專利名稱：一種箱式活細胞培養實時記錄系統的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種活細胞培養觀測裝置，特別涉及一種箱式活細胞培養實時記錄系統。
背景技術：
細胞培養實時記錄已成為研究細胞及其相關學科，尤其是干細胞研究的重要實驗技術手段之一，對細胞生長、分裂、分化、轉化、應激反應、信號傳導、調節控制、衰老、凋亡、 損傷、壞死等表象及其機理探索具有直觀、易控、便捷的優勢。目前市面上所見的細胞培養實時記錄多為采用微環境控制系統與倒置顯微鏡系統的組合，盡管其成像精度無可厚非，但其存在兩大先天缺憾1、微環境控制系統為滿足顯微鏡載物臺及顯微鏡光路的需求多采用半開放式設計，對實驗室環境的要求較高，對細胞的生長支持及其長期穩定性并不盡如人意，培養細胞生長穩定性與常規實驗室用二氧化碳培養箱存在不小差距。2、盡管通過顯微鏡光路可獲得高清晰度圖像，且有多級光學放大倍率選擇。但受顯微鏡頭及光路系統限制只能同時對單個視野進行成像記錄，不可能同時對平行實驗觀察的多個視野進行成像記錄。而采用定時掃描成像方式則會因反復多次機械掃描運動誤差疊加產生圖像位移及焦點漂移。即使利用價格高昂的精密掃描和自動焦面控制裝置仍需通過軟件對圖像進行校正，大幅增加系統構成的復雜性和價格，同時給系統運行穩定性留下隱患。公布號為CN101776613的中國專利公開了一種基于光纖圖像傳輸的培養箱內細胞實時觀察方法及裝置，通過內窺鏡傳像系統、傳光系統與顯微鏡位移微調裝置實現了對培養箱里細胞生長形態的實時觀測與記錄，該裝置存在以下缺點1、顯微鏡位移微調裝置采用齒輪傳動的方式實現，該位移微調裝置體積較大，不適用多鏡頭組合的應用，且存在多級齒輪傳動過程中復雜的力矩轉換所帶來的同步及摩擦問題。2、采用單光路掃描成像，細胞生長圖像質量較低，存在攝像視野隨掃描進程漂移及平行樣本成像所存在的時間同步性等問題。3、傳光系統裸露在培養箱內，易被培養箱內高溫、高濕、微酸環境所腐蝕。

發明內容
為了克服現有技術的不足，本發明的目的是提供一種能實現多鏡頭組合，并且可靠性好的箱式活細胞培養實時記錄系統。本發明的目的通過以下技術方案實現一種箱式活細胞培養實時記錄系統，其特征在于，包括培養箱、暗視場聚光鏡、培養板支架、顯微成像裝置、光源、電源、計算機，所述暗視場聚光鏡、培養板支架和顯微成像裝置由上至下依次排列安裝在培養箱內；所述光源、電源、計算機位于培養箱外；所述光源通過光纖與暗視場聚光鏡連接； 所述電源通過電源線分別與光源、顯微成像裝置連接；所述計算機通過數據線分別與光源、 顯微成像裝置連接；
所述顯微成像裝置包括顯微成像頭和油壓頂推調焦裝置。更具體地，所述顯微成像頭包括顯微物鏡、成像裝置和圖像傳感器芯片；所述顯微物鏡、成像裝置和圖像傳感器芯片由上至下依次排列，密封于內筒中；所述成像裝置位于所述顯微物鏡的后焦面上；所述圖像傳感器芯片置于所述成像裝置的后焦面上。更具體地，所述油壓頂推調焦裝置進一步包括外筒，導油管、油路轉換器、熱交換器、蠕動泵、第一密封圈、第二密封圈和第三密封圈；所述外筒套于所述內筒的外部，所述內筒的兩端伸出外筒；所述第一密封圈和第二密封圈分別固定于所述外筒的上下端，均可相對于內筒上下滑動；所述第三密封圈固定于內筒的中部，可相對于外筒上下滑動；所述第一密封圈、第三密封圈、內筒、外筒圍成的空間為上油壓室；所述第三密封圈、第二密封圈、 內筒、外筒圍成的空間為下油壓室；所述外筒上靠近第一密封圈的位置設有兩個開孔，外筒上靠近第二密封圈的位置設有兩個開孔，四個開孔分別經過導油管與油路轉換器連接，所述油路轉換器用于控制上油壓室和下油壓室的油量變化；所述熱交換器與油路交換器連接，所述蠕動泵與熱交換器連接，所述蠕動泵通過熱交換器為上下油壓室提供循環制冷。