一種獲得轉基因苜蓿的方法及其專用表達載體cpb-ban-gfp的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種獲得轉基因苜蓿的方法及其專用表達載體CPB-BAN-GFP。
【背景技術】
[0002]紅豆草(Onobrychis viciaefolia)為豆科驢豆屬多年生草本，又稱驢喜豆、驢豆，是適口性好且營養價值高的優良牧草，被譽為“牧草皇后” [(I)包桂榮，等.內蒙古民族大學學報(自然科學版)，2011，6(25):640-642; (2)李素群，等.草業學報，1993，6 (2): 52-55。]。紅豆草在各個生長時期，葉片中均可以產生臌脹病防預劑——縮合單寧(CT)，其可使可溶性蛋白質發生凝聚，當反芻家畜采食紅豆草后，可防止蛋白質在瘤胃微生物的作用下，劇烈分解產生氣體而發生的臌脹病，同時增加了過瘤胃蛋白的含量，提高了牧草的營養價值[李素群，等.草業學報，1993，6(2):52-55。]。縮合單寧生物合成途徑是一個較為復雜的過程，有多個酶參與其合成代謝，其中BANYULS(BAN)基因編碼的花色素還原酶(Anthocyanidin reductase, ANR)是此合成途徑后期的關鍵酶[Xie D.Y., etal.Science 2003，299 (5605): 396。]，調控BAN基因的表達水平可以改變CT的積累。BAN基因首先在擬南芥中被分離和驗證，在煙草和擬南芥中超量表達該基因均導致單寧的大量積累和花色素合成的減少，暗示植物中花色素和單寧合成途徑之間可能相互影響[De-YuXie, et al.Archives of B1chemistry and B1physics, 2004，422 (I) 91-102]。最新的研宄發現，在煙草中超量表達蘋果MdANR基因抑制了 DFR和CHI基因的表達，導致花青素合成的顯著下降，同時單寧的單體一一兒茶素和表兒茶素的含量均顯著增加[Han YP, etal.First published online January 20，2012]，這說明 MdANR 不僅能影響單寧合成途徑上游基因表達，而且還可能同時催化兒茶素和表兒茶素兩條合成途徑。
[0003]抗廣譜除草劑草丁膦的bar (bialaphos resistance gene)基因具有較好的抗除草劑抗性[(I)孟靈真等.新疆農業大學學報].2013，36(4):265-268 ； (2)De Block M, etal.EMBO J, 1987,6(9):2513-2518 ;楊竹平等，生物技術與可持續農業[Μ].上海:上海科學技術文獻出版社，2000。]，既針對植物蟲害和大量使用除草劑給植物所帶來的負面影響，又可降低在農業生產中的人力和財力投入。bar基因也是常用的選擇標記基因之一，將它與其它目的基因構建到同一載體上，選擇培養基中加入一定的量就能篩選到含目的基因的轉化細胞。它克服了抗生素篩選的局限性，細胞產生的假轉化體很少。
[0004]綠色焚光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)是一類存在于水母、水媳和珊瑚等腔腸動物體內的生物發光蛋白，無需再加任何底物和輔助因子，在紫外或藍光激發下就能發射綠色熒光[楊明瑜等，食品與生物技術學報，2008，3，27 (2)。]。作為基因選擇，GFP在植物中主要有2個作用:監測基因的表達和蛋白質的定位；并且能作為轉基因植物的分子標記，代替⑶ S 的作用[Jim H, Brad A.Technical Focus, 1995，8 (11): 10-11。]。GFP作為選擇標記基因用來檢測轉基因效率，將其連接到目的基因的啟動子之后，通過測定GFP的熒光強度就可以對該基因的表達水平進行檢測。作為轉基因植株的報告分子GFP，最大的優點是，在不破環細胞和化學染色的情況下直接成像，檢測極為方便[Chalfie M, et al.Science, 1994, (263):802-805。]。
