專利名稱：:與基于細胞的療法相關的材料和方法
技術領域：
：本發明涉及提供新型細胞群，其可用于與細胞變性或年齡相關的組織變化相關的疾病狀態的組織再生和治療。具體地，但不限于，本發明提供了由確定新型細胞群而產生的材料和方法，該新型細胞群表現出分化成胰腺細胞類型和肝細胞類型的雙潛能。
背景技術：
：干細胞是非特化細胞，其具有在培養物中長期增殖的能力并可被誘導從而變成特化的細胞類型。干細胞主要可以從胚胎或成體中分離，但這些細胞表現出不同的性質和功倉泛。干細胞已從許多哺乳動物物種的胚胎(胚胎的/胚胎干細胞-ESC)中分離出來。二十多年來，來自小鼠的胚胎干細胞是人們集中研究的對象，并為人ESC的分離鋪平了道路，自1998年以來已經實現了人ESC的分離和研究。ESC典型地來源于胚胎的胚泡(blastocyst)，它們在體內繼續產生所有隨后發育的細胞類型。另一方面，成體干細胞(ASC)存在于許多組織中，它們能夠代替由于創傷和，或，損耗和損傷而損失的細胞。這些細胞具有提供用于治療疾病例如是糖尿病和帕金森病的基于細胞的療法的潛能，在這些疾病中存在導致特定病理的細胞損失和損害。它們也具有用于篩選藥物、毒理學研究、研究發育進程、治療年齡相關的組織缺失和變性的潛能。它們也具有手術切除、創傷后的或作為整容外科手術的一部分的組織再生的潛能。ASC是在成體組織或器官中的分化細胞當中發現的未分化細胞，它們是非特化的并且能夠自我更新，維持分化從而產生組織或器官的主要細胞類型的能力。ASC被認為維持和實現組織修復。成熟組織中成體干細胞的起源是未知的，并且它們的可塑性程度仍有待確定。它們在移植中的應用是眾所周知的。來自骨髓的ASC用于移植已有30余年。成體非HSC的用途、其效能、可塑性和長期隨訪(long-termfollowup)的安全性仍未得到證實。非間質ASC的報道在本領域中仍然存在爭議，但神經干細胞現已得到確認并被認為是一種真正的(bonefide)ASC類型。ECS的被證實的多能性和使它們大量生長的能力使得它們成為有吸引力的基于細胞的療法候選物。在認為ASC稀少并且沒有對于它們的生長條件充分限制以產生用于潛在療法的足夠數量的合適細胞的情況下，ASC的應用受到嚴重限制。但是，ASC確實具有重要的優勢，因為它們可以來源于“自身”，因此任何患者都能接受其自身的細胞，而不需要經受為了防止排斥反應的免疫抑制的有害副作用，包括顯著增大的癌癥風險。有限的效力/可塑性也被認為是提高的安全系數，因為異常的細胞分化會受到限制并且瘤形成的風險降低。肝和胰腺的共同發育起源揭示了這些器官可以共用共同的干細胞/祖細胞群。有相當多的間接證據支持這種假說。外植體實驗已證明表達PdX-1的腹側內胚層在接近心臟中胚層后轉化成(divertedto)肝譜系(hepaticlineage)(Deutsch等人,2001)。在鼠科動物胰腺內的導管區域中也觀察到具有肝細胞特性的細胞。用缺乏銅的食物喂養的小鼠的胰腺會受損傷、腺泡細胞缺失，并且在4-6周之后，觀察到肝卵圓細胞(Rao等人，1986；Rao和Reddy，1995)。此外，已證明，將經受缺乏銅的食物的大鼠中分離的胰腺細胞移植到脾中，通過整合到薄壁組織結構(parenchymalstructure)中并表達成熟肝特異蛋白，在形態和功能上都表現出分化成肝細胞(Dabeva等人，1997)。也已報道，移植到缺乏富馬酰乙酰乙酸酯/鹽水解酶并隨后發生酪氨酸血癥的同系受體中的野生型小鼠胰腺細胞懸浮液導致通過肝功能正常化的供體來源的細胞進行生物化學救護(Wang等人，2001)。此外，成體小鼠胰腺中KGF的轉基因過表達導致胰島內出現肝細胞并伴有胰腺管增生(Krakowski等人，1999b；Krakowski等人，1999a)。已由胰腺導管和胰島細胞表征了幾種推定的胰腺祖細胞(Abraham等人，2004;Cornelius等人，1997;Lechner等人,2002;Ramiya等人,2000)。在體外分化之后，已觀察到這些細胞群之一表達甲胎蛋白和c-Met，這些蛋白通常是由肝細胞表達的蛋白質(Zulewski等人，2001)。近期報道了從人胰腺導管上皮中分離的間充質干細胞群具有胰腺、肝和中胚層分化的潛能(Seeberger等人,2006)。雖然這些細胞可被誘導從而表達Gata4、白蛋白和TAT(酪氨酸氨基轉移酶)，但是無功能評價的報道。本發明人先前已確定了另外的細胞類型，從成年大鼠胰腺導管中分離出的胰腺來源探路細胞(pathfindercell)(TOPC)，其表現出在STZ糖尿病模型中的多潛能和功能效能(Shiels2004;和WO2006/120476，以引用的方式合并在此)。在成年大鼠肝中，推定的干細胞群可在通過化學損傷或部分肝切除術誘導之后被誘導(Petersen等人，1998；Petersen等人,2003)。
發明內容現在依然需要提供可用于基于細胞的療法的細胞群來治療疾病，特別是與細胞變性相關的疾病。糖尿病是此種疾病的實例。胰腺中的胰島素由分泌胰島素的細胞構成。盡管對代替細胞的起源存在爭議，在體內，細胞更新(turnover)被認為是發生于整個生命期間。因此，糖尿病為這種疾病的一個實例，其中與完全起作用的原生細胞(fullyfunctioningnativecell)類似的細胞(特別是自身來源的細胞)的供給提供了治療的重要替代方式。在糖尿病中，與β_細胞類似的細胞的供給(因為它們可以生成胰島素)提供了一種對于疾病重要的基于細胞的療法。考慮到這種和其他疾病，本發明人已從成體胰腺導管中分離出干細胞/祖細胞群來源的細胞亞群。在一些實施方式中，本文提供的細胞亞群是Pdx-1(HUMAN:NP_000200.1GI:4557673；RAT:NP_074043.3G1:50838802)陽性。Pdx-1表達的存在表明細胞具有作為非β-細胞源胰島素的來源的潛能。在一些實施方式中，本文提供的成體干細胞/祖細胞亞群由Thyl.1(⑶90)(HUMAN:NP_006279)的存在或缺乏來表征。下面討論Thyl.1陽性和陰性亞群的性質。1.Thyl.1陽性細胞在維持(非分化)培養基中，Thyl.1陽性細胞亞群為Pdx-1陽性、胰島素陰性和胰高血糖素陰性。當置于胰腺分化培養基中時，Thyl.1陽性細胞群起初表現出成纖維細胞樣形態，然后形成纏結的細胞簇(mattedcellcluster),其最終與親代細胞層分開。所產生的分化的細胞簇為Pdx-1、胰島素和胰高血糖素陽性(圖4，組B)。與本文描述的Thy1.1陽性細胞亞群的出人意料的測定結果是它們至少具有雙潛能。