固定化蛋白質及其用圖
【專利摘要】本發明涉及一種固定化蛋白質材料，包含通過親和標記物結合而固定在玻璃材料或有機聚合物上的蛋白質。玻璃材料可以是多孔玻璃材料諸如(混合)控制孔隙度玻璃。本發明還涉及固定化酶材料在化學合成中作為多相生物催化劑的用途。本發明進一步涉及用于將親和標記的蛋白質固定在玻璃材料或有機聚合物上的方法，并且涉及用于通過將此種蛋白固定在玻璃材料或有機聚合物上來純化和分離親和標記的蛋白質的方法。
【專利說明】
固定化蛋白質及其用途
技術領域
[0001] 本發明涉及固定化蛋白質材料，其包含通過親和標記物結合而被固定在玻璃材料 或有機聚合物上的蛋白質。玻璃材料可以是多孔玻璃材料，諸如(混合)控制孔隙度玻璃。本 發明還涉及固定化酶材料在化學合成中作為多相生物催化劑的用途。本發明進一步涉及用 于將親和標記的蛋白質固定在玻璃材料或有機聚合物上的方法，并且涉及用于通過將這種 蛋白質固定在玻璃材料或有機聚合物上而純化和分離親和標記的蛋白質的方法。
【背景技術】
[0002] 蛋白質是由氨基酸殘基的一條或多條直鏈組成的大生物分子。酶是特定組的蛋白 質，它們在所有活細胞的新陳代謝中充當生物催化劑。因此，酶能夠將有機分子轉化為不同 的分子。由于每種特定酶的特定三維結構，僅非常少的有機分子會與酶的活性位點以可以 發生轉化的方式相互作用。因此，酶通常是高選擇性催化劑，并且由于此原因，酶在合成有 機化學中用作催化劑是非常有吸引力的。然而，由于酶是為細胞環境而進化出的生物分子， 因此它們通常不適合其它環境。當在有機溶劑中使用時，酶傾向于聚集且經常展開（即，變 性）。因此，吸引人的是將酶固定在固體載體上并且以這種固定狀態將它們用作催化劑，因 為這可以改善酶的穩定性，允許酶正常不能耐受的反應條件并且還有助于從反應混合物的 分離和材料的回收。
[0003] 已經使用不同的技術和不同的固體載體完成了酶在固體載體上的固定化 (Tischer和Wedekind，"Immobilized Enzymes：Methods and Applications"，Topics in Current Chemistry，1999,第200卷，第95-126頁；Brena和Batista-Viera， "Immobilization of Enzymes :A Literature Survey^,Methods in Biotechnology： Immobilization of Enzymes and Cells，2006，第二版，第 15-30頁）。
[0004] 酶到固體表面的吸附可導致酶與固體載體之間的不期望的相互作用。已經表明， 蛋白質吸附到二氧化硅納米顆粒可以引起蛋白質的二級結構的變化，這可導致酶的失活 (Lundqvist et al.，Langmuir 2004,第20卷，第 10639-10647頁）。因此，重要的是，固體載 體不干擾固定化酶的結構和活性。
[0005] 固定化金屬離子親和色譜（IMAC)是用于純化蛋白質的技術，其基于蛋白質對金屬 離子(諸如?62+、〇! 2+、21!2+、附2+和(：〇2+)的親和度。金屬離子被固定在瓊脂糖凝膠上并且可以 選擇性吸附含有組氨酸的蛋白質和含有半胱氨酸的蛋白質(Porath et al.，Nature 1975， 第258卷，第598-599頁）。這種技術的改進版本使用含有融合聚組氨酸肽的重組蛋白質。由 于與單組氨酸殘基相比聚組氨酸肽對于固定化金屬離子具有高得多的親和力，因此能夠實 現的純化水平高得多（Ho chuli等，Nat.Biotec hnol . 1988,第6卷，第1321-1325頁； Ljungquist等，Eur · J · Biochem · 1989，第186卷，第563-569頁）。雖然該技術能夠被成功地應 用在用于純化和分離蛋白質的色譜程序種，但是凝膠固定化酶不太適合在有機合成中用作 多相催化劑。另外，IMAC技術主要局限于含水條件。
[0006] 在制備多相催化劑的嘗試中，已經應用基于頂AC的親和標記物結合原理來將聚組 氨酸標記的酶固定在改性的二氧化娃上(Cassimjee等，Biotechnol .Bioeng. 2008,第99卷， 第712_716頁；Cassimjee等，Biotechno 1. J. 2011，第6卷，第463-469頁）。這對于南極假絲酵 母脂肪酶B(CalB)的效果很好，但是發現其它較不穩定的酶在二氧化硅的存在下失活，特別 是在有機溶劑的存在下。在文獻中已知的是，二氧化硅納米顆粒對于蛋白質具有失穩效應 (Lundqvist等，Langmuir 2004,第20卷，第10639-10647頁）。
[0007]控制孔隙度玻璃(CPG)是已經用于酶的固定化的另一種材料。通常使用3-氨基丙 基三乙氧基硅烷處理CPG，此后使用戊二醛作為交聯劑，使得酶通過存在于酶表面上的賴氨 酸殘基結合到氨基丙基-CPG。這導致酶非特異性地結合到CPG，常伴隨有酶活性的損失。這 種方法的另一缺點是，待固定的酶在固定步驟之前必須從其它酶中純化，從而避免不同酶 的混合物固定至CPG上。
[0008] 還已經公開了使用有機鈦酸酯（〇找311〇1:;^3仙七6)(1]3 4,632,904)或使用多糖層 和 1，Γ -二羰基二咪唑將酶固定在CPG上（Rogalski等，J ·Mol · Catal · B: Enzym· 1999，第6卷， 第29-39頁）。
[0009] Ellgstrom等（Angew.Chem. Int ·Ed. 2013，第52卷，第14006 -14010頁）公開了復合 催化劑，其中將南極念珠菌脂肪酶B和納米鈀物質共同固定到介孔二氧化硅的隔室中。
[0010] 在化學工業中將酶作為催化劑（即生物催化劑)使用是實現更高可持續性、更少毒 性廢物和更高成本效益的關鍵。然而，酶的高成本以及在將酶固定到固體載體上之后頻繁 觀察到的活性損失是這一發展中的障礙。允許酶再利用的用于酶固定的標準化且一般可行 的程序將是高度期望的。盡管在最近幾年取得了進展，但是仍然沒有用于通過酶的固定化 而制備多相催化劑的通用且簡單的方法。因此，仍然存在對于改進的用于將酶固定在固體 載體上的方法，以及對于能夠應用于含水和有機反應條件的有機合成中的穩定的多相生物 催化劑的需要。
【附圖說明】
[0011 ]圖1顯示了使用聚組氨酸(polyhistidine，多組氨酸)標記的酶和作為螯合金屬的 Co2+，由氨基-(Hyb)CPG到固定化的酶CPG-材料的制備。基團R是適合的連接基，并且因 CPG產 品而不同。示意性地描繪了鈷離子到2,4_二羥基苯基殘基和聚組氨酸標記的酶的螯合。
[0012] 圖2顯示了使用聚組氨酸標記的酶、Co2+作為螯合金屬以及鈀作為金屬納米顆粒， 由氨基-(Hyb)CPG到含有CPG材料的固定化酶和金屬納米顆粒的制備。基團R是適合的連接 基，并且因 CPG產品而不同。示意性地描繪了鈀納米顆粒到CPG材料的結合以及鈷離子到2， 4-二羥基苯基殘基和聚組氨酸標記的酶的螯合。
【具體實施方式】