[0005]目前，已報道從紫花苜蓿“中苜I號”幼果中克隆得到了一個ANR基因(BAN編碼的ANR基因，S卩BAN基因)，構建了 MsANR基因的表達載體pCAMBIA1302_MsANR-GFP，將此表達載體通過農桿菌介導法轉化擬南芥。對轉基因植株進行縮合單寧的含量檢測，其含量明顯高于對照植株。([I]王學敏等，中國草地學報.2012，(34)，2:8-15; [2]董潔，紫花苜蓿濃縮單寧合成途徑中DFR和ANR基因的分離及遺傳轉化(博士論文，2012))。已構建的表達載體pCAMBIA1302-MsANR-GFP具有GFP標記基因，方便篩選轉基因植株，其ANR基因來源于紫花苜蓿。紅豆草縮合單寧含量遠遠高于紫花苜蓿，這可能與二者間ANR基因表達差異有關。目前，具有GFP標記基因及抗除草劑bar基因的縮合單寧合成酶BAN基因植物表達載體的構建策略未見相關報道。

【發明內容】

[0006]本發明的目的就是針對上述現有技術中的缺陷，提供了一種獲得轉基因苜蓿的方法及其專用表達載體CPB-BAN-GFP。
[0007]為了實現上述目的，本發明提供的技術方案為:用于獲得一種轉基因苜蓿的植物表達載體，所述植物表達載體為具有綠色熒光蛋白GFP標記基因和抗除草劑bar基因的縮合單寧合成酶BAN基因植物表達載體CPB-BAN-GFP。
[0008]本發明的第二個目的是提供了上述的用于獲得一種轉基因苜蓿的植物表達載體的構建方法，包括以下步驟:
[0009]I)紅豆草花青素還原酶BAN基因的克隆:
[0010]選擇甘肅紅豆草葉片提取RNA并純化RNA，反轉錄合成cDNA第一鏈，PCR擴增BAN基因；將回收的擴增產物連接到T載體轉化大腸桿菌感受態；挑選陽性克隆子搖菌，采用插入失活、滯后質粒篩選、質粒PCR擴增，限制酶切圖譜鑒定，測序；將測序結果進行同源分析；確定縮合單寧合成酶BAN基因，得到重組子為:pMD-BAN ；
[0011]2)綠色熒光蛋白GFP基因的亞克隆:
[0012]挑取pBI 121-Lyz-GFP菌株的單菌落(pBI121-Lyz_GFP菌株的獲得，可參見《pBI121-Lyz-GFP表達載體的構建及其在和田苜蓿愈傷組織中的轉化》，柴燕文等，《農業技術生物學報》2008年05期)，搖菌、提取質粒，PCR擴增GFP基因，將回收的GFP目的片段與T載體連接后轉化大腸桿菌感受態；挑選陽性克隆子搖菌，采用插入失活、滯后質粒篩選、質粒PCR擴增，限制酶切圖譜鑒定，測序，得到重組子為:pMD-GFP ；
[0013]3) CPB-BAN-GFP植物表達載體的構建及鑒定:
[0014]對pMD-GFP進行BamH I和Sma I雙酶切，切下GFP基因；對pMD_BAN進行Sma I和Sac I雙酶切，切下BAN基因；對載體CPB進行BamH I和Sac I雙酶切，通過T4DNA連接酶將具有粘性末端的載體和基因，16°C過夜連接，連接產物轉化感受態E.coli DH5 α，挑選陽性克隆子搖菌，采用插入失活、滯后質粒篩選、質粒PCR擴增，限制酶切圖譜鑒定，得到CPB-BAN-GFP植物表達載體。
[0015]本發明的第三個目的是提供了獲得一種轉基因苜蓿的方法，是將上述的CPB-BAN-GFP植物表達載體通過農桿菌介導法導入苜蓿中，得到具有抗除草劑性質和縮合單寧含量高的轉基因苜蓿。
[0016]進一步的，上述的獲得一種轉基因苜蓿的方法，是采用凍融法將植物表達載體CPB-BAN-GFP轉化至根癌農桿菌LBA4404的感受態細胞中，涂布于含卡那霉素、利福平和鏈霉素的YEB固體培養基上，28°C恒溫培養2d，挑取陽性單菌落，進行PCR鑒定。
[0017]進一步的，上述的獲得一種轉基因苜蓿的方法，將重組農桿菌轉化紫花苜蓿的具體操作包括以下步驟:
[0018]A)種子消毒及培養條件:
[0019]挑選成熟飽滿的種子，自來水室溫浸泡4h，在超凈工作臺中用70%酒精浸泡2min，無菌水沖洗3次，再用0.1 %的升未浸泡lOmin，無菌水沖洗5次，用無菌濾紙吸干種子上的水分，接種到MS培養基中，于25°C培養7?1d左右；
[0020]B)受體材料的制備:
[0021]在高壓滅菌過的培養皿中放入2?3張無菌濾紙，加適量YEB液體培養基使之濕潤，將生長旺盛的紫花苜蓿下胚軸剪切成0.3?0.5cm的小段；
[0022]C)菌株的培養:
[0023]將保存的菌種用接種環挑取農桿菌單菌落用劃線法接種于附加有50 μ g/mL Kan、25 μ g/mL StrJP 25 μ g/mL Rif的YEB固體培養基上，用paraf ilm膜將培養皿封口，并倒置于28°C恒溫箱中培養2d，待菌落長出后置于4°C冰箱中保存，每半月繼代一次；
[0024]D)菌液制備:
[0025]從保存農桿菌的抗性平板上選取分隔良好的單菌落用無菌牙簽接種于5mL的YEB液體培養基(含 50