具體地，當具有適當的分化培養基時，Thy1.1陽性細胞能夠分化成胰腺細胞或肝細胞類型。2.Thy1.1陰性細胞在非分化狀態下，Thy1.1陰性細胞群是Pdx-1陽性的，但為胰島素和胰高血糖素陰性。當在分化培養基中生長時，Thy1.1陰性細胞未表現出形態變化，但檢測到胰島素轉錄。因此，Thy1.1陰性群提供了非細胞源胰島素的新來源。因此，在最一般的意義上說，本發明提供了利用多潛能成體干細胞群來源的新型細胞亞群基于細胞的療法來治療老化疾病和病癥的材料和方法，該細胞亞群為Pdx-1陽性。這樣的細胞群提供了用于諸如糖尿病和諸如帕金森病之類的神經退行性障礙的基于細胞的療法的潛能。成體干細胞群(也被稱為祖細胞)可以來源于成體胰腺組織，例如人、大鼠、小鼠、靈長類動物、豬等。該成體組織優選為胰腺組織，但也可以是其他器官來源的組織，如乳腺、骨髓、心臟、肝臟或腎臟。在本發明的一種實施方式中，成體干細胞來源于成體大鼠胰腺，格拉斯哥大學理事會(UniversityCourtoftheUniversityofGlasgow)根據布達佩斯條約(1997),于2005年5月12日將其保藏在歐洲細胞培養物保藏中心(EuropeanCollectionofCellCultures),PortonDown,Salisburyffiltshire,UK,SP40JG，保藏編號為ECACCN0.Q6203。這些細胞在下文中被稱為PDPC(胰腺來源的祖細胞)。如上所述，本發明人還確定了與標記物Thyl.1(⑶90)(HUMAN:NP_006279)有關的兩個另外的亞群。這兩個亞群具有不同但同等重要的性質。具體地，Thyl.1陽性細胞具有分化成胰腺細胞和肝細胞類型的雙潛能。在一些實施方式中，本文描述的細胞亞群提供了胰島素的非β_細胞來源。在一些實施方式中，本文描述的細胞亞群提供了用于評價測試物質毒性的細胞類型(例如，用于毒性測試)。因此，第一方面，提供了起源于成體組織的干細胞/祖細胞群，其中所述細胞在血清的存在下能夠在無基質膠的培養體系中生長，并且其中該細胞為Thyl.1陽性。在一些實施方式中，Thyl.1陽性細胞也是Pdx-1陽性的。在一些實施方式中，Thyl.1陽性細胞為巢蛋白(Nestin)(RAT:NP_037119.1G1:6981262、HUMAN:NP_006608.1G1:38176300)陽性。在一些實施方式中，按照流式細胞分析術確定，在該群中巢蛋白陽性細胞的百分比少于50%(例如，少于40%、30%、20%、10%、5%、2%或1%)。在一些實施方式中，可通過巢蛋白核酸的表達(例如，通過PCR)將細胞區分為巢蛋白陽性細胞。當Thyl.1陽性細胞的百分比大于50%，優選大于60%，更優選大于70%、80%、90%、或95%時，可以認為該細胞群為Thyl.1陽性(CD90陽性)(RAT:LOCUS:P01830GI135832,NP_006279G1:19923362)。在一些實施方式中，Thyl.1陽性細胞群的純度大于98%。Thyl.1陽性細胞的百分比可以通過例如流式細胞術或PCR來確定。在一些實施方式中，根據本發明的Thyl.1陽性細胞群對于Pdx_l、⑶49f、⑶147、⑶44、c_Met和巢蛋白中一種或多種的表達呈陽性。在一些實施方式中，Thyl.1陽性細胞群對于⑶24、⑶45、⑶31、c-kit和CK19中一種或多種的表達呈陰性。在一些實施方式中，根據本發明的Thyl.1陽性細胞群具有下面的細胞表面標記物譜(profile):Thyl.l(CD90)陽性Pdx-1陽性CD49f95%+CD24陰性CD14790%+CD45陰性CD4485%+CD71低CD31陰性C-KIT陰性CK19陰性c-Met陽性巢蛋白陽性(低=約小于或等于表達標記物的細胞的5%)本發明還提供了一種藥物組合物，其包含根據本發明這個方面所述的細胞群，還有藥用載體。在本發明的第二方面，提供了一種生產從成體哺乳動物組織中分離的雙潛能干細胞群的方法，所述方法包括:培養所述成體哺乳動物組織；獲得出現的(emergent)細胞群單層；以及分離包含對于Thyl.1呈陽性細胞的亞群。在一些實施方式中，該亞群的至少50%,60%,70%,80%,90%,95%Thyl.1陽性。該方法還包括分離與一種或多種提供在上述譜中的其他細胞表面標記物結合的那些對于Thyl.1呈陽性的細胞(例如，Pdx-l、CD49f、CD147、CD44、c-Met和巢蛋白中一種或多種呈陽性和/或⑶24、⑶45、⑶31、c-kit和CK19中一種或多種呈陰性)。在一些實施方式中，該成體哺乳動物組織是來源于胰腺的，例如來源于胰腺導管的。在一些實施方式中，該成體哺乳動物組織是乳腺、肝臟或腎臟。在一些實施方式中，該成年哺乳動物組織是人組織。除了通過獲得成年哺乳動物組織而獲得出現的細胞群單層，一種方法可能涉及獲得已分離的成體干細胞，例如，于2005年5月12日以登錄號為Q6203保藏在ECACC的那些細胞。第三方面，提供了一種在培養物中生產肝細胞群的方法，所述方法包括在適于肝譜系分化的培養基中培養根據本發明的Thyl.1陽性細胞群。作為一個實例(本領域技術人員知道其他的實例)，該培養基可以是含有FGF-4的無血清分化培養基。[0050]第四方面，提供了一種在培養物中生產胰腺細胞群的方法，所述方法包括在適于胰腺譜系分化的培養基中培養根據本發明的Thyl.1陽性細胞群。本發明可以擴展到由本文描述的方法獲得或可由本文描述的方法獲得的細胞或細胞群。在本發明的第五方面，提供了一種治療與細胞變性或年齡有關的組織變化相關的疾病狀態的方法，所述方法包括向患有所述疾病或年齡相關病癥的患者，給予根據本發明的Thyl.1陽性成年干細胞群或包含所述Thyl.1陽性細胞群的藥物組合物。Thyl.1陽性細胞群可以靜脈內給予或可以將其移植到患病部位中。在一些實施方式中，該疾病與胰腺細胞、神經元細胞、心血管細胞(例如，心肌細胞)、上皮細胞、肝細胞或腎細胞的變性相關。待治療的疾病狀態可包括糖尿病(I型和II型)、肝病、腎病、眼病、帕金森病和心血管病，以及年齡相關的身體器官和組織的退化性病癥。本發明的這個方面也可用作美容手術形式，例如組織的細胞再生和用于阻止衰老形成。在一些實施方式中，該細胞的供體和受體為同一物種(例如，都是人)。在一些實施方式中，該細胞的供體和受體為不同物種。因此，本發明的實施方式包括利用大鼠來源的成體干細胞群治療人類患者。在本發明的第六方面，提供了一種生產特異性分化的細胞群(例如胰腺細胞或肝細胞)的方法，所述方法包括以下步驟:提供成體干細胞群；利用Pdx-1和/或Thyl.1標記物和可選的一種或多種本文鑒定的與Thy1.1亞群細胞表面標記物譜有關的其他標記物來選擇細胞亞群；以及在有助于細胞分化的條件下培養所述細胞亞群。