[0013] 已經令人驚奇地發現，通過親和標記物結合將蛋白質固定在多孔玻璃材料或多孔 有機聚合物上，獲得了在固定化蛋白質的穩定性方面具有改進性能的固定化蛋白質材料， 并且其中，維持了蛋白質的生物功能。發現固定化酶的制劑具有高催化活性，這使得它們在 生物催化中是有用的。
[0014] 根據本發明，通過結合到附著到多孔玻璃材料或多孔有機聚合物的親和基質上的 特定基團，固定化含有親和標記物的蛋白質。由于親和標記物對于基質上的特定基團的高 結合親和力，因此蛋白質到基質的結合是強的且高度特異性的。因此，本發明提供了用于蛋 白質(諸如酶)的純化和固定化的通用方法。
[0015] 在第一方面中，本發明涉及固定化蛋白質材料，其包含載體和固定在該載體上的 至少一種蛋白質，其中載體包含親和基質附著至其的載體材料，所述載體材料選自由以下 組成的組：
[0016] (a)控制孔隙度玻璃(CPG);
[0017] (b)混合控制孔隙度玻璃(混合CPG);和
[0018] (C)多孔有機聚合物；
[0019] 并且其中至少一種蛋白質含有親和標記物并且通過至親和基質的特異性親和結 合而固定在載體上。
[0020] 蛋白質通過親和標記物在載體上的固定化賦予了蛋白質在預定位點的特異性結 合的優勢。然而，與此同時，固定化方法一般適用于許多不同的蛋白質。在本發明中使用的 親和標記物可以是能夠特異性地結合到其具有親和力的基質的任何標記物。親和結合可以 是例如范德華相互作用、氫鍵、離子鍵或疏水相互作用的結果。在任何情況下，親和結合應 當足夠的強以允許親和標記物和基質保持緊密地彼此結合，至少直到施加某些特定條件以 將親和標記物從基質解離。
[0021] 在另一方面中，本發明涉及用于蛋白質的固定的載體，包含親和基質附著至其的 載體材料，所述載體材料選自由以下組成的組：
[0022] (a)控制孔隙度玻璃(CPG);
[0023] (b)混合控制孔隙度玻璃(混合CPG);和 [0024] (c)多孔有機聚合物；
[0025]并且其中蛋白質通過與親和基質的特異性親和結合而固定在載體上。
[0026]待固定在載體上的蛋白質可以是含有未和標記物的任何蛋白質，諸如含有未和標 記物的（重組)蛋白質或酶。優選地，蛋白質是含有親和標記物的酶。應當理解的是，標記物 對于附著到載體的親和基質應當具有特異性親和力。
[0027]許多親和標記物及相應的基質在本領域中是已知的。在本發明中可以有用的親和 標記物的實例以及基質上的相應基團列于下表中： 「00281
[0029] 在優選的實施方式中，蛋白質上的親和標記物是聚組氨酸標記物并且附著到載體 上的親和基質含有螯合的金屬離子。螯合的金屬離子優選的是選自由Fe 2+、Fe3+、C〇2+、Ni 2+、 Cu2+和Zn2+組成的組的金屬離子，并且更優選地是選自由Fe3+、Ni 2+和Co2+組成的組的金屬離 子。在優選的實施方式中，螯合的金屬離子是Co2+。在另一優選的實施方式中，螯合的金屬離 子是Fe 3+。
[0030] 螯合的金屬離子的選擇可取決于預期的用途。例如，如果載體要用于親和標記的 蛋白質的純化和分離，那么酶與載體的結合應當是可逆的。在此種情況下，優選的是，螯合 的金屬離子為Ni 2+或Co2+，并且最優選Co2+。這些金屬離子足夠強的結合以固定聚組氨酸標 記的酶，但是當施加特定的條件時也能夠釋放固定化酶，諸如使用含有咪唑或乙二胺四乙 酸鹽(EDTA)的緩沖溶液處理。
[0031] 為了在多相生物催化中使用固定化酶，期望酶與載體的強結合。在此種情況下，優 選的是螯合的金屬離子為Co2+或Fe 3+，并且最優選Fe3+，因為這會導致聚組氨酸標記物與載 體特別強的結合。如在實例中所表明的，從包含Fe 3+作為螯合金屬離子的固定化蛋白質材料 中浸出的酶或金屬離子幾乎可以忽略不計。不存在浸出使得固定化蛋白質材料(生物催化 劑）以催化量使用。催化量的使用在連續流反應中尤為重要。
[0032] Fe3+作為螯合金屬離子的另一優點是，這種金屬是無毒的。所產生的固定化蛋白質 材料由此可以安全地應用在例如食品工業中。
[0033] 用于親和標記的蛋白質的基質通過適合的連接基附接到載體的表面。控制孔隙度 玻璃(CPG)的表面含有游離硅烷醇（Si-ΟΗ)基團，其能夠通過共價鍵附接到連接基分子。通 常，使表面與雙官能烷基硅烷連接基分子(其鏈長度和結構可以不同）反應，由此硅原子與 玻璃表面硅烷醇基團共價結合并且其中硅烷的末端基團是官能團，諸如醛、胺、環氧基團、 鹵化物、或羧酸衍生物。應當使用的適合官能團將取決于待附接到CPG表面的基質的性質。 用于通過適合連接基將基質附接到CPG表面的方法是本領域技術人員已知的。
[0034] CPG是強健且惰性的玻璃材料，其可以被生產為尺寸控制的大孔或介孔的顆粒。 CPG的銳利的孔徑分布可以在約10至300nm直徑的孔徑變化。這提供了有利的微環境而沒有 由于空間位阻引起的復雜情況。互連的孔結構導致低的溶液流動阻力并且促進反應物和產 物在整個材料間的物質轉移。CPG的剛性結構提供了堅固的、不可壓縮的介質，其適合于高 通量的反應器設計和在高流速下的線性規模擴大。該材料在溶劑中顯示出有限的溶脹性， 并且在大多數有機介質和pH低于10的含水環境中是化學和尺寸穩定的。
[0035]常規CPG表現出配體負載能力，其與其孔尺寸負相關。因此，較大孔徑的CPG載體不 能負載與較小孔尺寸的CPG載體一樣多的蛋白質。這部分地是由于孔尺寸和表面積之間的 負相關，并且部分地是由于充當官能化基團的表面可及的硅醇基團具有限定的每單位面積 的密度，約4.5μπιο 1 /m2。常規的CPG展現出非均勻的硅烷醇分布，其中空間位阻的硅醇位點 不能作為官能附著點。
[0036] 混合控制孔隙度玻璃（混合CPG或HybCPG)是CPG的變體，其中CPG的內表面和外表 面涂覆有約l〇nm的交聯有機聚合物的膜，如W02009/005631中所描述的。混合CPG上的聚合 物涂層可以含有官能團，諸如醛、氨基、環氧基、鹵化物、羧酸和酯、或它們的混合物，基質可 以附接至該官能團。用于將基質附接到適合的官能團的方法是本領域技術人員已知的。
[0037]相對于常規CPG，混合CPG提供了某些優點。作為聚合物涂層的結果，可以最小化負 載和孔徑之間的依賴性，并且可以更精確且均勻地控制官能化位點之間的間隔。混合CPG作 為用于蛋白質固定化的載體材料可以提供額外的益處，因為可以修整聚合物涂層的設計， 從而提供給定應用期望或所需要的表面特性。例如，均相聚合物如聚苯乙烯可以產生更疏 水的載體表面，同時均相聚合物如聚丙烯腈可以產生更親水的載體表面。通過使用兩種或 更多種不同聚合物的混合物，可以獲得共聚合物涂層，其中載體表面的特性特別適于給定 的應用。薄層涂層允許在有機溶劑中一定程度的微小溶脹，但是不具有混合CPG床的體積膨 脹或背壓的增加。該涂層還允許混合CPG在大于pH 10的含水環境中使用。
[0038] 在整個說明書的其余部分以及所附的權利要求書中，對CPG的任何提及均被解釋 為包括(常規)CPG和混合CPG兩者，除非另有具體說明。