優選地，所述成像裝置為成像目鏡或光纖錐形耦合器。優選地，所述圖像傳感器芯片為CXD圖像傳感器芯片或CMOS圖像傳感器芯片。優選地，所述培養箱為二氧化碳培養箱。優選地，所述顯微成像裝置為兩個或兩個以上。優選地，所述光源為藍光光源。本發明相對于現有技術具有以下優點和效果1、采用實驗室廣泛應用二氧化碳培養箱可穩定長期培養細胞之特性，保障被觀測細胞獲得更長期的穩定培養生長記錄周期。 2、顯微成像裝置的光學部件處于密封狀態，克服了培養箱內高溫、高濕、微酸環境對光學部件的腐蝕。3、采用油壓頂推調焦裝置實現自動調焦，由于油壓頂推調焦裝置具有體積小、結構簡單、便于密封的特點，更適合實現多鏡頭組合的應用；油壓頂推調焦裝置還具有制冷的功能，降低了工作溫度，提高了圖像傳感器芯片的信噪比，從而提高了圖像質量。4、采用多鏡頭組合，同時采集多點圖像，克服了掃描式多點圖像采集帶來的系統復位差和時間延遲差的現象。


圖1為單通道光路箱式活細胞培養實時記錄系統的示意圖。圖2為本發明的顯微成像裝置的示意圖。圖3為本發明的顯微成像頭的示意圖。圖4為三通道光路箱式活細胞培養實時記錄系統的示意圖。圖5為六通道光路箱式活細胞培養實時記錄系統的示意圖。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖，對本發明作進一步地詳細說明，但本發明的實施方式不限于此。實施例如圖1所示，單通道光路箱式活細胞培養實時記錄系統包括二氧化碳培養箱11、暗視場聚光鏡12、培養板支架13、顯微成像裝置14、藍光光源15、電源16、計算機17。暗視場聚光鏡12、培養板支架13和顯微成像裝置14由上至下依次排列安裝在二氧化碳培養箱11內；藍光光源15、電源16、計算機17位于培養箱11外；藍光光源15通過光纖與暗視場聚光鏡12連接；電源16通過電源線分別與藍光光源15、顯微成像裝置14連接；計算機17通過數據線分別與藍光光源15、顯微成像裝置14連接。如圖2所示，顯微成像裝置14包括顯微成像頭141和油壓頂推調焦裝置142。如圖3所示，顯微成像頭141包括顯微物鏡1411、成像目鏡1412、CXD圖像傳感器芯片1413 ； 顯微物鏡1411、成像目鏡1412和CXD圖像傳感器芯片1413由上至下依次排列，密封于高強度硬質塑料內筒1414內；成像目鏡1412置于顯微物鏡1411的后焦面上；CXD圖像傳感器芯片1413置于成像目鏡1412的后焦面上。顯微物鏡1412可選用IOX顯微物鏡、20X顯微物鏡、40X顯微物鏡、Ieica水鏡中的任一種；成像目鏡1412可選用0. 5X成像目鏡、1.0X成像目鏡的任一種。如圖2所示，油壓頂推調焦裝置包括高強度硬質塑料外筒1421、導油管1422、油路轉換器1423、熱交換器1424、蠕動泵1425、第一密封圈1426、第二密封圈1427和第三密封圈14 ；外筒1421套于顯微成像頭141的外部，內筒1414兩端伸出外筒1421 ；第一密封圈 1426和第二密封圈1427分別固定于外筒1421的上下端，均可相對內筒1414上下滑動；第三密封圈14 固定于內筒1414的中部，可相對于外筒1421上下滑動；第一密封圈1似6、第三密封圈1428、內筒1414、外筒1421圍成的空間為上油壓室；第三密封圈1428、第二密封圈1427、內筒1414、外筒1421圍成的空間為下油壓室；外筒1421上靠近第一密封圈1似6 的位置設有兩個開孔，外筒1421上靠近第二密封圈1427的位置設有兩個開孔，四個開孔分別經過導油管1422與油路轉換器1423連接；熱交換器14M與油路交換器1423連接，蠕動泵1425與熱交換器1似4連接。