本發明進一步提供了用于醫學治療方法的根據本發明第一方面的細胞群，該醫學治療包括整容手術。該方法可以治療與細胞損失或變性相關的疾病狀態或老化病癥，例如，糖尿病或帕金森病。在本發明的第六方面，提供了起源于成體組織的細胞群，其中所述細胞能夠在血清的存在下在無基質膠的培養體系中生長，并且其中該細胞為Thyl.1陰性。在一些實施方式中，所述細胞群為Pdx-1陽性。該細胞群也可以為巢蛋白陽性。本發明還提供了一種藥物組合物，其包含成體干細胞Thyl.1陰性細胞群，還有藥用載體。在本發明的第七方面，提供了一種從成體哺乳動物組織中生產分離干細胞群的方法，所述方法包括:培養所述成體哺乳動物組織；獲得出現的細胞群單層；以及分離對于Thyl.1呈陰性的細胞亞群。在一種實施方式中，該方法進一步包括分離Pdx-1陽性和/或巢蛋白陽性的細胞亞群。在一種實施方式中，ThyLI陰性細胞亞群對于CD49f、CD24、CD147、CD44、c_Met中一種或多種的表達呈陽性，和/或對于⑶31、c-kit和ck7中一種或多種的表達呈陰性。在一種實施方式中，分離的Thyl.1陰性細胞亞群具有下面細胞表面標記物譜:Thyl.l(CD90)陰性Pdx-1陽性CD49f95%+CD2480%+[0068]CD14780%+CD45陰性CD4460%+CD71低CD31陰性c-KIT陰性ck7陰性CK19弱陽性c-Met陽性(低=約小于或等于表達標記物的細胞的5%)除了通過獲得成體哺乳動物組織來獲得出現的細胞群單層，該方法可能涉及獲得已分離的成體干細胞/祖細胞，例如，于2005年5月12日以登錄號為Q6203保藏在ECACC的那些細胞。在本發明的第八方面，提供了一種治療糖尿病或與胰島素產生減少相關的疾病狀態的方法，所述方法包括向患有所述疾病或年齡相關病癥的患者給予根據本發明的Thyl.1陰性細胞群或包含所述Thyl.1陰性細胞群的藥物組合物。Thyl.1陰性細胞群可以靜脈內給予或可以將其移植到患病部位中。在一些實施方式中，該細胞的供體和受體為同一物種，例如，人。在一些實施方式中，該細胞的供體和受體為不同物種。因此，本發明的實施方式包括利用成體大鼠干細胞/祖細胞來治療人類患者。在本發明的第九方面，提供了一種生產能夠產生胰島素的特異性分化的細胞群的方法，所述方法包括以下步驟:提供成體干細胞群；選擇Pdx-1陽性和Thyl.1標記物陰性的成體干細胞亞群；以及在有助于細胞分化的條件下培養所述細胞亞群。該方法進一步包括，基于作為Thyl.1細胞表面標記物譜的一部分的一種或多種上文中所鑒定的其他標記物來選擇成體干細胞群。本發明進一步提供了一種用于醫學治療方法的根據本發明的成體干細胞Thyl.1陰性細胞群。特別地，該方法可以治療糖尿病。本文還提供了生產胰島素的方法。生產胰島素的方法可以包括在產生胰島素的條件下，培養本文描述的Thyl.1陰性、Pdx-1陽性細胞群(例如,成體組織,如成體胰腺組織來源的Thyl.1陰性、Pdx-1陽性細胞群)。該方法可進一步包括從該培養物中分離胰島素。在一些實施方式中，Thyl.1陰性細胞對于⑶49f、⑶24、⑶147、⑶44、c-Met中一種或多種的表達呈陽性，和/或對于⑶31、c-kit和ck7中一種或多種的表達呈陰性。在另一種實施方式中，生產胰島素的方法包括在生產胰島素的條件下，培養本文描述的Thyl.1陽性、Pdx-1陽性細胞群(例如，成體組織，如成體胰腺組織來源的分化的Thyl.1陽性、Pdx-1陽性細胞群)。該方法可進一步包括從該培養物中分離胰島素。在一些實施方式中，Thyl.1陽性細胞群對于Pdx-1、CD49f、CD147、CD44、c-Met和巢蛋白中一種或多種的表達呈陽性，和/或對于⑶24、⑶45、⑶31、c-kit和CK19中一種或多種的表達呈陰性。本發明的方面和實施方式將參考附圖通過實施例來說明。其他的方面和實施例對本領域技術人員是顯而易見的。本文提及的所有文獻以引用的方式結合于本文。圖1.體外未分化的Thyl.1陽性和Thyl.1陰性群的形態。Thyl.1陽性和Thyl.1陰性TOPC群的體外肝和胰腺分化(圖1A-圖1C):分化期間在Thyl.1陰性群中幾乎沒有觀察到形態變化。(圖1A)未分化的Thyl.1陰性H)PC。(圖1B)誘導Thyl.1陰性TOPC胰腺分化后28天。(圖1C)誘導Thyl.1陰性TOPC肝分化后28天。(圖1D-1):在誘導Thyl.1陽性TOPC肝分化時觀察到顯著的形態變化。(圖1D)未分化的Thyl.1陽性TOPC(成纖維細胞樣形態)。(圖1E)誘導Thyl陽性TOPC肝分化后14天。(圖1F)誘導Thyl.1陽性TOPC肝分化后28天-內腔結構(Iumenalstructure)存在并占主導地位的上皮形態。(圖1G)肝誘導后28天thyI陽性PDPC的立方形態(Cuboidalmorphology)。(圖1H)誘導Thyl.1陽性TOPC胰腺分化14天后。(圖1I)誘導Thyl.1陽性TOPC胰腺分化28天后——胰島樣簇(Islet-likecluster)形成并隨后分離到培養基中。圖2.通過流式細胞術分析的MACS分選的TOPC的細胞表面特征。(圖2A)Thyl(⑶90)陽性群對于⑶24、⑶31、⑶45、c-kit的表達呈陰性且對于⑶71的表達低，但對于CD147、CD44和CD49f的表達呈陽性。(圖2B)Thyl(CD90)陰性群對于CD31.CD45、c_kit的表達呈陰性，其對于⑶71的表達低，但對于⑶24、⑶147、⑶44和⑶49f的表達呈陽性。圖3.Thyl.1分選的I3DPC群的免疫細胞化學分析。所示出的陽性對照為白蛋白(圖3A)、細胞角蛋白7(圖3E)、波形蛋白(圖31)和細胞角蛋白19(圖3M)。未分化的Thyl.1陰性TOPC群表現出對白蛋白染色呈陰性(圖3B)、對細胞角蛋白7染色呈陰性(圖3F)、對波形蛋白染色呈陰性(圖3J)，但對細胞角蛋白19染色較弱(圖3N)。未分化的Thyl.1陽性群為白蛋白(圖3C)、細胞角蛋白7(圖3G)、波形蛋白(圖3K)和細胞角蛋白19(圖30)陰性。但是至IJ14天時，在肝分化培養基中，Thyl.1陽性H)PC為白蛋白陽性(圖3D)，并且在內腔樣區域中，為波形蛋白陽性(圖3L)和細胞角蛋白19陽性(圖3P)，但細胞角蛋白7始終為陰性(圖3H)。圖4.