專利名稱：：用于治療和/或預防豬繁殖與呼吸綜合征的siRNA片段及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種siRNA片段及其應用，特別涉及一種用于治療和/或預防豬繁殖與呼吸綜合征的siRNA片段及其應用。
背景技術：
：RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是由雙鏈RNA介導的序列特異性的基因沉默。1998年2月由華盛頓卡耐基研究院的Fire與馬薩諸塞大學癌癥中心的Mello首次在對秀麗新小桿線蟲(Caenorhabditiselegan)的研究中提出這一概念，其與在植物中發現的共表達和在粗糙脈孢霉菌中發現的消除(quelling)現象都屬于轉錄后基因沉默機制。這一機制已被證實在真菌、擬南芥、錐蟲、水螅、渦蟲、斑馬魚等幾乎所有真核生物細胞中都存在，甚至在大腸桿菌中也存在類似機制。在發現哺乳動物細胞中也存在這一機制后，RNAi作為一種快速、有效、特異性抑制基因表達的工具被廣泛應用于基因功能的研究以及腫瘤和病毒性疾病的治療研究中。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)是尼多病毒目動脈炎病毒科成員，其基因組全長約15kb，不分節，含9個開放性閱讀框架(0RF)，即0RFla、0RFlb、0RF2a、0RF2b、0RF3、0RF4、0RF5、0RF6和0RF7。對PRRSV的基因組序列分析表明，PRRSV至少含有7個結構蛋白，即糖蛋白GP2、GP3、GP4、GP5、膜基質蛋白(M蛋白)、核衣殼蛋白(N蛋白)以及新發現的由0RF2b編碼的73個氨基酸的非糖基化蛋白。其中，M蛋白由0RF6編碼，分子量為19kd，為非糖基化的膜蛋白。親水性氨基酸序列分析表明，M蛋白有3個疏水性跨膜區。M蛋白聚集于粗面型內質網，并與GP5形成異源二聚體，北美洲和歐洲分離株分別含有174和173個氨基酸。雖然M蛋白可能定位于病毒囊膜并含有相對大的擴展區域，但該蛋白為PRRSV最保守的結構蛋白，其對于PRRSV的復制是必需的。M蛋白具有很強的免疫原性，感染10天即可檢測到抗體應答，故體外表達的重組M蛋白可以作為血清學試驗的靶抗原。PRRSV主要引起母豬早產、流產等繁殖障礙，仔豬、育肥豬呼吸困難以及育成豬類的流感疾病，這些疾病統稱為豬繁殖與呼吸綜合征。目前豬繁殖與呼吸綜合征在許多養豬國家爆發流行，成為威脅養豬業安全的重要病原之一。雖然預防PRRSV的疫苗有滅活苗和弱毒苗，然而這些疫苗的使用只能夠提供部分保護，僅使機體不再出現臨床癥狀，但不能阻止再次感染。而且，弱毒苗毒株在自然狀態下還有可能發生毒力返強現象，并經過胎盤傳播給胎兒，造成感染豬群的持續感染，使得一些常規的疫苗很難取得理想的效果。因此，迫切需要開發一種新型的能對所有PRRSV病毒株提供更有效保護的抗病毒措施。
發明內容因此，本發明的目的在于克服現有治療和/或預防豬繁殖與呼吸綜合征方法的上述缺點和不足，提供一種基于RNAi技術的抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒的基因表達，從而治療和/或預防豬繁殖與呼吸綜合征的特異性siRNA片段。本發明的上述目的是采用以下技術方案來實現的—種用于治療和/或預防豬繁殖與呼吸綜合征的siRNA片段，其序列為下列序列M-229:5'-GCAGUAGUUGCACUCCUUU-3'3'-CGUCAUCAACGUGAGGAAA-5'。本發明采用化學合成的方法合成上述siRNA片段。在優選實施方案中，在所述siRNA片段的3'端進一步加上2-6個dT或2-6個U的修飾序列，以減少siRNA在細胞內降解，增強其穩定性。按照以下方法將合成的siRNA片段分別轉染至Marcl45細胞系(上皮樣細胞，來源于猴腎細胞)1、Marcl45細胞的培養用含10%胎牛血清的DMEM培養基(GIBC0)，于37°C、5%C02條件下培養；2、轉染采用脂質體Hiperfect(Qiagen公司生產)進行細胞轉染，用lygsiRNA轉染Marc145細胞(6孔板)。完成轉染后24h，接種PRRSV(MOI=0.01)進行攻毒。攻毒24h后，提取細胞總RNA進行反轉錄，以GAPDH基因作為內參，通過實時定量PCR(Real-timePCR)檢測PRRSV-M蛋白的mRNA水平，并通過免疫印跡(WesternBlot)檢測PRRSV-M蛋白的表達水平。本發明還提供一種用于治療和/或預防豬繁殖與呼吸綜合征的載體，其中包含序列為上述序列的siRNA片段。