[0039] 由于諸如較高的成本效益或特定的加工要求的原因，因此可能需要除了CPG和 HybCPG之外的其他載體材料。此種材料包括多孔有機聚合物(塑料)材料。這些聚合物使用 官能團（諸如醛、氨基、環氧基、鹵化物、羧酸或酯類、或它們的混合物)官能化，基質可以附 接至該官能團。用于將基質附接到適合官能團的方法是本領域技術人員已知的。官能化的 塑料可以被生產為具有有限溶脹的多孔顆粒。適合的有機聚合物可以基于單體諸如苯乙 烯、乙烯、丙烯、丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸甲酯。此種有機聚合物的實 例包括官能化聚乙烯、超高分子量聚乙烯(UHMWPE)、高密度聚乙烯(HDPE)、聚丙烯(PP)、聚 四氟乙烯(PTFE)和聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯和聚（甲基丙烯酸甲 酯）。在優選的實施方式中，多孔有機聚合物是官能化的聚苯乙烯或官能化的聚甲基丙烯酸 酯。
[0040] 本文描述的親和標記的蛋白質至HybCPG的附接表明了使用多孔有機聚合物載體 的可能性，因為HybCPG中的多孔表面是有機聚合物本身。HybCPG較大地維持了CPG的不可壓 縮和非溶脹的性質，同時可以利用有機聚合物的表面性能。當不需要CPG的剛性時，單獨的 有機聚合物似乎是更好的選擇。因此，在本文中表明了向此種材料施加親和標記物附接的 方法。
[0041 ]如圖1所概括的，CPG-固定化蛋白質材料可以由氨基-CPG或氨基-HybCPG開始，僅 以幾個步驟容易地生產。例如，可以使用2,4_二羥基苯乙酮處理CPG材料，從而通過亞胺將 苯基團連接到CPG。如果需要，此后可以使用適合的還原劑，如，例如硼氫化鈉、氰基硼氫化 鈉或氫化鋁鋰，將亞胺官能團還原為相應的胺。隨后，可以通過將所述材料分別懸浮在 C〇Cl2或FeCl3的含水溶液中以引入螯合金屬離子，諸如Co 2+或Fe3+。干燥之后，可以將獲得的 材料直接用作用于一種或多種聚組氨酸標記的蛋白質的結合基質。
[0042]以如上為CPG和HybCPG所描述的類似方式，可以產生其中載體材料為有機聚合物 的固定化蛋白質材料。
[0043]聚組氨酸標記物對金屬離子如Co2+或Fe3+的高親和力允許由含有蛋白質的粗溶液 進行聚組氨酸標記的蛋白質的固定化，而無需在固定化步驟之前對該溶液進行徹底的純 化。不含聚組氨酸標記物的有機材料僅將微弱地結合或根本不結合螯合金屬離子，并且通 過使用例如水或緩沖含水溶液洗滌將從最終固定化蛋白質材料容易地被除去。因此，如果 聚組氨酸標記的蛋白質是通過細胞內過表達來制備的，那么可以直接由細胞裂解物進行蛋 白質的固定化。可替換地，如果聚組氨酸標記的蛋白質是由宿主有機體分泌的，那么可以直 接由細胞培養上清液進行蛋白質的固定化。
[0044] 因此，在另一方面中，本發明涉及用于親和標記的蛋白質的固定化的方法，包括以 下步驟：
[0045] i)將親和標記的蛋白質固定在包含附接有親和基質的載體材料的載體上，所述載 體材料選自由以下組成的組：
[0046] (a)控制孔隙度玻璃(CPG);
[0047] (b)混合控制孔隙度玻璃(混合CPG);和
[0048] (c)多孔有機聚合物；以及
[0049 ] i i)可選地用水或適合的緩沖液洗滌固定化蛋白質材料。
[0050] 在又一方面中，本發明提供了用于制備固定化蛋白質材料的方法，所述方法包括：
[0051] i)提供含有氨基的載體材料，所述載體材料選自由以下組成的組：
[0052] (a)控制孔隙度玻璃(CPG);
[0053] (b)混合控制孔隙度玻璃(混合CPG);和
[0054] (c)多孔有機聚合物；
[0055] ii)使載體材料與2,4-二羥基苯乙酮反應，從而將二羥基苯基基團連接至載體材 料；
[0056] iii)在二羥基苯基和能夠結合聚組氨酸標記的蛋白質的金屬離子之間形成螯合 絡合物;和
[0057] iv)將聚組氨酸標記的酶結合到包含所述金屬離子的載體材料。
[0058] 可選地，如上所述的用于制備固定化蛋白質材料的方法進一步包括將過渡金屬納 米顆粒結合到載體材料。
[0059] 在一個實施方式中，載體是控制孔隙度玻璃(CPG)。在另一實施方式中，載體是混 合控制孔隙度玻璃(混合CPG)。在又另一實施方式中，載體是多孔有機聚合物。
[0060] 在優選的實施方式中，該方法包括親和標記的蛋白質在CPG或混合CPG上的固定 化。在另一優選的實施方式中，親和標記的蛋白質是聚組氨酸標記的酶并且親和基質含有 螯合金屬離子。在更優選的實施方式中，該方法包括聚組氨酸標記的酶在CPG或混合CPG上 的固定化，其中使用的螯合金屬離子是Co 2+或Fe3+。
[0061] 在另一方面中，本發明提供了通過如上所述的方法可獲得的固定化蛋白質材料。 [0062] 使用標準頂AC方法可以實現結合蛋白質的解離。例如通過降低pH或通過添加對螯 合金屬離子具有與聚組氨酸基團相等或更高親和力的競爭性分子，如通過添加含有咪唑或 乙二胺四乙酸鹽(EDTA)的緩沖溶液，可以將結合蛋白質從載體釋放。在純化的蛋白質從載 體解離后，如果必要，可以通過本領域已知的技術，例如通過使用適合的酶，諸如特異性蛋 白酶裂解親和標記物將聚組氨酸標記物從蛋白質上去除，由此獲得純的無標記物的蛋白 質。
[0063] 因此，在又一方面中，本發明涉及用于純化和分離親和標記的蛋白質的方法，包括 以下步驟：
[0064] i)將親和標記的蛋白質固定在包含附接有親和基質的載體材料的載體上，所述載 體材料選自由以下組成的組：
[0065] (a)控制孔隙度玻璃(CPG);
[0066] (b)混合控制孔隙度玻璃(混合CPG);和
[0067] (c)多孔有機聚合物；
[0068] i i)可選地使用水或適合的緩沖液洗滌固定化蛋白質材料;和 [0069] iii)從親和基質解離純化的蛋白質。
[0070] 固定化步驟可以在適合的緩沖液中進行。如果必要，此后可以使用水或適合的緩 沖液洗滌固定化蛋白質材料，以從固定化蛋白質材料中除去任何未結合的蛋白質以及其它 不期望的化合物。從親和基質解離純化的蛋白質可以通過應用適合于特定親和標記物的條 件來實現。用于解離不同親和標記物的適合條件在本領域中是眾所周知的。
[0071] 該方法可以可選地包括另外的步驟iv)從純化的蛋白質中除去親和標記物。
[0072]在優選的實施方式中，該方法包括純化和分離CPG或混合CPG上的親和標記的蛋白 質。在另一優選的實施方式中，親和標記的蛋白質是聚組氨酸標記的酶并且親和基質含有 螯合金屬離子。在更優的實施方式中，該方法包括純化和分離CPG或混合CPG上的聚組氨酸 標記的酶，其中所使用的螯合金屬離子是Co 2+。