胰腺分化培養基中Thyl.1陽性PDPC(圖4A)和Thyl.1陰性PDPC(圖4B)的RT-PCR0Thyl.1陰性和陽性PDPC在胰腺分化培養基中培養28天。柱:(I)陽性對照、(2)未分化PDPC、(3)28天分化的PDPC、(4-6)樣品1_3的無RT對照。圖5.肝分化培養基中Thyl.1陽性PDPC和Thyl.1陰性PDPC的RT-PCR0Thyl.1陽性(圖5A)和陰性(圖5B)H)PC在肝分化培養基中培養28天。柱:(I)陽性對照、(2)未分化的PDPC,(3)第7天、(4)第14天、(5)第21天、(6)第28天、(7-13)樣品1-6的無RT對照。白蛋白、CK19和HNFlα的表達在Thyl.1陽性群中被誘導，但在Thyl.1陰性群中未觀察到。圖6.未分化的Thyl.1陽性PDPC(圖6Β)或Thyl.1陰性PDPC群(圖6C)沒有貯積糖原。在含有FGF-4的培養基中培養之后Thyl.1陽性TOPC產生貯積糖原(圖6D和圖6Ε)。當用高碘酸-希夫染色時，可看到糖原貯積有品紅染色的累積。在含有FGF-4的肝分化培養基中培養之后，Thyl.1陰性TOPC沒有看到染色(圖6F)。陽性對照(圖6A)。具體實施方式[0093]材料和方法大鼠PDPC的分離和維持培養在接種到CMRL培養基之前，通過解剖和切碎從12個月大的瑞士白化大鼠(Glasgow)中分離胰腺導管。在培養約5周之后，PDP細胞以融合單層(confluentmonolayer)形式出現。然后收集這些細胞并在PBS中沖洗。在37°C，5%CO2氣氛中，在帶0.2μπι過濾帽的T75培養瓶(CorningjUK)中的20mlCMRL1066培養基(Invitrogen,Paisley,UK.)中持續培養PDPC，該培養基含有10%胎牛血清(Sigma,Poole,UK)、2mMglutamax(谷丙氨酸二肽)、1.25μg/ml兩性霉素B、和100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素(都為Invitrogen的，Paisley,UK)。通過用移液管徹底除去培養基并在室溫下5分鐘內向該瓶中加入IOml無I丐和鎂的漢克斯平衡鹽溶液(HBSS),(CambrexBio-Science,Wokingham,UK)傳代亞融合培養物。在通過移液管從該瓶中除去HBSS之后，將2ml胰蛋白酶-維爾烯溶液(200mg/L維爾烯、500mg/L胰蛋白酶)加入到該瓶中。用顯微鏡定期檢查該瓶直至確定該細胞單層分離(dissociation)。然后用移液管轉移細胞，并且如上根據需要以1/51/10的密度通過加入20ml新鮮培養基重新培養。在37°C，5%CO2氣氛下，將I3DPC長期維持在帶0.2um過濾帽的T75中的CMRL1066培養基(Invitrogen,Paisley,UK)中，該培養基含有5%胎牛血清(Sigma,Poole,UK)、2mMGlutamax、1.25ug/ml兩性霉素B和100u/ml青霉素/鏈霉素(都為Invitrogen,Paisley)。TOPC在37°C，加濕的5%CO2氣氛下生長為單層，并在90%融合時用胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)進行傳代。對細胞進行計數并以3300細胞/cm2的密度再接種。磁性活化細胞分選按照制造商的方案(免疫磁珠羊抗鼠IgG(DynabeadsGoatantimouseIgG)(DynalBiotech)),在4°C下利用每IO6個祀細胞lug—抗(primaryantibody),小鼠抗大鼠Thyl.1(CD90)(Serotec)，用磁性活化細胞分選(MACS)進行分離和消耗(cbpletion)，持續20分鐘。分選的細胞群是在維持培養基中的重懸細胞并再接種于組織培養瓶中。在實驗中使用之前，對每個陽性和陰性分選的群實施兩次MACS。在隨后的分化實驗中使用之前，利用熒光活化流式細胞術來檢查所有分選的群。細胞表面抗原的流式細胞術評估將細胞重懸在HBSS中的0.5%BSA中。然后在IOOOxrpm下離心10分鐘，并將所得的細胞團(cellpellet)重懸在HBBS中。在用臺盤藍(Invitrogen,Paisley,UK)進行活細胞計數(viabilitycount)之后,用100μI—抗標記IxIO6細胞/ml。所使用的一抗是抗CD90(SerotecMCA47R,I:75)、CD44(SerotecMCA643,1:10)、CD49f(SerotecMCA2034,1:50)、CD147(SerotecMCA729,1:10),c-KIT(SantaCruzSC-19983,1:20)、CD71(SerotecMCA155FT,I:10)、CD24(BDBiosciences551133,1:50)、CD45(BDBiosciences554875,1:50)、CD31(SerotecMCA1334GA,I:50)和CD34(SantaCruzsc-7324,1:50)的。在黑暗中，于4°C下用45分鐘將二抗加入到0.2%BSA/PBS中。然后在0.2%BSA/PBS中沖洗該細胞并以IOOOxrpm離心3次，之后在黑暗中于4°C下用45分鐘向2%BSA中加入100μI兔抗鼠免疫球蛋白的結合FITC的Fab2片段(DakoCytomation,Ely,UK1:20)進行標記。同時進行同種型FITC對照。在如前所述沖洗3次并離心之后，將所得的細胞團重懸在ImlHBSS中并利用BeckmanCoulterXL流式細胞儀(BeckmanCoulter,HighWycombe,UK)分析細胞。分化實驗為了進行胰腺分化，以6600細胞/cm2的細胞密度接種Thyl.1陽性和Thyl.1陰性細胞群(30代)。24小時之后，移去維持培養基，并用HBSS沖洗單層三次。隨后在補充IxITS,1.25μg/ml兩性霉素B和100μ/ml青霉素/鏈霉素(都為Invitrogen,UK)、IOmM煙酰胺(Sigma)、10ng/mlKGF(Sigma)和0.2%BSA(Sigma)的DMEM:F12(Lonza)中培養細胞。為了進行肝分化，以6600細胞/cm2將細胞接種于T75和6孔板中，并以2500細胞/cm2將細胞接種于腔室玻片(Nunc)中維持24小時，用HBSS沖洗3次之后，替換為補充有成纖維細胞生長因子_410ng/ml(Sigma)、IxITS、100μ/ml青霉素/鏈霉素(Invitrogen)和0.2%牛血清白蛋白(Sigma)的DMEM:F12(Lonza)。