所述載體優選為逆轉錄病毒載體(包括慢病毒載體)、腺病毒載體、腺相關病毒載體(AAV載體)以及質粒載體等，例如pSuper、pBabe-Super、pRNA-U6.1/Neo或pSilencer載體等。本發明所設計的siRNA片段及其載體，可應用于制備治療和/或預防豬繁殖與呼吸綜合征的藥物。該藥物為抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒的藥物。具體來說，該藥物為抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒M蛋白表達的藥物。本發明根據siRNA設計策略，從GenBank中查找PRRSVSI株基因組序列(GenBank登陸號AF090173)，設計出多對siRNA片段，并通過轉染Marc145細胞系試驗對這些siRNA片段進行活性篩選。篩選結果表明，本發明篩選出的siRNA片段能夠降低Marc145細胞中PRRSV-M蛋白的表達，即M-229降低了PRRSV-M蛋白的mRNA水平約50%。將所述siRNA片段插入到載體并轉染Vero細胞系的試驗表明，包含該siRNA片段的載體能使PRRSV-M蛋白的mRNA水平降低30%。由于PRRSV-M蛋白對于PRRSV的復制是必需的，抑制PRRSV-M蛋白的表達就抑制了PRRSV在細胞內的生長與繁殖。因此本發明所設計的siRNA片段M-229使PRRSV-M蛋白表達量下降，可以應用于制備治療和/或預防豬繁殖與呼吸綜合征的藥物。綜上所述，本發明基于RNAi技術，提供了一種抑制PRRSV-M蛋白表達的特異性RNAi片段，通過抑制PRRSV復制必需的M蛋白表達，從而實現了抑制PRRSV的生長與繁殖，可應用于制備治療和/或預防豬繁殖與呼吸綜合征的藥物。圖1為本發明的siRNA對PRRSV-M蛋白的mRNA水平影響結果示意圖。圖2為本發明的siRNA對PRRSV-M蛋白的表達水平影響結果示意圖。圖3為本發明的重組質粒對PRRSV-M蛋白的mRNA水平影響結果示意圖。圖4為本發明的重組質粒對PRRSV-M蛋白的表達水平影響結果示意圖。具體實施例方式以下通過具體實施例對本發明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發明，而不用于限定本發明的范圍。以下實施例中所使用的技術，包括基因測序、合成、細胞轉染等分子生物學技術，以及細胞培養、檢測技術等，除非特別說明，均為本領域的技術人員已知的常規技術；所使用的儀器設備、試劑、細胞系等，除非是本說明書特別說明，均為本領域的研究和技術人員可以通過公共途徑獲得的。實施例1:RNAi序列的設計siRNA設計策略1)從耙基因的起始密碼子AUG下游50100個核苷酸開始搜尋理想的siRNA序列，越靠近耙基因的3'端，其基因沉默效果可能越好；2)siRNA序列最好為AA(Nn)UU(N代表任意堿基；n為堿基數目，在1929nt之間)，NA(Nn)UU和NA(Nn)NN序列也可以。3)具有均衡的堿基含量(即G/C含量在30%70%)。依據PRRSVSI株基因組序列(GenBank登陸號AF090173)設計出2對siRNA片段，其序列分別為M-229(SEQIDNO.1):5'-GCAGUAGUUGCACUCCUUU-3'3'-CGUCAUCAACGUGAGGAAA-5';M-379(SEQIDNO.2):5'-GCAAAUGAUAACCACGCAU-3'3'-CGUUUACUAUUGGUGCGUA-5'M-167(SEQIDNO.3):5'-CCUUCGGGUACAUGACUUU-3'3'-GGAAGCCCAUGUACUGAAA-5'。上述RNAi片段長度均為21nt，負鏈及其任意一個位置的突變體與已知人類基因和基因表達片段無同源性。在所述siRNA片段的3'端進一步加上2_6個dT或2_6個U的修飾序列，以減少siRNA在細胞內降解，增強其穩定性。另外，使用的陰性及陽性對照序列分別為陰性對照(SEQIDNO.4):5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'3'-TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA-5'GAPDH陽性對照(SEQIDNO.5):5'-GUAUGACAACAGCCUCAAGTT-3'3'-TTCAUACUGUUGUCGGAGUUC-5'所述序列均委托上海吉瑪生物技術有限公司生物公司合成。實施例2:siRNA轉染Marcl45細胞系并進行PRRSV感染實驗材料Marcl45細胞、美洲型PRRSVSl株(MOI=0.01)、美洲型PRRSV多克隆抗體。