K11/06GK1292816SQ98810291
公開日2001年4月25日 申請日期1998年8月14日 優先權日1997年8月18日
發明者愛德華·J·A·波普 申請人:索爾基因醫療有限公司