每周更換培養基三次，在胰腺分化的O和28天，且在肝分化的0、7、14、21和28天收集細胞，以從未分化的Thyl.1陽性和Thyl.1陰性細胞中提取RNA。將腔室玻片中經歷了肝分化的細胞用PBS沖洗2次，并在10-14天之間于室溫下用4%多聚甲醛固定15分鐘。未分化的Thyl.1陽性和陰性群也同時在腔室玻片中生長，并在90%融合時如上所述進行固定。免疫熒光為了進行細胞內蛋白質染色，如上所述固定細胞。在PBS中沖洗細胞3次，并用0.1%TritonX-100(Sigma-Aldrich)滲透化處理10分鐘。用驢血清孵化玻片20分鐘，并用預先優化的在0.5%BSA/PBS中稀釋的抗大鼠白蛋白(Abeamabl4255，I:100)、CK19(BiodesignInt.M08029M,I:100)、CK7(ChemiconMAB3226，I:100)、CK18(SigmaF-4772)和波形蛋白(Abeamab8979，I:50)的一抗孵化I小時。玻片在PBS中沖洗三次，接著用適當FITC標記的二抗沖洗(Abeamab6749或DakoCytomationF0313,Ely,UK)。省略一抗的實驗組作為陰性對照。冷凍的大鼠肝切片用作陽性對照。在Vectashield中封固之前沖洗玻片3次，并利用熒光顯微術使其可視化并拍照。RT-PCR根據制造商說明書，利用Trizol提取總RNA，并通過GeneQuant分析器量化。用DNA酶(Ambion)處理樣品并根據制造商說明書，利用SuperScriptII逆轉錄酶(Invitrogen)使其逆轉錄為⑶NA。對所有樣品執行無RT的陰性對照。利用Taq聚合酶(Invitrogen)執行RT-PCR。利用管家基因Bactin評估模板質量。所有PCR反應都利用PeltierThermalCycler-200執行。對于胰腺分化實驗，實施巢式PCR。使用了以下的特定寡核苷酸引物:PDX1、胰島素II和胰高血糖素(PDX-1正向，5_cggccacacagctctacaagg_3(SEQIDNO:1)，反向，5_ctccggttctgctgcgtatgc_3(SEQIDNO:2),巢式反向5_ttccaggcccccagtctcgg_3(SEQIDNO:3)(305bp),胰島素，正向5_atggccctgtggatccgctt_3(SEQIDNO:4)；反向，5_tgccaaggtctgaaggtcac_3(SEQIDNO:5);巢式正向，5_cctgctcatcctctgggagcc_3(SEQIDNO:6)(209bp);胰高血糖素，正向，5_gaccgtttacgtggctgg_3(SEQIDNO:7)；反向，5-cggttcctcttggtgttcatcaag-3(SEQIDNO:8);巢式正向，5_acaaggcagctggcagcatgc_3(SEQIDNO:9)(210bp)。大鼠胰腺總RNA被逆轉錄并用作陽性對照。以下的特定寡核苷酸引物用于肝分化實驗:白蛋白(141bp)正向5_ctgggagtgtgcagatatcagagt_3(SEQIDNO:10),反向5-gagaaggtcaccaagtgctgtagt-3(SEQIDNO:11),HNF3β(63bp)正向5-cctactcgtacatctcgctcatca-3(SEQIDNO:12),反向-cgctcagcgtcagcatctt(SEQIDNO:13),HNFl(138bp)α正向5_agctgctcctccatcatcaga_3(SEQIDNO:14)，反向5-tgttccaagcattaagttttctattctaa-3(SEQIDNO:15),Gata4(173bp)正向5_catgcttgcagttgtgctag_3(SEQIDNO:16)，反向5_attctctgctacggccagta_3(SEQIDNO:17)，甲胎蛋白(124bp)正向5-gtcctttcttcctcctggagat-3(SEQIDNO:18)，反向5_ctgtcactgctgatttctctgg_3(SEQIDNO:19),CYP2BI(549bp)正向5_gagttcttctctgggttcctg_3(SEQIDNO:20),反向5_actgtgggtcatggagagct_3(SEQIDNO:21),CK19(193bp)正向5_agtaacgtgcgtgctgacac_3(SEQIDNO:22),反向5_agtcgcactggtagcaaggt_3(SEQIDNO:23),CK18(70bp)正向5_ggacctcagcaagatcatggc_3(SEQIDNO:24),反向5-ccacgatcttacgggtagttg-3(SEQIDNO:25)。PCR產物然后進行瓊脂糖凝膠電泳并通過溴化乙錠染色而可視化。大鼠肝組織用作陽性對照。高碘酸-希夫染色(PeriodicAcidSchiffStaining)在肝分化的第21天，對未分化的Thyl.1陽性和Thyl.1陰性細胞以及Thyl.1陽性和陰性群實施糖原貯積的高碘酸-希夫染色。人肝切片用作陽性對照。在室溫下在4%多聚甲醛中固定細胞10分鐘。在PBS中沖洗細胞3次，用0.1%TritonX-1OO(Sigma-Aldrich)透化處理10分鐘，用PBS沖洗2次并用ddH20沖洗I次。在室溫下將細胞浸泡在高碘酸溶液(lg/dL)中5分鐘。用蒸餾水漂洗孔3次。在室溫下將細胞浸泡在希夫試劑中15分鐘。用流動自來水沖洗細胞5分鐘。在蘇木精溶液中對細胞復染色90秒。在流動自來水中漂洗細胞15-30秒。結果Thyl.1陽性和陰性群的表征rope的MAC分選分別用來以大于98.5%的純度分離表達Thyl.1陽性細胞群并以大于98.7%的純度分離Thyl.1陰性細胞群。然后對這些群進行培養并規律地每隔10-12天和在任何分化或表征實驗之前，通過流式細胞術進行再評估。在表型上，Thyl.1陽性群和Thyl.1陰性群的形態表現出明顯差異:Thyl.1陽性群表現為成纖維細胞樣形態(圖1，組A)，而Thyl.1陰性群表現為更類似上皮細胞樣的形態(圖1，組D)。也觀察到Thyl.1陽性和Thyl.1陰性細胞群之間的細胞表面標記物的表達的一些差異。兩個細胞系都表達⑶147、⑶44和⑶49f。二者⑶71的表達均較低，并且均不表達造血(haematopoetic)標記物CD31、CD34、CD45和c_kit。與Thyl.1陽性分選細胞群相反，Thyl.1陰性群為⑶24陽性(圖2a和圖2b)。