1、轉染Marcl45細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基(GIBCO)，于37°C、5%0)2條件下培養。采用脂質體Hiperfect(Qiagen)進行細胞轉染，操作方法可完全根據廠家說明。轉染時，用lPgsiRNA轉染Marcl45細胞(6孔板)。2、PRRSV感染轉染24h后，每個培養板中加入PRRSV細胞毒(MOI=0.1)，繼續培養24h。實施例3:siRNA干擾效果的檢測I.實時定量PCR(Real-timeRCR)分析1.提取總RNA使用Trizol試劑(Invitrogen)提取細胞總RNA，步驟參考Invitrogen公司說明書。2.實時定量PCR分析1)引物與探針設計以狒狒(P即ioa皿bis)GAPDH基因和長尾猴(C.aethiops)beta-actin基因作為實時定量PCR反應的陽性對照，分別設計引物和探針序列如表l所示。表lGAPDH基因、beta-actin基因和PRRSV-M基因引物和探針序列<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2)試劑與儀器試劑鐵克曼(TaqMan)實時定量PCR通用試劑(上海吉瑪生物技術有限公司)；儀器FTC-2000A實時定量PCR儀(楓嶺，中國)。3)逆轉錄cDNAPCR管中混合以下試劑Oligo-dT4ulRNA20ii17(TC下保溫10min，迅速在冰上冷卻2min以上，瞬時離心，加入以下試劑5XM-MLVBuffer1dNTP(0.25mM)4ii1RNasin2ulM-MLV2ii142。C下保溫2小時后，再在7(TC下保溫15分鐘，而后冰上冷卻，得到cDNA。4)建立PCR反應體系，如表2所示表2PCR反應體系<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>5)實時定量PCR反應條件95。C，5min變性；40個循環95。C，15秒；55。C，30秒；72°C，30秒。6)實驗結果圖1為本發明的實時定量PCR檢測PRRSV-M蛋白的mRNA水平的結果示意圖，其中野生型為未導入siRNA處理的細胞樣品，其它處理與樣品均一致，其具體實驗數據及數據處理分別如表3和表4所示表3siRNA(M-229)干擾組的實驗結果M-229GAPDHbeta-actinPRRSV-M重復1cT12.1611.0219.85重復2CT12.2011.0719.89重復3CT12.2411.0920.07MeanCT12.20±0.0411.06±0.0419.94±0.12ACT一-1.14±0.057.74士0.12AACT一0.48±0.130.98±0.142t一0.72(0.66~0.78)0.51(0.46~0.56)表4野生型組的實驗結果野生型(WT)GAPDHbeta-actinPRRSV-M重復1cT12.3310.6419.10重復2C丁12.3910.7619.11重復3Gr12.3910.8619.18MeanCt12.37±0.0310.75±0.1119.13±0.04一-1.62±0.126.76±0.06△ACT一0.00±0.170.00±0.082t一1.00(0.89~1.12)1.00(0.95~1.06)在上述表3及表4中，CT值代表每個反應管內熒光信號達到設定的閾值時所進行的循環數，MeanCT是三個重復樣的CT值平均值，該項"±"后的數值為三個重復樣的標準偏差，其計算公式為標準差ACT指同一樣品中，待檢基因與內參基因GAPDH的平均CT值的差值，即ACT=CT待測基因_CT內參基因。△△CT指其余樣品的ACT值和對照組相應基因的ACT值之差，即AACT=(CT待測基因—CT內參基因)實驗組-2—"是按照AACT計算的，括號內—(Ct待測基因_CT內參基因)對照組'為其置信區間，也是根據AACT的范圍計算的。可見，以2—"值表示實驗組待測基因的表達相對于對照組的變化倍數，兩者差異為1.00-0.51=0.49=49%。M-229干擾組與對照組的相對表達量差約為50%，即M_229干擾組相對野生型組表達量的差異百分比達到約50%。8經過三次重復實驗進行T檢驗，標準差小于0.05，為顯著性差異。II.免疫印跡檢驗1、總蛋白抽提步驟1)PBS清洗細胞3次；2)加入裂解緩沖液100ill，冰上放置20min;裂解液配方:50,1/LTris-Cl(pH8.0):0.07882g;150mmol/L氯化鈉0.08775g;0.2g/L疊氮鈉0.002g;lg/LSDS:0.Olg;100mg/LAprotin;0.OOlg;lOg/LNP-40:0.lg;5g/L去氧膽酸鈉0.05g;100mg/L苯甲基磺酰氟(PMSF)O.OOlg;3)收集裂解液；4)離心，12000rpm，210min;5)吸取上清，蛋白定量，分裝，于-8(TC保存備用；2.