[0073] 如果如上所述固定在載體上的蛋白質是酶，那么它們含有能夠催化化學反應的活 性位點。因此，固定化酶材料作為有機合成中的生物催化劑是潛在有用的。因此，在另一方 面，本發明涉及本文所公開的固定化酶材料作為多相生物催化劑的用途，例如，在合成有機 轉化中。本發明進一步提供了用于催化酶催化的反應的方法，包括提供根據本發明的固定 化蛋白質材料，以及使所述固定化蛋白質材料與至少一種底物接觸，固定在載體上的酶能 夠對該底物起作用。
[0074] 如本文所公開的，酶通過親和標記物結合而固定在載體上改善了所使用的酶的穩 定性。已經發現，固定化酶耐受含水條件以及各種不同的有機溶劑。這使得固定化酶材料能 夠在游離非固定化酶本來不穩定的反應條件中使用。可能的是，固定化酶材料還可以在比 游離非固定化酶所耐受的pH范圍更寬的pH范圍內使用。
[0075] 當從粗(未純化的）配制品中結合酶時，所產生的固定化蛋白質材料由富集化的酶 組成。由于保留了酶方法的天然活性，因此固定化制劑表現出比初始非固定化蛋白質材料 更高的每蛋白質量的催化活性。
[0076] 本發明的另一個優點是可以容易地回收固定化酶材料。由于固定化酶材料是多相 催化劑，因此可以通過過濾簡單地從反應混合物中收集該材料。此后，如果在純化材料之后 必要，可以在另外的反應中再利用該材料。特別是對于昂貴和/或難以培養的酶，回收固定 化酶材料的可能性是重要的方面。
[0077] 固定在載體上的酶可以是在有機合成轉化中作為生物催化劑有用的任何酶，包括 但不限于充當氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂解酶、異構酶和連接酶的酶。因此，固定化酶 材料可以在任何有機反應中被用作多相生物催化劑，其中固定化酶能夠特異地催化反應。 此種生物催化反應的例子包括但不限于酶促氧化和還原反應、酶促水解反應和酶促異構化 反應。特別有用的生物催化反應是對映選擇性反應。生物催化反應的具體例子包括使用脂 肪酶選擇性酰化醇或胺、使用ω -轉氨酶的轉氨基作用、使用CYP P450或拜爾-維利格 (Baeyer-Villiger)單加氧酶的單加氧、使用醇脫氫酶氧化醇或還原酮/醛、以及使用單胺 氧化酶氧化胺。
[0078] 在一個實施方式中，可以將兩種或更多種不同的酶固定到載體上，其中不同的酶 中的每種能夠催化不同的反應。那么在多步或級聯反應中可以使用含有兩種或更多種不同 固定化酶的材料作為多相生物催化劑。例如，此種級聯反應可以是其中兩種或更多種酶催 化的反應以兩個或更多個后續步驟在底物上進行的反應，（即其中將第一酶的底物轉化成 第二酶的底物等等的反應），諸如，通過ω -轉氨酶的氨基轉移反應隨后為通過脂肪酶的酰 化反應。可替換地，此種級聯反應可以是其中通過第一酶轉化底物并且其中由第二酶再生 用于第一酶的輔因子的反應，諸如通過醇脫氫酶選擇性/特異性還原酮/醛，同時伴隨通過 甲酸脫氫酶再生消耗的NADH。
[0079] 當兩種或更多種不同的酶被固定在載體上時，如果不同的酶含有相同的親和標記 物，如聚組氨酸標記物時是方便的。由于每種酶對于螯合金屬離子的結合親和力是相等的， 因此不同的酶將同樣強地結合到載體。因此，理論上，當使用等量的具有相同親和標記物的 η種不同酶時，載體上每種不同酶的量將為1/η(不考慮任何擴散效應）。
[0080] 對于使用具有兩種或更多種不同固定化酶的固定化蛋白質材料，并且其中不同的 酶顯示出催化活性的差異的級聯反應，與具有較高催化活性的酶的量相比，固定更大量的 具有較低催化活性的酶可能是有利的。這將加速決定速率的步驟，并且提高反應級聯的總 速率。
[0081] 可替換地，可以通過以所需的比率混合一種或多種不同的固定化酶材料來進行級 聯反應。
[0082] 在另一方面，本發明提供了用于催化酶催化的多步或級聯反應的方法。在此方面 中，該方法包括提供固定化蛋白質材料，該固定化蛋白質材料包含根據本發明的兩種或更 多種固定化酶，以及使所述固定化蛋白質材料與至少一種底物接觸，固定在載體上的酶能 夠對該至少一種底物起作用。
[0083]在另一個實施方式中，固定化酶材料另外包含金屬納米顆粒，諸如過渡金屬的納 米顆粒，例如但不限于鈷、鎳或鈀。包含金屬納米顆粒的材料可以例如通過將氨基-CPG或氨 基-HybCPG浸泡于適合量的金屬鹽(如(：〇(：1 2、附(：12、1^屮(1(：14、？(1(：12或?(1〇?4)2)在乙腈或水 或它們的混合物中的溶液中來制備。此后，通過添加過量的適當的還原劑如氫化鈉、硼氫化 鈉、氰基硼氫化鈉、氫化鋁鋰等，將金屬離子還原為金屬納米顆粒。在添加2，4-二羥基-苯乙 酮時，初始形成的亞胺被立即還原為相應的胺。在通過洗滌去除還原劑之后，然后通過將材 料分別懸浮于C 〇Cl2、FeCl3或NiCl2的含水溶液中，將金屬離子諸如Co 2+、Fe3+或Ni2+螯合在基 質上。干燥之后，所獲得的材料可以被直接用作用于一種或多種聚組氨酸標記的酶的基質； 參見圖2。
[0084]盡管不希望受到理論的限制，但據信金屬納米顆粒通過CPG材料上的氨基結合到 CPG材料上。還可以想的是，通過金屬離子的還原形成的金屬納米顆粒的尺寸足夠大以陷入 CPG材料的孔中。
[0085] 含有固定化酶和金屬納米顆粒二者的固定化蛋白質材料可以在組合的酶催化反 應和過渡金屬催化反應中用作多相生物催化劑。此種反應的例子包括但不限于動態動力學 拆分反應。此種反應的具體例子是如所附實施例所示的，通過由Pd納米顆粒將胺外消旋化， 之后使用脂肪酶酰化的胺的動態動力學拆分。
[0086] 因此，在又一方面中，本發明提供了用于催化組合的酶催化和和過渡金屬催化的 反應的方法。在此方面中，該方法包括提供根據本發明的另外包含過渡金屬納米顆粒的固 定化蛋白質材料，和使所述固定化蛋白質材料與至少一種底物接觸，固定在載體上的酶和 過渡金屬能夠對該至少一種底物起作用。
[0087] 本文公開的固定化蛋白質材料的實例及此種材料的用途在實驗部分進行了描述。
[0088]
[0089] 親和標記物"是指附接到重組蛋白并且能夠結合到固定在基質上的特定基 團的定義基團，諸如有機或有機金屬分子、蛋白質片段或其他。親和標記物的實例是聚組氨 酸標記物、谷胱甘肽S-轉移酶(GST)標記物、幾丁質結合蛋白（CBP)標記物、麥芽糖結合蛋白 (MBP)標記物、FLAG-標記物、親和素蛋白標記物或鏈親和素標記物。親和標記物也可以被稱 為融合標記物。
[0090]如本文中所使用的，術語"親和標記的蛋白質"是指其中如上所定義的親和標記物 已經被添加到靶蛋白質的重組蛋白。親和標記的蛋白質可以通過重組DNA技術使用本領域 中已知的方法，如通過DNA片段的接合或通過PCR技術來制備。親和標記的蛋白質也可以稱 為"融合標記物蛋白質"或"融合蛋白質"。
[0091] 術語"聚組氨酸標記物"是指附接到蛋白質的C-末端或N-末端的至少兩個組氨酸 殘基的鏈。聚組氨酸標記物優選地為至少六個組氨酸殘基的鏈。用于聚組氨酸標記物的其 它常用名稱為polyHis標記物、組氨酸標記物、六組氨酸-標記物、6xHis-標記物和His 6標記 物、以及His-tag?。
[0092] 術語"聚組氨酸標記的酶"是指其中靶酶與以上定義的聚組氨酸標記物融合的重 組酶。