還通過免疫細胞化學評估亞群的肝、膽和間質細胞標記物白蛋白、波形蛋白、CK7和CK19(圖3)。兩個Thyl.1分選的群都為白蛋白、CK7和波形蛋白陰性(圖3_組B、C、F、G、J和K)。Thyl.1陽性群還是CK19陰性(圖3，組O)，而Thyl.1陰性細胞為弱陽性(圖3，組N)。通過RTPCR，兩個群都為c-Met和巢蛋白陽性(數據未示出)。總之，Thyl.1陰性細胞群表達以下的細胞表面標記物譜:Thyl.l(CD90)陰性Pdx-1陽性[0120]CD49f95%+CD2480%+CD14780%+CD45陰性CD4460%+CD71低CD31陰性C-Kit陰性ck7陰性CK19弱陽性c-Met陽性Thyl.1陽性細胞表達以下的細胞表面標記物譜:Thyl.l(CD90)陽性Pdx-1陽性CD49f95%+CD24陰性CD14790%+CD45陰性CD4485%+CD71低CD31陰性C-KIT陰性CK19陰性c-Met陽性巢蛋白陽性Thyl.1陽性和Thyl.1陰性群的分化能力胰腺分化在胰腺分化培養基中，Thyl.1陽性和Thyl.1陰性群表現出明顯不同的形態變化。起初為成纖維細胞樣形態的Thyl.1陽性群，到14-21天時形成纏結的細胞簇，并且到28天時形成胰島樣球狀簇，其最終與親代細胞層分開(圖1，組D、H、I)。相反，Thyl.1陰性細胞仍然為具有小上皮細胞樣形態的單層，無三維結構形成(圖1，組A和組B)。未分化的Thyl.1陽性細胞的RT-PCR分析證實了陽性Pdx-1表達，但是不表達胰島素或胰高血糖素(圖4-B)。分化的細胞簇對全部三個標記物的轉錄表達均呈陽性(圖4，組B)。但是，當在維持培養基或分化培養基中生長時，Thyl.1陰性細胞表達PdX_l。尤其是，當在分化培養基中生長時，雖然沒有表現出形態變化，但在Thyl.1陰性群中檢測到胰島素轉錄。胰高血糖素在未分化的Thyl.1陰性細胞中未被表達，在分化之后也未被體外誘導(圖4，組A)。肝分化[0151]在含有FGF4的無血清培養基中培養Thyl.1陽性和陰性PDPC，從而評估肝潛能。Thyl.1陽性細胞表現出從成纖維細胞樣形態到上皮細胞/立方形態的形態變化。此外，到28天，整個培養期間帶有扁平上皮的內腔結構明顯。在肝分化板中也觀察到類似于在胰腺分化板中觀察到的偶爾出現的三維胰島樣結構。Thyl.1陰性群仍然為單層，無三維結構或內腔樣結構的證據，并且形態沒有明顯變化(圖1A，C)。在28天的時間內，本發明人通過RT-PCR進一步檢查該兩個群的分化。對內胚層特異性基因HNF3-13及GATA4、早期肝標記物甲胎蛋白和CK18、成熟肝標記物HNFlα、白蛋白和細胞色素Ρ450酶CYP2B1執行RT-PCR。通過RT-PCR，未分化的Thyl.1陰性細胞表達HNF3-β和CK19，但不表達白蛋白、CK18、HNFla、CY2B1、Gata4或甲胎蛋白(圖5，組B)。其他的早期或成熟肝標記物，或者CY2B1在Thyl.1陰性群中無一被誘導。有趣的是，未分化的Thyl.1陽性TOPC表達早期內胚層標記物HNF3-β、GATA4和甲胎蛋白，但直到肝分化的第14天才表達肝細胞分化的晚期標記物、HNFl-α和白蛋白(圖5，組Α)。培養中，與內腔結構的外觀一致，正常被膽細胞(biliarycell)表達的CK19也在14-28天期間被誘導。白蛋白表達的誘導通過免疫細胞化學得到證實。未分化的細胞對于白蛋白含量染色呈陰性(圖3，組A)，而14天分化的細胞對于白蛋白染色呈強陽性(圖3，組D)。有趣的是，在第10天和第14天時間點，分化的細胞對膽標記物CK19和CK7染色呈陰性(圖3，組N和組G)，但是僅對內腔樣結構中的波形蛋白染色呈陽性(圖3，組L)。CK18也在未分化的Thyl.1陽性細胞中和整個28天分化期間被表達。CYP2B1存在于未分化的Thyl.1陽性細胞中和整個分化期間。通過免疫細胞化學分析，未分化的Thyl.1陰性細胞對CK7、波形蛋白和白蛋白的表達呈陰性，并且CK19呈弱陽性。Thyl.1陽性群為CK19陰性。糖原貯積的高碘酸-希夫(PAS)染色如通過PAS染色法所確定的，在Thy-LI陽性或陰性I3DPC中未觀察到貯積糖原的存在，也未在21天分化的Thy-LI陰性細胞中觀察到貯積糖原。但是到21天時，在Thy-LI陽性分化的細胞中觀察到指示糖原貯積的PAS染色陽性(圖6)。糖尿病動物模型中細胞亞群的檢查本文描述的細胞亞群(例如，Thyl.1陽性或Thyl.1陰性細胞群)可用于諸如糖尿病之類的疾病動物模型中。在一種實施方式中，細胞亞群用于鏈脲霉素(STZ)誘導的糖尿病的哨齒動物相似的異種移植(concordantxenograft)模型。通過在第O天注射STZ使C57BL/6小鼠患糖尿病，并在第3天將750，000個細胞(例如，Thyl.1陽性細胞)注射到經處理動物的尾靜脈中。給對照動物注射鹽水或相當數目的C57BL/6骨髓細胞。每3天監測一次血糖。相對于對照組，血糖的穩定和/或存活者增加表明所給予的細胞在該動物中產生胰島素。討論本文提供了關于Thyl.1陽性和Thyl.1陰性TOPC亞群的體外培養、選擇和表征的詳細情況。此外，公開了關于它們分化為胰腺和肝譜系的潛力的詳細情況，并提供了利用標記物Thyl.1分選的細胞群,其在體外顯示出譜系雙潛能(lineagebipotentiality)。Thyl.1是一種細胞表面蛋白，對其功能沒有清楚的了解。但是，已揭示它涉及細胞再生(Gunter等人，1984;Williams,1985)、細胞粘附(He等人，1991;Hueber等人，1992)和信號轉導(Kroczek等人，1986)。在各種干細胞群，尤其是成年大鼠肝中的卵圓細胞群中觀察到Thyl.1的表達得出這樣的推斷，即，Thyl.1能夠識別細胞并粘附到間質組織，可潛在地作為損傷后的修復細胞。(Masson等人,2006;Petersen等人，1998;Terrace等人,2007)。Thyl.1也在人、小鼠和大鼠的胚胎肝干細胞、臍血干細胞和間質干細胞上被表達。本研究發現的Thyl.1陽性群內的體外效力更大與該觀察結果一致。這也證實了利用這樣的分離和純化的方法以使能夠進一步使用這樣的細胞。先前的研究已證明一些不同細胞類型的肝分化，包括骨髓來源的MSC、MAPC,子宮內膜和胰腺來源的MSC(Jiang等人，2002；Meng等人，2007；Schwartz等人，2002；Seeberger等人，2006)。TOPC的Thyl.1陽性亞群具有共同的形態表型，并且這些群表達一些細胞表面標記物，這些細胞表面標記物包括⑶44+、⑶24-、⑶45-、⑶31-和⑶34。