蛋白質的聚丙烯酰胺凝膠電泳按所需分離的蛋白質分子大小選擇30%的丙烯酰胺百分比濃度。在微量離心管中，用2XSDS加樣緩沖液按1:1(v/v)稀釋待測蛋白質樣品，于10(TC煮沸5-10min。用帶平嘴針頭的50iU注射器將同樣濃度的蛋白質樣品等體積加入到樣品孔中。連接電源，將電壓調至120V繼續電泳2h，至溴酚藍到達凝膠底部為止。3.蛋白質從SDS聚丙烯酰胺凝膠轉移至硝酸纖維素濾膜準備轉移緩沖液。切割與膠尺寸相符的硝酸纖維素薄膜，并用轉移緩沖液浸濕，放置15min直到沒有氣泡。切割8張普通濾紙，其大小與膠尺寸大小相符，并將其浸泡在有轉移緩沖液的培養皿中(與硝酸纖維素薄膜分開浸泡)。電泳后，切取有用部分的膠，并很快地在轉移緩沖液中洗滌。打開蛋白質轉移槽的蓋板，依次放入①4張用轉移緩沖液浸泡過的濾紙；②用轉移緩沖液洗過的膠，并小心地趕走濾紙和膠之間的所有氣泡；③放上硝酸纖維素膜；另4張用轉移緩沖液浸泡過的濾紙；⑤小心地合上轉移槽的蓋板；⑥插入電極，注意正負極方向(硝酸纖維素膜面向陽極)，打開電泳儀開關，300mA，2h。轉移結束后打開蓋板取出硝酸纖維素薄膜，用鉛筆標出作為分子量標準的參照蛋白的位置。4.免疫印跡膜的處理用TBST緩沖液洗膜510min。將膜用8%的脫脂牛奶作為封閉溶液封閉，用搖床輕搖(37°C)60min。用TBST緩沖液洗膜3次，每次10min。加入一抗9將膜置于第一抗體溶液(PRRSV陽性血清，l:200)中，置搖床上輕搖，37t:搖動lh。去掉第一抗體溶液，并用PBS洗膜3次，每次10min。加入二抗將膜置于二抗辣根過氧化酶兔抗豬IgG溶液(1:200)中，37t:輕搖40min。去掉第二抗體溶液，并用TBST洗膜3次，每次10min。最后用TBST溶液洗。5.ECL化學發光底物檢測ECL溶液中反應5min，用去離子水洗滌，以終止反應。用放射自顯影法在X-光片上留下清晰的圖像。結果如圖2所示，圖2為本發明的免疫印跡檢測PRRSV-M蛋白表達水平的結果示意圖，其中對照為未導入siRNA處理的細胞樣品，其它處理與樣品均一致。由圖可知，M-229、M-379與M-167樣品的M蛋白表達量均少于對照組M蛋白的表達量，表明這三組siRNA均對PRRSV-M蛋白表達造成了抑制效果。實施例4:將siRNA導入載體I.M-229siRNA設計選用干擾效果明顯的M-229，在原siRNA序列(轉換為DNA序列)的基礎上進行設計，在其第一鏈5'端加入BglII酶切位點，第二鏈5'端加入HindIII酶切位點，得到兩段互補的寡核苷酸片段，其序列為兩段寡核苷酸經過退火，會形成互補的雙鏈，然后經過酶切，再連接到pBabe-Super載體中。上述寡核苷酸片段均委托Invitrogen公司合成。II.siRNA載體的構建將pBabe-Puro載體上的H1-RNA啟動子克隆入無啟動子的穿梭載體pSuper載體(Oligoengine公司)中，得到新的穿梭載體命名為pBabe-Super。上述合成的寡核苷酸序列退火并連接到pBabe-Super的BglII和HindIII位點，得到重組質粒pBabe-M-229，經EcoRI酶切鑒定、測序鑒定正確。^MMl:重組質粒干擾效果的檢測I.用重組質粒轉染Marc145細胞，并感染PRRSV，具體方法參見實施例2。II.實時定量PCR分析，具體方法參見實施例3。結果如圖3所示。圖3為實時定量PCR分析本發明的重組質粒對PRRSV-M蛋白的mRNA水平影響結果示意圖，其中陰性對照為未導入siRNA處理的細胞樣品，其它處理與樣品均一致。結果表明，重組質粒pBabe-M-229的mRNA水平為對照樣本的70%。III.免疫印跡檢驗，具體方法參見實施例3。結果如圖4所示。圖4為免疫印跡檢測本發明的重組質粒對PRRSV-M蛋白表達水平的影響結果示意圖，其中陰性對照為未導入siRNA處理的細胞樣品，其它處理與樣品均一致。由圖可知，重組質粒pBabe-M-229的M蛋白表達量少于對照組M蛋白的表達量，表明該pBabe-M-229對PRRSV的M基因轉錄蛋白表達具有抑制效果。