[0093]如本文中所使用的，術語"氨基-CPG"是指通過適合的連接基使用氨基官能化的 CPG材料。如本文中所使用的術語"氨基-HybCPG"是指混合CPG材料，其中聚合物涂層含有氨 基。
[0094] 借助下列實施例進一步闡明本發明，但這些實施例在任何方面均不限制本發明。 所有引用的文獻和參考資料均通過引證并入本文。
[0095]
[0096] aw水活度
[0097] AlaDH來自枯草芽孢桿菌(B.subtilis)的丙氨酸脫氫酶
[0098] CalA南極念珠菌脂肪酶A(也被稱為南極假絲酵母(Pseudozyma antarctica)脂 肪酶A)
[0099] CalB南極念珠菌脂肪酶B(也稱為南極假絲酵母脂肪酶B)
[0100] DCM 二氯甲烷
[0101 ] 2,5_01(0\10來自惡臭假單胞菌(？8611(1〇1]1〇仙8口111:1(^)的2,5-二酮莰燒單加氧酶
[0102] equiv.當量
[0103] EtOAc乙酸乙酯 [0104] FMN黃素單核苷酸
[0105] FRE來自大腸桿菌的黃素還原酶
[0106] GC氣相色譜
[0107] HEPES 4-(2-輕乙基）哌嗪-1-乙磺酸 [0108] IPTG異丙基-β-D-硫代半乳糖苷
[0109] min 分鐘
[0110] MOPS 3-(N-嗎啉代)丙磺酸
[0111] MTBE甲基叔丁基醚(或叔丁基甲基醚）
[0112] NADH煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(還原形式）
[0113] PLP吡哆醛5-磷酸酯
[0114] SDS-PAGE十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳
[0115] Tris三(羥甲基)氨基甲烷
[0116] ω-TA 來自紫色色桿菌（Chrimobacterium violaceum)的 ω -轉氨酶
[0117] 實驗方法
[0118] CPG材料獲自Prime Synthesis，Inc.，（Aston，PA，USA)。在實施例中使用了下列控 制孔隙度玻璃材料：
[0119] · LCAA CPG是使用長鏈烷基胺衍生化的CPG(CPG-0502-N12)。
[0120] ?共聚-HybCPG-胺(在下文中也被稱為"HybCPG copo"）是涂覆有由1:1的丙烯腈： 乙烯基芐基氯形成的共聚物并且原位交聯的混合CPG。
[0121] · VBC HybCPG-胺(在下文中也被稱為"HybCPG VBC"）是涂覆有由乙烯基芐基氯單 體形成的聚合物并且原位交聯的混合CPG。
[0122] 如在W0 2009/005631中所描述的，涂層的（共)聚合物使用雙官能胺交聯。此后，通 過與鄰苯二甲酰亞胺鈉反應，隨后使用肼進行脫鄰苯二甲酰化來將氨基引入到氯聚合物涂 層上。
[0123] 在實施例中使用了下列多孔有機聚合物：
[0124] ?"中溶脹聚苯乙烯"（購自3-Prime LLC，USA;件號04-02-03-32)，氨基官能化的 聚苯乙稀載體。孔徑~1000 A(非常寬的分布），粒徑lOOwn，胺負載222ymol/g。
[0125] ?"低溶脹甲基丙稀酸酯共聚物"（購自SPRIN Technologies S.p.A.，意大利;件 號1A02BN)，氨基官能化的甲基丙烯酸酯載體。孔徑未知，粒徑100-300μπι，胺負載270μπι〇1/
[0126] 如Cassimjee等(ACS Catal.2011，第1卷，第1051-1055頁）中的描述，進行來自紫 色色桿菌的過表達的ω-轉氨酶的培養。如_S:andst_ri3m等(Protein Eng Des Sel.2009,第 22卷，第413-420頁）中的描述，進行過表達的南極念珠菌脂肪酶A的培養。如Engstr&n等 (Org. Biomol. Chem. 2011，第9卷，第81-82頁）中的描述，進行過表達的南極念珠菌脂肪酶B 和CalB Trpl04Ala(脂肪酶B的不穩定的變體）的培養。如Kadow等(AMB Express 2011，1: 13)中的描述，進行來自惡臭假單胞菌的過表達的2,5_二酮莰烷單加氧酶的培養。如Kadow 等(厶口口1.]\1;[(31'013；[01.13;[(^6(3111101.2013,2013年11月5日網上發表）中的描述，進行來自大腸 桿的過表達的黃素還原酶的培養。如Mutti等(EurJ.0rg.Chem.2012,第5期，第1003-1007 頁）中的描述，進行來自枯草芽孢桿菌的過表達的丙氨酸脫氫酶的培養。當不存在時，通過 ?0?向基因中添加1^86 -標記物。根據1^丨1§31^0丨11等(0坪.13;[01]1〇1.〇16111.2011，第9卷，第81-82 頁）中描述的程序，將聚組氨酸標記的CalA和CalB固定在Accurel上。
[0127] 實施例
[0128] 實施例1
[0129] 用于固定和純化聚組氨酸標記的酶的螯合CPG載體的制備
[0130] 在甲醇(200mL)中，使用2,4-二羥基苯乙酮(為0?6的氨基官能度的1.5叫11".）將 所需類型的氨基_CPG(5g)持續攪拌處理60min。使用連接攪拌，通過依次加入硼氫化鈉 (4equiv.)將所形成的亞胺還原60min。過濾固體材料，使用飽和碳酸鈉水溶液、水并且然后 乙醇沖洗，然后在80°C下干燥2小時。然后將顆粒浸泡在C 〇Cl2的飽和水溶液（100mL)中。在 過濾以及使用水和乙醇沖洗之后，在80°C下將顆粒干燥2小時。表1中示出了不同螯合CPG材 料的性能。
[0131]
[0132] 類似于上述程序制備含有Fe3+作為螯合金屬離子的載體，但是使用FeCl3的水溶液 代替C0CI2。
[0133] 實施例2
[0134] 用于固定和純化聚組氨酸標記的酶的螯合多孔聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸酯載體 的制備
[0135] 在甲醇（50mL)中，使用2,4_二羥基苯乙酮(為塑料的氨基官能度的1.5equiv.)將 洗滌(水/乙醇l:l，400mL)且干燥的(過濾后真空16h)期望類型（見下）的氨基官能化的多孔 有機聚合物顆粒(2g)持續攪拌處理60min。用持續攪拌，通過依次添加硼氫化鈉(4equi V.) 將所形成的亞胺還原60min。過濾固體材料，使用飽和碳酸鈉水溶液、水并且然后乙醇沖洗， 然后在真空中在25°C下干燥16小時。
[0136] 然后將所述顆粒浸泡于CoCl2的飽和水溶液（100mL)中。過濾并且使用水及乙醇沖 洗后，在真空中在25°C下將顆粒干燥16小時。表2中示出了不同螯合多孔塑料載體的性能。
[0137]
[0138] 實施例3
[0139] 聚組氨酸標記的酶在螯合載體上的固定化
