一種利用粗糙脈孢菌的微生物轉化方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用粗糙脈孢菌的微生物轉化方法。具體地該方法，包括步驟將粗糙脈孢菌接種于培養基中進行液態發酵；粗糙脈孢菌發酵2?3天后，在發酵液中加入綠原酸和咖啡酸，繼續發酵進行生物轉化；生物轉化完成后，對轉化產物進行分離純化。本發明還公開了一種綠原酸衍生物及其用途。本發明的利用粗糙脈孢菌的微生物轉化方法具有底物轉化率高，工藝環保，操作簡便等優點，非常適合進行工業化生產。
【專利說明】
一種利用粗糙脈孢菌的微生物轉化方法
技術領域
[0001] 本發明涉及生物技術領域，具體地涉及一種利用粗糙脈孢菌的微生物轉化方法。
【背景技術】
[0002] 粗糙脈孢菌（Neurospora crassa)屬于脈孢菌屬（Neurospora)的一種常見真菌， 其具有疏松網狀的菌絲，有分枝和分隔，無性繁殖形成分生孢子。研究表明其營養條件簡 單、生長迅速、發酵周期短、實際生產過程易于控制，并且可產高活力纖維素酶，從而為農副 廢棄物的開發利用提供了一條有效地途徑。目前粗糙脈孢菌在發酵工業中的應用研究主要 包括產纖維素酶、產乙醇、產黑色素、合成漆酶等，應用研究范圍較為局限，因此需要繼續開 發粗糙脈孢菌的新的應用。
[0003] 金銀花（Lonicera Japonica)又名忍冬，為忍冬科多年生半常綠纏繞木質藤本植 物。"金銀花"一名出自《本草綱目》，由于忍冬花初開為白色，后轉為黃色，因此得名金銀花。 藥材金銀花為忍冬科忍冬屬植物忍冬及同屬植物干燥花蕾或帶初開的花。金銀花自古被譽 為清熱解毒的良藥。它性甘寒氣芳香，甘寒清熱而不傷胃，芳香透達又可祛邪。金銀花既能 宣散風熱，還善清解血毒，用于各種熱性病，如身熱、發疹、發斑、熱毒瘡癰、咽喉腫痛等證， 均效果顯著。金銀花提起物中的主要活性成分是綠原酸（Chlorogenicacid)，其是由咖啡酸 (Caffeic acid)與奎尼酸（Quinic acid)組成的縮酉分酸，異名咖啡單寧酸（咖啡縣酸），化 學名5-氧-咖啡酰奎尼酸（5-0-caffeoylquinic acid)。綠原酸具有廣泛的生物活性，具 有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基和興奮中樞神 經系統等作用。現代科學對綠原酸生物活性的研究已深入到食品、保健、醫藥和日用化工等 多個領域。
[0004] 國內外對于綠原酸已經有了很深入的研究，本領域技術人員一直致力于對綠原酸 衍生物的開發與研究，以獲得生物活性更高的化合物。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一種粗糙脈孢菌的微生物轉化方法。
[0006] 本發明的第一方面提供了一種利用粗糙脈孢菌的微生物轉化方法，包括步驟：
[0007] (1)菌體發酵
[0008] 將粗糙脈孢菌（Neurospora crassa)接種于培養基中進行液態發酵；
[0009] ⑵生物轉化
[0010] 粗糙脈孢菌發酵2-3天后，在發酵液中加入綠原酸和咖啡酸，繼續發酵進行生物 轉化；
[0011] ⑶分離純化
[0012] 生物轉化完成后，對轉化產物進行分離純化。
[0013] 優選地，步驟（1)中的粗糙脈孢菌菌株為粗糙脈孢菌CGMCC 3. 3478菌株（購自北 京北納凱創生物技術有限公司）。
[0014] 優選地，步驟⑴中的培養條件為：蔗糖3 % (w/v)，棉籽粉1.5% (w/v)， ΚΗ2Ρ040· 1 % (w/v)，MgS04 · 7H20 0· 2% (w/v)，pH = 6. 8, 28°C 培養 2-3 天。
[0015] 優選地，步驟（2)中綠原酸的添加量為0· 2-1. 2g/L。
[0016] 優選地，步驟（2)中咖啡酸的添加量為l_3g/L。
[0017] 優選地，步驟（2)中綠原酸和咖啡酸的添加量的重量比為1 : 3-5。
[0018] 優選地，步驟（2)中，生物轉化過程中維持pH為5. 5-6. 5,更優選地pH為6. 0。
[0019] 優選地，步驟（2)中，轉化溫度為25-35°C，更優選地為27-28°C。
[0020] 優選地，步驟（3)中，采用大孔吸附樹脂進行分離純化。
[0021] 優選地，所述綠原酸的分子式如式I所示：
[0022]
[0023] 優選地，所述咖啡酸的分子式如式II所示：
[0024]
[0025] 本發明的另一方面，提供了一種綠原酸衍生物，其結構如式III所示：
[0026]
[0027] 本發明的另一方面提供了本發明第二方面所述的綠原酸衍生物的用途，其用于， 制備抗病毒、抗腫瘤、抗細菌感染的藥物。
[0028] 本發明人在研究粗糙脈孢菌的微生物轉化過程中，通過大量篩選，意外的發現在 粗糙脈孢菌發酵培養基中添加金銀花提取物，發酵液中出現了一種新的物質，經LC-MS、 1!! NMR鑒定其為3, 5-二咖啡酸酰奎尼酸甲酯，其結構如式III所示。由于其結構與綠原酸 結構相近，發明人進一步研究發現在粗糙脈孢菌發酵培養基中添加綠原酸和咖啡酸作為底 物，能夠大大提高式III所示化合物的生成量，在此基礎上完成了本發明。本發明的利用粗 糙脈孢菌的微生物轉化方法具有底物轉化率高，工藝環保，操作簡便等優點，非常適合進行 工業化生產。
[0029] 應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0030] 圖1顯示了轉化完成后的菌體狀態。