序列表〈110>中國科學院動物研究所〈120〉用于治療和/或預防豬繁殖與呼吸綜合征的siRNA片段及其應用〈130>DIC08110096〈160>14<170>PatentInversion3.3〈210〉1〈211>19〈212>RNA〈213〉人工序列〈400>1gcaguaguugcacucc皿u19〈210>2〈211>19〈212>謹〈213〉人工序列〈400>2gc朋3Ugaim3ccacgc3U19〈210>3〈211>19〈212>腿〈213〉人工序列〈400>3cc皿cgggimC3ugacu皿19〈210>4〈211>19<212>腿〈213〉人工序列〈400>4皿cuccg朋cgugucacgu19〈210>5<211>19〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400>5gimugacaacagccuc朋g19〈210>6〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>6cctcaagatcgtcagcaatgc21<210〉7〈211〉23〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>7cacgataccaaagttgtcatgga23〈210〉8<211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉8cctgcaccaccaactgcttagcacc25<210>9〈211>19<212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉9ctcactgagcgcggctaca19〈210>10〈211〉22〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>10cttaatgtcacgcacgatttcc22〈210〉11〈211〉20<212>DNA〈213〉人工序列<400>11cttcaccaccacggccgagc20〈210〉12〈211>17〈212>DNA〈213〉人工序列〈■〉12〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉13gtggttatcatttgccgcaat〈210>14〈211>20〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>14agtgccgcaggctttcatcc1權利要求一種用于治療和/或預防豬繁殖與呼吸綜合征的siRNA片段，其序列為下列序列5’-GCAGUAGUUGCACUCCUUU-3’3’-CGUCAUCAACGUGAGGAAA-5’。2.根據權利要求1所述的siRNA片段，其特征在于，所述siRNA片段的3'端還含有2_6個dT或2-6個U的修飾序列。3.—種用于治療和/或預防豬繁殖與呼吸綜合征的載體，其中包含序列為下列序列的siRNA片段5'-GCAGUAGUUGCACUCCUUU-3'3'-CGUCAUCAACGUGAGGAAA-5，。4.根據權利要求3所述的載體，其特征在于，所述siRNA片段的3'端還含有2-6個dT或2-6個U修飾序列。5.根據權利要求3或4所述的載體，其特征在于，所述載體為逆轉錄病毒載體(包括慢病毒載體)、腺病毒載體、腺相關病毒載體及質粒載體等，優選為pSuper、pBabe-Super、pRNA-U6.1/Neo和pSilencer載體。6.根據權利要求1或2所述的siRNA片段在制備治療和/或預防豬繁殖與呼吸綜合征的藥物中的應用。7.根據權利要求3、4或5所述的載體在制備治療和/或預防豬繁殖與呼吸綜合征的藥物中的應用。8.根據權利要求6或7所述的應用，其特征在于，所述治療和/或預防豬繁殖與呼吸綜合征的藥物為抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒的藥物。9.根據權利要求6或7所述的應用，其特征在于，所述治療和/或預防豬繁殖與呼吸綜合征的藥物為抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒M蛋白表達的藥物。全文摘要本發明提供一種治療和/或預防豬繁殖與呼吸綜合征的siRNA片段及其應用。所述siRNA片段及包含該siRNA片段的載體均對豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染的Marc145細胞系具有保護作用，通過實時定量PCR和免疫印跡檢測，發現該siRNA片段能使PRRSV-M蛋白mRNA水平降低約30％-50％。因此，本發明的RNAi片段及包含該RNAi片段的載體可用于制備治療和/或預防豬繁殖與呼吸綜合征的藥物，對基因治療豬繁殖與呼吸綜合征具有重要價值。文檔編號C12N15/63GK101748125SQ20081023918公開日2010年6月23日申請日期2008年12月11日優先權日2008年12月11日發明者何宏軒,周凱,趙寶華申請人:中國科學院動物研究所