[0140] 使用未經緩沖的含有CalA或CalB的細胞培養上清液。通過在HEPES緩沖液(50mM， 500mM NaCl，pH 8.3)中的細胞再懸浮制備ω -ΤΑ的細胞裂解液。在添加清潔劑(BugBuster? 10X，N〇vagen)之后，通過離心去除細胞碎片。將螯合CPG載體浸泡于裂解液或上清液中，隨 后在軌道搖床（150rpm)上攪拌。在固定化過程中Bradf ord分析的溶液的樣品確認，隨著蛋 白質濃度停止下降，螯合CPG載體的結合及飽和完成。還在通過過濾除去CPG載體之后用溶 液進行了活性試驗。然后，使用緩沖液(對于CalA和Ca 1B是MOPS(50mM，pH 7.4);對于ω -TA 是HEPES(如上））沖洗固定化的制劑，并且在真空下干燥16小時。
[0141 ] 通過將顆粒浸泡于洗脫緩沖液(50mM磷酸鈉，500mM咪唑，pH 7.5)中并且在軌道搖 床上溫育20min來進行從CPG載體提取固定化酶。通過SDS-PAGE可視化所提取的酶的存在及 純度;僅對應于His6-標記的酶的帶是可見的。
[0142] 如先前所描述的（Cassimjee等，ACS Catal.2011，第1卷，第1051-1055頁），進行溶 劑中的ω -TA的活性位點定量。通過將ω -ΤΑ-CPG添加到1-苯乙胺（lmM，lmL，MTBE aw=0.6， ImM十五燒）中，進行溶劑中的固定化ω -ΤΑ的活性位點定量。在軌道搖床上攪拌反應混合物 (150印111，2411，22°(：)。通過鹽水合物對(似2即〇4,2!1 20/7!120)設定溶劑的水活度，但是在添加 ω-ΤΑ-CPG后或在反應過程中不控制。通過GC(200yL樣品至Et0Ac，3滴乙酸酐和三乙胺，在 22 °C溫育8h)以十五烷作為內標測量轉化。
[0143] 通過將ω-ΤΑ-CPG添加到1-苯乙胺（lmM，lmL，50mM HEPES，pH 7.0)中測量緩沖液 中的固定化ω -TA的活性位點定量。在軌道搖床（150rpm，24h，22 °C)上攪拌反應混合物。使 用NaOH水溶液（1%)處理樣品（400yL)，使用DCM萃取并且在添加十五烷（lmM，EtOAc)后通過 GC分析。在所有情況下，將轉化與使用螯合CPG的空白反應(沒有結合的酶)進行比較。
[0144] 固定化的產率(即，從裂解液中除去的活性酶的量相對于洗滌后保留在CPG上的活 性酶的量)基于活性位點定量為高于99%。結果示于表3中。
[0145]
[0146] 如上文對CPG載體所描述的，進行聚組氨酸標記的酶(CalA和CalB)在螯合多孔聚 苯乙烯和聚甲基丙烯酸酯載體上的固定化。
[0147] 實施例4
[0148] ω-ΤΑ-CPG作為催化劑的用途
[0149] 將實施例3中制備的ω-ΤΑ-CPG在苯氧基-2-丙酮的對映體定向氨基轉移中用作催 化劑：
[0150]
[0151] 將20mg ω -TA-CPG加入到3mL具有100mM外消旋1-苯乙胺和50mM 2-苯氧基丙酮的 MTBE (aw = 0.6)溶液中，并且使用軌道搖動（150rpm)在50 °C下溫育反應混合物。將十五烷 (50mM)用作內標。在記錄的時間點采集樣品（50yL)后，通過手性氣相色譜來跟蹤1-苯乙胺 的轉化和對映體過量;如上所述，使用乙酸酐和三乙胺將樣品衍生化。在沒有衍生化的情況 下測量1-苯氧基丙-2-胺的形成。結果示于表4中。
[0152]
[0153] 實施例5
[0154] 固定化的CalA和CalB作為催化劑的用途
[0155] 將實施例3中制備的CalA-CPG、CalB_CPG、CalB-聚苯乙烯和CalB-聚甲基丙烯酸酯 在1-苯基乙醇對映選擇性酰化(動力學拆分）中用作催化劑：
[0157] 通過將固定化酶(20mg)加入到3mL具有10mM 1-苯基乙醇和100mM 丁酸乙稀酯的甲 苯溶液(aw=0.1)中進行脂肪酶催化的動力學拆分反應，并且使用軌道搖動(200rpm)在22 °C (對于CalA和CalB)或50°C (對于CalB Trpl04Ala)下溫育混合物。將十五烷(5mM)用作內 標。通過在記錄的時間點采集樣品（50yL)，通過手性GC測量1-苯基乙醇和丁酸1-苯乙酯的 轉化率和對映體過量。
[0158] 包括下列反應以進行比較：
[0159] -CalB固定在AccureP (多孔聚丙烯粉末)上。
[0160] -CalB以未修飾形式（即沒有根據實施例1處理）固定在氨基-HybCPG copo上。
[0161] 通過將多孔材料以與酶的量（由Bradford法測量蛋白質含量)50:1的比率加入到 濃縮的上清液中，隨后溫育至少八小時來進行Ca 1B (和Ca 1B Trp 104A1 a)在乙醇活化的 Ax'curel.? (Accurel MP1001，粒徑<1000ym，Membrana GmbH，Wuppertal，Germany)的固定 化。結果不于表5中。
[0164] 實施例6
[0165] 具有三種不同酶的級聯_CPG( "BV-級聯-CPG"）的制備
[0166] 通過在磷酸鈉緩沖液（5〇11^，50〇11^此(：1，？!17.5)中的細胞再懸浮以及添加 BugBusterTMlOX制備2,5-DKCM0、FRE和AlaDH的細胞裂解液。離心并且除去細胞碎片之后， 將螯合Co 2+CPG載體浸泡于等體積的三種細胞裂解液的混合物中，隨后在軌道搖床(150rpm) 上攪拌。在固定化過程中Bradford分析的溶液樣品確認，隨著蛋白質濃度停止下降，CPG載 體的結合及飽和完成。還使用通過過濾除去CPG之后的溶液進行了活性試驗。然后，使用磷 酸鈉緩沖液(參見上文)沖洗固定化制劑，然后在真空下干燥16小時。
[0167] 實施例7
[0168] 使用BV-級聯-CPG作為催化劑的酶促級聯反應
[0169]將實施例6中制備的級聯-CPG在( + )-樟腦的拜爾維利格(Baeyer-Villiger)氧化 中用作催化劑：
[0171] 將65mg BV-級聯-CPG加入到總液體體積為5.0mL的具有2.0mM( + )_樟腦、5.0mM L-丙氨酸、〇.3禮？麗和0.51111祖0!1的磷酸鹽緩沖液（10〇1111，？!17.5)的反應混合物中。然后溶 解氧（鼓泡30s)，隨后將容器密封；在軌道搖床（150rpm)上在22°C下溫育混合物。將樣品 (500yL)萃取到EtOAc，以苯甲酸乙酯作為內標并且通過GC分析。3小時后測量轉化率。24小 時后加入氧，并且使反應繼續進行額外的3小時，之后再次測量轉化率(27小時）。
[0172] 還用游離(未固定化的）2,5_DKCM0、FRE和AlaDH(來自細胞裂解液)進行比較反應。 未測量酶的比例和量。結果示于表6中。
[0173]
[0174] 通過將l.Og BV-級聯-CPG加入到總液體體積為5.0mL的具有160mM L-丙氨酸、 0.3禮？麗和0.511^祖0!1的磷酸鹽緩沖液（10011^，？!17.5)反應混合物中，進行多相反應。然 后，加入5mL具有( + )-樟腦（100mM)的環己烷作為第二液相。在軌道搖床（lOOrpm)在22°C下 攪拌密封的容器，伴隨向水相中持續添加氧。在記錄的時間點從有機相中采集樣品（50μυ 并在添加作為內標的苯甲酸乙酯（2.0mM在EtOAc中）之后通過GC分析。在使用Et0Ac(20mL) 萃取全部組分之后，測量72小時后的轉化率。