[0031] 圖2顯示了本發明實施例中各實驗組的摩爾轉化率。
[0032] 圖3顯示了標準品共進樣的HPLC檢測圖譜。
【具體實施方式】
[0033] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件或按照制造廠商所建議的條件。
[0034] 除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明方法中。文 中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0035] 實施例1粗糙脈孢菌的發酵
[0036] 菌株：粗糙脈孢菌CGMCC 3. 3478菌株購自北京北納凱創生物技術有限公司。
[0037] 斜面培養基：馬鈴薯固體培養基（PDA)，馬鈴薯20% (w/v)、葡萄糖2 % (w/v)、瓊 脂 2% (w/v)、pH 6. 8-7.0, 25°C培養 4-5 天。
[0038] 種子培養基：鹿糖2. 5 % (w/v)，酵母粉0· 3 % (w/v)，蛋白胨1. 0 % (w/v)， Κ2ΗΡ040· 1 % (w/v)，MgS04 · 7H20 0· 05% (w/v)，pH = 6. 8, 25°C 培養 1-2 天。
[0039] 發酵培養基：蔗糖 3% (w/v)，棉籽粉 L 5% (w/v)，ΚΗ2Ρ040· 1 % (w/v)，MgS04 ·7Η20 0.2% (界八），口!1 = 6.8,281：培養2天。
[0040] 實施例2生物轉化
[0041] 本實施例中綠原酸、咖啡酸、3,5_二咖啡酸酰奎尼酸甲酯標準品購自南京標科生 物科技有限公司。
[0042] 將實施例1中粗糙脈孢菌發酵培養兩天后，在發酵培養基中按照下表分別配制生 物轉化體系，設置轉化條件，轉化時間均為8小時。
[0043] 表 1
[0044]
[0045] 轉化完成后，取樣，與甲醇1 : 1體積混合，浸泡lh后，離心，上清用HPLC定量檢 測，并計算綠原酸底物的摩爾轉化率；
[0046] HPLC檢測法的條件如下：
[0047] 流動相：0. 1%甲酸水溶液：乙腈=82 : 18 ;
[0048] 柱型號：C18,150X4. 60mm，3ym;
[0049] 柱溫：40°C ;
[0050] 流速：0· 7ml/min ;
[0051] 檢測波長：246nm。
[0052] 摩爾轉化率％ =綠原酸衍生物摩爾數/底物綠原酸摩爾數X 100%。
[0053] 圖1顯示了轉化完成后的菌體形態，從圖中可以看出，菌體生長基本停止，菌絲出 現橫隔，但是菌絲體仍然保持完整，沒有明顯的碎裂。
[0054] 實驗組A、B、C、D、E、F、G的摩爾轉化率如圖2所示，分別為32%、61%、83%、78%、 72%、80%、84%，實驗結果表明，最優化的轉化條件為：綠原酸0.88/1、咖啡酸3.2 8/1、轉 化體系pH 6. 0,轉化溫度為28°C。
[0055] 轉化完成后，在轉化液中加入等體積的95%乙醇，浸泡2小時過濾，濾液采用常規 方法，使用大孔吸附樹脂進行純化，所得產品與標準品按重量1 : 1混合，HPLC共進樣檢測， 檢測的HPLC圖譜如圖3所示，標準品和本發明所得產品的HPLC峰形完全重合（峰A)，證明 本發明所得產品與標準品一致。LC-MS、 1!! NMR鑒定所得產品為3, 5-二咖啡酸酰奎尼酸甲 酯。
[0056] 在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可 以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范 圍。
【主權項】
1. 一種利用粗糙脈孢菌（Neurospora crassa)的微生物轉化方法，其特征在于，包括 步驟： (1) 菌體發酵 將粗糙脈孢菌接種于培養基中進行液態發酵； (2) 生物轉化 粗糙脈孢菌發酵2-3天后，在發酵液中加入綠原酸和咖啡酸，繼續發酵進行生物轉化； (3) 分離純化 生物轉化完成后，對轉化產物進行分離純化。2. 如權利要求1所述的方法，其中，步驟（1)中的粗糙脈孢菌菌株為粗糙脈孢菌CGMCC 3. 3478 菌株。3. 如權利要求1所述的方法，其中，步驟（1)中的培養條件為：蔗糖3% (w/v)，棉籽粉 I. 5% (w/v)，KH2PO4O. 1% (w/v)，MgSO4 · 7H20 0· 2% (w/v)，pH = 6. 8,28°C培養 2-3 天。4. 如權利要求1所述的方法，其中，步驟（2)中綠原酸的添加量為0. 2-1. 2g/L。5. 如權利要求1所述的方法，其中，步驟（2)中咖啡酸的添加量為l-3g/L。6. 如權利要求1所述的方法，其中，步驟（2)中綠原酸和咖啡酸的添加量的重量比為 1:3-5。7. 如權利要求1所述的方法，其中，步驟（2)中，生物轉化過程中維持pH為5. 5-6. 5， 更優選地pH為6.0。8. -種綠原酸衍生物，其特征在于，所述綠原酸衍生物結構如式III所示：9. 權利要求8所述的綠原酸衍生物的用途，其特征在于，用于制備抗病毒、抗腫瘤、抗 細菌感染的藥物。10. 如權利要求9所述的用途，其中，所述病毒包括HIV病毒、乙肝病毒。
【文檔編號】C12R1/645GK105886561SQ201410482482
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年9月10日
【發明人】楊鐘華
【申請人】瑞安市普羅生物科技有限公司