油壓頂推調焦裝置142的工作過程如下當顯微物鏡1411需要上移時，油路轉換器1423通過導油管1422增加下油室的油量，同時上油室的油量減少，第三密封圈14 上移，帶動內筒1414上移，達到顯微物鏡1411上移的目的；蠕動泵1425通過熱交換器1似4 為上、下油壓室提供循環制冷，降低工作溫度，減小CCD圖像傳感器1413的暗電流，提高信噪比，從而提高圖像質量。單通道光路箱式活細胞培養實時記錄系統的工作過程如下(1)將目標細胞按不同的研究觀察目的配制相應的培養體系，分配到1到6孔標準細胞培養板內；(2)將培養板置于二氧化碳培養箱11內的培養板支架13上；(3)開啟并調節二氧化碳培養箱11相關培養環境參數，提供長期穩定的細胞培養環境條件；(4)藍光光源15通過暗視場聚光鏡12垂直照射到培養板孔內培養生長中的細胞體系；可根據需要調節藍光光源15的強度；(5)通過油壓頂推調焦裝置142調焦，細胞培養板的圖像由顯微物鏡1411、成像目鏡1412傳輸至CXD圖像傳感器芯片1413 ；(6)CXD圖像傳感器芯片1413對圖像進行采集和存儲后，通過數據線傳至計算機 17 ；(7)計算機17通過控制軟件控制系統光源、圖像焦點調節、圖像采集時點設置、實施圖像的采集與存儲；單通道圖像分析軟件根據細胞生長運動特性橫向提取觀測范圍內細胞數量、大小、形態、灰度積分、位置等參量，縱向比較各參量隨時間向量的變化。實施例2如圖4所示，三通道光路箱式活細胞培養實時記錄系統含有三個顯微成像裝置 M、三個暗視場聚光鏡22，此例中成像裝置采用光纖錐形耦合器M12，圖像傳感器芯片采用CMOS圖像傳感器芯片M13，除上述部件外，本實施中的系統的其他部件均與實施例1中相同。本例中各成像光路具有相對獨立性。光纖錐形耦合器的光能耦合效率與成像目鏡相比耦合效率可提高1-1. 5個數量級，可獲得質量更高的圖像。本實施例的三通道光路箱式活細胞培養實時記錄系統的工作過程如下(1)將目標細胞按不同的研究觀察目的配制相應的培養體系，分配到1到6孔標準細胞培養板內；(2)將培養板置于二氧化碳培養箱21內的培養板支架23上；(3)開啟并調節二氧化碳培養箱21相關培養環境參數，提供長期穩定的細胞培養環境條件；(4)藍光光源25通過暗視場聚光鏡22垂直照射到培養板孔內培養生長中的細胞體系；可根據需要調節藍光光源25的強度；(5)通過油壓頂推調焦裝置調焦M2，細胞培養板的圖像由顯微物鏡Mil、光纖錐形耦合器M12傳輸至CMOS圖像傳感器芯片M13 ；(6)CMOS圖像傳感器芯片M13對圖像進行采集和存儲后，通過數據線傳至計算機 27 ；(7)計算機27通過控制軟件分別控制各個成像光路的系統光源、圖像焦點調節、 圖像采集時點設置、實施三光路圖像的同步實時采集與存儲；多道圖像分析軟件在單道圖像分析軟件對各通道圖像獨立分析的基礎之上，通過平行綜合比對分析實現針對不同培養體系細胞的同步動態比對分析。實施例3如圖5所示，六通道光路箱式活細胞培養實時記錄系統含有六個顯微成像裝置 34，六個暗視場聚光鏡32，除上述部件外，本實施例中的其余部件均與實施例2相同，其工作過程也與實施例2相同，此處不再贅述。