[0175] 還使用游離（未固定化的）2，5-DKCM0、FRE和AlaDH(來自細胞裂解液)進行了比較 反應。未測量酶的比例和量。結果示于表7中。
[0176]
[0177] 實施例8
[0178] 具有CalB和Pd-納米粒子的級聯_CPG( "Pd-CalB-CPG"）的制備
[0179] 將氨基_CPG(5g)浸泡于Pd(TFA)2(相對于CPG的氨基官能度為0.5equiv.)的水溶 液(200mL)中，并且將混合物持續攪拌lOmin。然后加入NaBH 4(7equiV.)，并且將混合物攪拌 額外的3〇111；[11。然后加入2,4-二羥基苯乙酮(0.56911；^.)，之后將混合物攪拌30111；[11。過濾固 體物質，并用水徹底清洗，然后浸泡于C0CI2的飽和水溶液（100mL)中。過濾并且用水洗滌之 后，將固體材料浸泡于聚組氨酸標記的CalB溶液(純化的或來自上清液）中并且攪拌30min。 然后過濾固定化制劑，用緩沖液(20mM MOPS，pH 7.4)沖洗，此后在真空下干燥16小時。
[0180] 實施例9
[0181] 使用Pd-CalB-CPG的級聯反應
[0182] 將實施例8中制備的材料在1-苯乙胺的對映選擇性酰化(動態動力學拆分）中用作 催化劑：
[0184] 將100mg Pd-CalB-CPG浸泡于1 .OmL含有20mM外消旋1-苯乙胺和100mM丁酸異丙酯 的甲苯溶液中。加入lmg NaBH4并且將反應小泡密封。使用在軌道搖床（100-800rpm)上的持 續攪拌將體系在65°C下溫育24至48小時。通過在記錄的時間點采集樣品由手性GC測量底物 和產物(例如(R) -N- (1 -苯基乙基)丁酰胺））的轉化和對映體過量。
[0185] 通過相分離獲得產物，使用IN HC1振搖有機相（三次）以除去殘留的酰基供體和 胺，然后使用EtOAc反萃取洗滌相。在真空下蒸發合并的有機相以獲得產物，通過快速層析 進一步純化。
[0186] 實施例10
[0187] A.金屬離子浸出的確定
[0188] 為了確定在給定條件下從載體浸出的金屬離子的量，使基于CPG和HybCPG并且含 有Co2+或Fe3+的載體經受在含水緩沖液中的延長的溫育。
[0189] 在室溫下在振動臺上，使結合有Co2+或Fe3+的LCAA CPG、HybCPG VBC和HybCPG copo各250mg在3mL含水緩沖液(HEPES 20mM，pH7.0)中溫育72小時。
[0190] 通過混合一份溫育的溶液與一份NH4SCN-溶液（1.0M)、一份HC1-溶液(6.0M)和兩 份丙酮，測量Co 2+的量。這一程序顯示出與Co2+的濃度呈比例的藍色，將其通過分光光度法 在620nm下定量。還測試了僅具有緩沖液的空白樣品。
[0191] 通過混合一份溫育的溶液與一份NH4SCN-溶液（1.0M)和一份HC1-溶液(6.0M)，測 量Fe 3+的量。這一程序顯示出與Fe3+的濃度呈比例的紅色，通過分光光度計在480nm下進行 定量。還測試了僅具有緩沖液的空白樣品。
[0192] 在從溫育的載體材料中除去一半溶液（1.5mL)之后，加入1.5mL的6.0M HC1-溶液， 并且在搖床上將材料溫育1小時;這一程序有效地脫附所有結合的金屬離子。然后，將一份 這種溫育的溶液與一份HC1-溶液(3M)和一份NH4SCN-溶液(1.0M)混合。向待定量Co 2+的樣品 中，還加入兩份丙酮。記錄在620nm下的吸光度（用于Co2+的量化)和480nm下的吸光度（用于 Fe3+的量化）。基于吸光度測量值，對在兩個不同溫育(首次在pH 7.0,然后在3.0M HC1中）下 的測試體積計算對應于金屬離子總量的值，并且對去除的體積(在首次溫育后的1.5mL)進 行校正。由此可以量化在pH 7.0下浸出的金屬離子的分數。結果示于下表8中。
[0193]
[0194] 可以看出，結合到CPG和HybCPG載體材料的Fe3+比Co2+更不容易浸出。
[0195] B.酶浸出的確定
[0196] 為了確定在給定條件下從載體離解的酶的量，使ω-ΤΑ在CPG或HybCPG上的固定化 制劑在含水緩沖液中經受延長的溫育。
[0197] 在軌道搖床上，將其中酶由Co2+或Fe3+結合的ω -TA-LCAA CPG、ω -ΤΑ-HybCPG VBC 和 ω-ΤΑ-HybCPG copo各 12~16mg在4mL含水緩沖液(HEPES 100mM，pH 7.0)中溫育lmin。在 此刻之后，未在溶液中檢測到酶。這是通過活性試驗來測量的，其中在沉降固定化材料之 后，使用lmL溶液。在軌道搖床上將剩余的3mL制劑溫育24小時，之后，所述制劑的一些展現 出在溶液中可測量量的酶。
[0198] 通過采集lmL溶液，加入lmL試驗混合物（1 -苯乙胺（1 OmM)、丙酮酸鈉(5mM)和PLP(1 μΜ)，溶解在相同的緩沖液中），并且在245nm下測量隨時間推移的吸光度變化5min來進行活 性試驗。還測試了具有純緩沖液的空白反應。在該波長下，所形成的苯乙酮(來自氨基轉移 反應的產物）可以監測為增加的吸光度，其中消光系數為12miT 1 cnT1 ( Schatzle等， Anal · Chem · 2009，第81卷，第8244-8248頁）。由于動力學常數是已知的（Cassimjee等， 0rg.Biomol.Chem.2012,第10卷，第5466-5470頁），因此可以計算浸出的酶的量。在浸出實 驗之前，通過活性位點定量來測量固定化制劑中結合酶的量。對于每種材料24小時后浸出 的量示于表9中。
[0199]
[0200]該數值表明，在測試條件下，Fe3+作為螯合金屬離子導致了更少的酶浸出。以Co2+ 或Fe3+作為螯合金屬離子，在選定條件下HybCPG copo作為載體沒有導致任何可檢測的酶浸 出。具有玻璃表面的LCAA CPG給出了最高量的酶浸出。這可能是酶非特異性結合到玻璃表 面的結果。
[0201] 實施例11
[0202] 具有HybCPG C〇p〇(C〇2+)的聚組氨酸標記的ω-ΤΑ的純化
[0203] 通過使用BugBuster?，從添加有50yg/mL卡那霉素的100mL Luria-Bertani培養基 中的ω-ΤΑ的制粒的IPTG誘導的24小時培養物制備細胞裂解液（5.0mL)。加入過量的輔酶 (PLP)并且在37 °C下將溶液溫育1小時。然后，通過使用PD 10柱（兩輪），將緩沖液改變為 HEPES緩沖液(50mM，500mM NaCl，pH 8.2(緩沖液1))，除去過量的PLP(未被酶結合），這得到 7. OmL含有祀全酶、天然蛋白質和其他雜質的溶液。
[0204] 在柱中裝入204mg含有26ymol/g Co2+的HybCPG copo(Co2+)。通過添加7.0mL緩沖 液1預濕潤該材料，并且丟棄流過液。