然而，與之相反，Thyl.1陽性TOPC似乎是表達GATA4、HNF3-13和甲胎蛋白的獨特細胞類型，這些還沒有被描述成表達在任一種的這些其他細胞類型上。HNF3-β是一種被認為在內胚層能力(endodermcompetency)中發揮重要作用的決定性內胚層標記物(Gualdi等人，1996)，而GATA4是腹側前腸內胚層發育和早期肝基因表達所需的轉錄因子(Gualdi等人，1996;Rossi等人,2001)。已證實HNF3-P可引導核小體在白蛋白增強子的環境中的定位(McPherson等人，1996；Cirillo和Zaret,1999),隨后使得GATA4與該白蛋白增強子的結合變得容易。GATA4-/-和HNF3-β-/-胚胎在前腸形態中均表現出缺陷(Duncan等人，1997)。因此，未分化的I3DPC中HNF3-β和GATA4的表達以及隨后FGF刺激的肝特異基因(如白蛋白和HNFl-α)表達的誘導與這種方案相一致，SP，HNF3-13和GATA4配合從而控制這些細胞定向分化為肝細胞命運的潛能。而且，在分化21天之后，在Thyl.1陽性群中存在PAS染色表明更成熟的肝細胞的功能特征，其與HNFl-α的表達一致。已知HNFl-α結合于產物與成熟肝功能相關的基因，成熟肝功能包括碳水化合物貯積以及合成和脂質代謝(Odom等人，2004)。未分化的Thyl.1陽性I3DPC表達AFP。這個觀察結果與描述了在早期腹側前腸內胚層中肝形成(h印atogenesis)之前，在巢蛋白陽性胰島來源的祖細胞中表達AFP以及AFP和TTR低水平的表達的報道一致。這種表達隨后在從心臟中胚層信號轉導分離的內胚層中缺失(Gualdi等人，1996;Jung等人，1999;Zulewski等人,2001)。也揭示了，這是腹側前腸內胚層的默認胰腺命運(defaultpancreaticfate)的特征，(Deusch等人)。AFP在Thyl.1陽性TOPC群中的表達證明了胰腺和肝譜系的能力，它與本研究的結果不一致。(Deutsch等人，2001)。重要的是，未分化的Thyl.1陰性群在表達HNF3i3時，不表達GATA4或甲胎蛋白，也沒有在分化實驗期間被誘導。在ThyLI陰性群中沒有觀察到肝能力(hepaticcompetency)的證據。這與在這種未分化的群內存在Pdx-1表達而不存在Gata4表達相一致。在肝分化期間，波形蛋白在未分化的Thyl.1陽性或陰性群中未被表達，但在形成導管樣結構的細胞中被表達。波形蛋白被認為代表間質細胞標記物。但是，Masson等人觀察到Thyl.1和波形蛋白在肝門結構(portalstructure)中的共表達,這也證明波形蛋白在組織切片中的上皮細胞中以及胚胎肝上皮細胞培養物中的表達。(Masson等人，2006)。有關胰腺分化的數據是有趣的。在Thyl.1陰性群中未觀察到胰島樣簇的形態學證據。相反，Thyl.1陽性H)PC容易被誘導為胰腺譜系，其特征形態發生變化，形成三維胰島樣結構并且rox-1、胰島素和胰高血糖素的轉錄表達。兩個群中Pdx-1轉錄表達的檢測表示出它們具有成為產生胰島素的細胞的潛能。尤其注意的是，當Thyl.1陰性細胞在分化培養基中生長時，盡管未出現形態變化，但表達胰島素。胰高血糖素在未分化的Thyl.1陰性細胞中未被表達，在體外分化之后也未被誘導(圖4組)。先前已經描述了各種不同的胰腺祖細胞/干細胞候選群，包括表達巢蛋白或其他神經元干細胞標記物的胰島祖細胞(Abraham等人,2004；Cornelius等人，1997；Lechner等人，2002;Ramiya等人，2000)。已示出了另外的群可以表達I3DX-1(其是一種產生胰島素的細胞的已知標記物)，并且這些細胞在適當條件下能夠刺激導管和內分泌細胞體外分化(Bonner-Weir等人,2000；Otonkoski等人，1993)。而且,有證據表明，胰腺導管上皮細胞具有去分化成能夠增殖和形成新胰島和腺泡的祖細胞的潛能(Bonner-Weir等人,2004),并且最近報道了，當存在胚胎胰腺組織時，可在體內誘導CK19+非內分泌胰腺上皮細胞(NEPC)部分地分化成產生胰島素的細胞(Hao等人，2006)。這些細胞發揮的確切生理作用已受到質疑。Dor等人對從導管或祖細胞產生新生的觀點提出異議，而是爭論β細胞復制而不是新胰島生成是胰腺內分泌組織在幾乎全部胰切除術后再生的主要機制(Dor等人，2004)，盡管這種解釋仍存在爭議(Bonner-Weir和Weir,2005).本研究結果與能夠產生胰島素的非β細胞的作用一致，因為潛在地促進此種過程。很明顯這些細胞提供了用于移植療法的可替代的產生胰島素的細胞來源。通過利用含有FGF-4的無血清分化實驗方案，本發明人觀察到表示肝譜系分化的形態變化和基因表達變化的時間過程。胚胎腹側內胚層的胰腺和肝分化的雙潛能已在外植體實驗中進行研究，其中腹側內胚層分化成接近心臟中胚層的肝譜系。心臟中胚層分泌的誘導因子，如FGF-1、FGF-2和FGF-4的缺乏使得腹側內胚層的默認胰腺途徑得以繼續進行(Deutsch等人，2001)，而一般FGF信號拮抗劑抑制體外肝形成(Jung等人，1999)和FGF-4(Zhu等人，1999)。本發明的`數據與這種概念完全一致。本發明人已經說明了rope的分離和特征，其在體外表現出與雙潛能內胚層祖細胞群一致的效力和對信號傳輸的轉錄響應。之前，給予鏈脲霉素誘導的鼠科動物糖尿病模型中未分選的rope群，證明了大鼠胰島素的分化和產生與小鼠胰腺再生刺激同時發生(Shiels2005和W02006/120476，均以引用的方式結合于此)。參考文獻列表:1.Abraham，E.J.，S.Kodama,J.C.Lin,M.Ubeda，D.LFaustmanandj.F.Habener:Humanpancreaticislet-derivedprogenitorcellengraftmentinimmunocompetentmice.Am.J.Pathol.Dev.164，817-830(2004).[0173]2.Bonner-Weir,S.，E.Toschi，A.1nada，P.Reitz,S.Fonseca，T.AyeandA.Sharma:Thepancreaticductalepitheliumservesasapotentialpoolofprogenitorcells.PaediatricDiabetesDev.5,16-22(2004).[0174]3.Bonner-Weir,S.