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受所述實施例的限制；其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 如系統可增添自動加注系統、場效應系統、光效應系統等，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種箱式活細胞培養實時記錄系統，其特征在于，包括培養箱、暗視場聚光鏡、培養板支架、顯微成像裝置、光源、電源、計算機，所述暗視場聚光鏡、培養板支架和顯微成像裝置由上至下依次排列安裝在培養箱內；所述光源、電源、計算機位于培養箱外；所述光源通過光纖與暗視場聚光鏡連接；所述電源通過電源線分別與光源、顯微成像裝置連接；所述計算機通過數據線分別與光源、顯微成像裝置連接；所述顯微成像裝置包括顯微成像頭和油壓頂推調焦裝置。
2.根據權利要求1所述的一種箱式活細胞培養實時記錄系統，其特征在于，所述顯微成像頭包括顯微物鏡、成像裝置和圖像傳感器芯片；所述顯微物鏡、成像裝置和圖像傳感器芯片由上至下依次排列，密封于內筒中；所述成像裝置位于所述顯微物鏡的后焦面上；所述圖像傳感器芯片置于所述成像裝置的后焦面上。
3.根據權利要求1所述的一種箱式活細胞培養實時記錄系統，其特征在于，所述油壓頂推調焦裝置進一步包括外筒，導油管、油路轉換器、熱交換器、蠕動泵、第一密封圈、第二密封圈和第三密封圈；所述外筒套于所述內筒的外部，所述內筒的兩端伸出外筒；所述第一密封圈和第二密封圈分別固定于所述外筒的上下端，均可相對于內筒上下滑動；所述第三密封圈固定于內筒的中部，可相對于外筒上下滑動；所述第一密封圈、第三密封圈、內筒、 外筒圍成的空間為上油壓室；所述第三密封圈、第二密封圈、內筒、外筒圍成的空間為下油壓室；所述外筒上靠近第一密封圈的位置設有兩個開孔，外筒上靠近第二密封圈的位置設有兩個開孔，四個開孔分別經過導油管與油路轉換器連接，所述油路轉換器用于控制上油壓室和下油壓室的油量變化；所述熱交換器與油路交換器連接，所述蠕動泵與熱交換器連接，所述蠕動泵通過熱交換器為上下油壓室提供循環制冷。
4.根據權利要求2所述的一種箱式活細胞培養實時記錄系統，其特征在于，所述成像裝置為成像目鏡或光纖錐形耦合器。
5.根據權利要求2所述的一種箱式活細胞培養實時記錄系統，其特征在于，所述圖像傳感器芯片為CXD圖像傳感器芯片或CMOS圖像傳感器芯片。
6.根據權利要求1所述的一種箱式活細胞培養實時記錄系統，其特征在于，所述培養箱為二氧化碳培養箱。
7.根據權利要求1所述的一種箱式活細胞培養實時記錄系統，其特征在于，所述顯微成像裝置為兩個或兩個以上。
8.根據權利要求1所述的一種箱式活細胞培養實時記錄系統，其特征在于，所述光源為藍光光源。
全文摘要
本發明提供一種箱式活細胞培養實時記錄系統，包括培養箱、暗視場聚光鏡、培養板支架、顯微成像裝置、光源、電源、計算機，所述顯微成像裝置包括顯微成像頭和油壓頂推調焦裝置。本發明實現了對培養箱內的細胞進行實時觀測，不需要將活細胞取出培養箱內進行觀測，同時可使用多鏡頭組合采集圖像，提高了圖像的質量及實現針對多個不同培養體系細胞的同步實時動態記錄分析。
文檔編號C12M3/00GK102174396SQ20111004791
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月2日 優先權日2011年3月2日
發明者廖繼東 申請人:暨南大學