[0205] 以395_，￡ = 8.1111]?-1〇11-1分光光度測量活性全酶(〇388丨111]_66等4〇5〇3七31.2011， 第1卷，第1051-1055頁）。在吸光度測量后，將裂解液加入到柱中，并且收集流過液。在通過 柱之前和之后，在這一波長下測量的裂解液的吸光度差為0.62(所有的測量均使用1.0cm光 程長度進行）。這對應于29mg當前結合到柱中HybCPG copo (Co2+)載體的酶。
[0206] 然后，使用7.OmL緩沖液1洗滌柱。收集流過液，以緩沖液1作為空白，該流過液的吸 光度測量為0.11。這對應于5mg從柱上洗下的酶，假設是由于非特異性結合或未結合的酶， 在柱中留下24mg結合酶。
[0207] 通過施加5.0mL Tris緩沖液(50mM，500mM咪唑，pH 7.5(緩沖液2))，進行柱中結合 酶的解離。收集流過液并且再次添加過量的輔酶。如上所述，通過使用PD10柱，將緩沖液改 變為緩沖液1除去過量的PLP，得到總體積為7.0ml含有溶解全酶的溶液。所測量的吸光度為 0.465。這對應于22mg的純化酶，或92%的產率。溶液看起來顯著地清除了污染宿主細胞蛋 白質，這還得到了 SDS-PAGE的確認。
【主權項】
1. 一種固定化蛋白質材料，包含載體和固定在所述載體上的至少一種蛋白質，其中所 述載體包含附接有親和基質的載體材料，所述載體材料選自由以下組成的組： (a) 控制孔隙度玻璃(CPG); (b) 混合控制孔隙度玻璃(混合CPG);和 (c) 多孔有機聚合物； 并且其中，所述至少一種蛋白質含有親和標記物并且通過至所述親和基質的特異性親 和結合被固定在所述載體上。2. 根據權利要求1所述的固定化蛋白質材料，其中，所述載體材料是控制孔隙度玻璃 (CPG)或混合控制孔隙度玻璃(混合CPG)。3. 根據權利要求1或2所述的固定化蛋白質材料，其中，所述載體材料是控制孔隙度玻 璃(CPG)〇4. 根據權利要求1或2所述的固定化蛋白質材料，其中，所述載體材料是混合控制孔隙 度玻璃(混合CPG)。5. 根據權利要求1所述的固定化蛋白質材料，其中，所述載體材料是多孔有機聚合物。6. 根據權利要求5所述的固定化蛋白質材料，其中，所述多孔有機聚合物選自由官能化 聚苯乙烯和官能化聚甲基丙烯酸酯組成的組。7. 根據權利要求1至6中任一項所述的固定化蛋白質材料，其中，所述親和標記物是聚 組氨酸標記物并且其中所述親和基質含有螯合的金屬離子。8. 根據權利要求7所述的固定化蛋白質材料，其中，所述螯合的金屬離子是Co2+。9. 根據權利要求7所述的固定化蛋白質材料，其中，所述螯合的金屬離子是Fe3+。10. 根據權利要求1至9中任一項所述的固定化蛋白質材料，其中，所述至少一種蛋白質 是酶。11. 根據權利要求10所述的固定化蛋白質材料，包含兩種或更多種固定化酶。12. 根據權利要求10或11所述的固定化蛋白質材料，另外包含金屬納米顆粒。13. 根據權利要求12所述的固定化蛋白質材料，其中，所述金屬納米顆粒是過渡金屬納 米顆粒。14. 根據權利要求12或13所述的固定化蛋白質材料，其中，所述金屬納米顆粒選自由 鈷、鎳和鈀納米顆粒組成的組。15. -種用于蛋白質的固定化的載體，包含附接有親和基質的載體材料，所述載體材料 選自由以下組成的組： (a) 控制孔隙度玻璃(CPG); (b) 混合控制孔隙度玻璃(混合CPG);和 (c) 多孔有機聚合物； 并且其中，所述蛋白質通過至所述親和基質的特異性親和結合被固定在所述載體上。16. 根據權利要求15所述的載體，其中，所述載體材料是控制孔隙度玻璃(CPG)。17. 根據權利要求15所述的載體，其中，所述載體材料是混合控制孔隙度玻璃（混合 CPG)〇18. 根據權利要求15所述的載體，其中，所述載體材料是多孔有機聚合物。19. 根據權利要求18所述的載體，其中，所述多孔有機聚合物選自由官能化聚苯乙烯和 官能化聚甲基丙烯酸酯組成的組。20. 根據權利要求15至19中任一項所述的載體，其中，所述親和基質含有螯合的金屬離 子。21. 根據權利要求20所述的載體，其中，所述螯合的金屬離子是Co2+。22. 根據權利要求20所述的載體，其中，所述螯合的金屬離子是Fe3+。23. -種用于制備固定化蛋白質材料的方法，所述方法包括： i) 提供含有氨基的載體材料，所述載體材料選自由以下組成的組： (a) 控制孔隙度玻璃(CPG); (b) 混合控制孔隙度玻璃(混合CPG);和 (c) 多孔有機聚合物； ii) 使所述載體材料與2,4_二羥基苯乙酮反應，從而將二羥基苯基基團連接至所述載 體材料； iii) 在所述二羥基苯基基團與能夠結合聚組氨酸標記的蛋白質的金屬離子之間形成 螯合絡合物;和 iv) 將聚組氨酸標記的酶結合到包含所述金屬離子的載體材料。24. -種通過根據權利要求23所述的方法可獲得的固定化蛋白質材料。25. 根據權利要求23所述的方法，另外包括將過渡金屬納米顆粒結合到所述載體材料。26. -種通過根據權利要求25所述的方法可獲得的固定化蛋白質材料。27. 根據權利要求10至14、24和26中任一項所述的固定化蛋白質材料作為多相催化劑 的用途。28. 根據權利要求11至14、24和26中任一項所述的固定化蛋白質材料在多步或級聯反 應中作為多相催化劑的用途。29. -種用于催化酶催化的反應的方法，包括提供根據權利要求10至14、24和26中任一 項所述的固定化蛋白質材料，和使所述固定化蛋白質材料與至少一種底物接觸，固定在所 述載體材料上的酶能夠對所述至少一種底物起作用。30. -種用于催化酶催化的多步或級聯反應的方法，包括提供根據權利要求11至14、24 和26中任一項所述的固定化蛋白質材料，和使所述固定化蛋白質材料與至少一種底物接 觸，固定在所述載體材料上的酶能夠對所述至少一種底物起作用。31. -種用于催化組合的酶催化和過渡金屬催化的反應的方法，包括提供根據權利要 求12至14和26中任一項所述的固定化蛋白質材料，以及使所述固定化蛋白質材料與至少一 種底物接觸，固定在所述載體材料上的酶和過渡金屬能夠對所述至少一種底物起作用。32. -種用于純化和分離親和標記的蛋白質的方法，包括以下步驟： i)將親和標記的蛋白質固定在載體上，所述載體包含附接有親和基質的載體材料，所 述載體材料選自由以下組成的組： (a) 控制孔隙度玻璃(CPG); (b) 混合控制孔隙度玻璃(混合CPG);和 (c) 多孔有機聚合物； i i)可選地使用水或適合的緩沖液洗滌固定化蛋白質材料;和 iii)從所述親和基質解離純化的蛋白質。33.根據權利要求32所述的方法，另外包括步驟iv)從所述純化的蛋白質除去親和標記 物。
【文檔編號】C12N11/14GK105940104SQ201580005764
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2015年1月30日
【發明人】卡里姆·恩格爾馬克·卡西姆吉, 揚-埃爾林·貝克瓦爾
【申請人】恩制因塞米公司