，M.Taneja,G.C.Weir,K.Tatarkiewicz,K.H.Song，A.SharmaandJ-J-OrNeil:InvitrocultivationofhumanisletsfromexpandedductaltissueProc.Natl.Acad.Sc1.U.S.ADev.97，7999-8004(2000).[0175]4.Bonner-Weir,S.andG.C.Weir:Newsourcesofpancreaticbeta-cells.Nat.Biotechnol.Dev.23，857-861(2005).[0176]5.Cirillo,L.A.andK.S.Zaret:AnearlydevelopmentaltranscriptionfactorcomplexthatismorestableonnucleosomecoreparticlesthanonfreeDNA.Mo1.CellDev.4,961-969(1999).[0177]6.Cornelius,J.G.,V.Tchernev,K.J.KaoandA.B.Peck:Invitro-generationofisletsinlong-termculturesofpluripotentstemcellsfromadultmousepancreas.Horm.MetabRes.Dev.29，271-277(1997).[0178]7.Dabeva，M.D.，S.G.Hwang,S.R.Vasa,E.Hurston,P.M.Novikoff,D.C.Hixson,S.GuptaandD.A.Shafritz!Differentiationofpancreaticepithelialprogenitorcellsintohepatocytesfollowingtransplantationintoratliver.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.ADev.94，7356-7361(1997).[0179]8.Deutsch，G.，J.Jung,M.Zheng,J.LoraandK.S.Zaret:Abipotentialprecursorpopulationforpancreasandliverwithintheembryonicendoderm.DevelopmentDev.128，871-881(2001).[0180]9.Dor,Y.，J.Brown,0.1.MartinezandD.A.Melton:Adu11pancreaticbeta—cellsareformedbyself-duplicationratherthanstem-celldifferentiation1.NatureDev.429，41-46(2004).[0181]10.Duncan,S.A.,A.NagyandW.Chan:MurinegastrulationrequiresHNF_4regulatedgeneexpressioninthevisceralendoderm:tetraploidrescueofHnf-4(-/-)embryos.DevelopmentDev.124，279-287(1997).[0182]11.Gualdi，R.，P.Bossard,M.Zheng,Y.Hamada,J.R.ColemanandK.S.Zaret:Hepaticspecificationofthegutendoderminvitro:cellsignalingandtranscriptionalcontrol.GenesDev.Dev.10，1670-1682(1996).[0183]12.Gunter,K.C.，T.R.MalekandE.M.Shevach:Tcell-activatingpropertiesofanant1-Thy-lmonoclonalantibody.Possibleanalogyto0KT3/Leu-4.J.Exp.Med.Dev.159，716-730(1984).[0184]13.Hao,E.，B.Tyrberg，P.kin-Ansari，J.key,1.ron，E.nosov,M.rcova,M.rcolaandF.vine:Beta-celldifferentiationfromnonendocrineepithelialcellsoftheadulthumanpancreas.Nat.Med.Dev.12，310-316(2006).[0185]14.He，H.H.，T.Naquet,D.CaillolandM.Pierres:Thy-lsupportsadhesionofmousethymocytestothymicepithelialcellsthroughaCa2(+)-1ndependentmechanism.J.Exp.Med.Dev.173，515-518(1991).[0186]15.Hueber，A.0.，M.PierresandH.T.He:SulfatedglycansdirectlyinteractwithmouseThy-1andnegativelyregulateThy-l-mediatedadhesionofthymocytestothymicepithelialcells.J.1mmunol.Dev.148，3692-3699(1992).[0187]16.Jiang,Y.，B.N.Jahagirdar,R.L.Reinhardt,R.E.Schwartz,C.D.Keene,X.R.0rtiz-Gonzalez,M.Reyes,T.Lenvik，T.Lund,M.Blackstad，J.Du,S.Aldrich，A.Lisberg，W.C.Low,D.A.LargaespadaandC.M.VerfaiIlie:Pluripotencyofmesenchymalstemcellsderivedfromadultmarrow.NatureDev.418,41-49(2002).[0188]17.Jung,J.，M.Zheng,M.GoldfarbandK.S.Zaret!initiationofmammalianliverdevelopmentfromendodermbyfibroblastgrowthfactors.ScienceDev.284，19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