專利名稱：由粗糙脈孢菌產生的γ－丁基甜菜堿羥化酶的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種由粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)產生的γ-丁基甜菜堿羥化酶(γ-BBH)。特別是本發明涉及由粗糙脈孢菌產生的編碼γ-丁基甜菜堿羥化酶的多聚核苷酸，包含該多聚核苷酸的重組載體，用該重組載體轉化的轉化體，由該多聚核苷酸編碼的γ-丁基甜菜堿羥化酶，以及一種使用該多聚核苷酸編碼的γ-丁基甜菜堿羥化酶使γ-三甲銨丁酸(γ-butyrobetaine)羥基化制備L-肉堿的方法。
背景技術：
L-肉堿(3-羥基-4-三甲銨基-丁酸)也稱維生素Bt，是一種在人體代謝中非常重要的天然的維生素類似物。L-肉堿由2名俄國科學家Gulewitsch和Krimberg于1905年首先從牛的肌肉組織中分離出來，并于1932年確定了其化學結構。幾乎在所有的機體細胞中都可以發現L-肉堿，它輸送活化后的游離長鏈脂肪酸穿過線粒體內膜。由于線粒體內膜對于脂酰基-輔酶A來說是無法通過的屏障，因此游離的長鏈脂肪酸在細胞質中活化為脂酰CoA，并經L-肉堿酯化后可通過該膜。當骨骼肌，肝，心，腎中的L-肉堿水平較低時，游離長鏈脂肪酸難以作為能量源加以利用。這種異常的肉堿代謝可引起多種疾病，包括發育遲緩，心肌炎和肌無力等。當機體中不能合成足夠量的L-肉堿時，應由食物攝入肉堿以防止肉堿缺乏癥狀。尤其對于不能生物合成L-肉堿的嬰兒來說， L-肉堿是一種必需營養素。
L-肉堿可作為藥物制劑中的一種活性成份。需要外源性補充L-肉堿以治療肉堿缺乏癥及其他疾病，尤其是心臟疾病。近來，L-肉堿的治療作用日顯重要(R.A.Frenkel和J.D.Mc Garry，”肉堿的生物合成，代謝和功能”，學院出版社，1980)。
已確認L-肉堿對于機體有多種重要作用。但是，傳統的生產方法包括生物提取法不適合大規模生產L-肉堿。一種可容易獲取L-肉堿的方法是利用包括光學異構體的DL-肉堿。
但該方法在機體可引起副作用，因其含有D-肉堿(Curr.Ther.Res.28，195-198，1980)。在很多情況下，D-肉堿在機體內與L-肉堿進行競爭，并阻礙游離長鏈脂肪酸在線粒體上的β-氧化。對于腎功能嚴重損傷的患者來說，這種長鏈脂肪酸的代謝障礙，可引起更嚴重抑制。
為獲得光學純L-肉堿，進行了多種嘗試，其中包括化學光學拆分方法(美國專利No.5,166,426)，使用微生物或酶的生物方法(美國專利No.5,187,093)和使用手性化合物作為起始化合物生產L-肉堿的方法(美國專利No.6,420,599B2)。
在各種獲得L-肉堿的方法中，使用微生物或酶的生物方法是使用了一種生物酶-γ-丁基甜菜堿羥化酶來生產光學活性的L-肉堿。在鼠和人中都分離到了該生物酶(Rebouche和Engel，J Biol Chem2558700-8705，1980)，并測定了其核苷酸序列。高等生物(包括哺乳動物)利用蛋白質的氨基酸殘基-賴氨酸作為L-肉堿生物合成的前體，而粗糙脈孢菌由游離的賴氨酸制備光學純L-肉堿(Fraenkel，Biol Bull，104359-377，1953)。該L-肉堿的生物合成機理簡述如下。肉堿的合成起始于由S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體對賴氨酸進行甲基化，形成ε-N-三甲基賴氨酸。三甲賴氨酸經酶催化轉化為β-羥基-三甲基賴氨酸。由所合成的β-羥基-三甲基賴氨酸形成三甲基氨基丁醛，然后轉化為γ-三甲銨丁酸。
在本發明之前，從粗糙脈孢菌中生產出來并使用通過上述機制產生的γ-三甲銨丁酸作為前體生產L-肉堿的編碼γ-丁基甜菜堿羥化酶的核苷酸序列還未被鑒定。

發明內容
基于以上背景知識，本發明人測定了粗糙脈孢菌產生的編碼γ-丁基甜菜堿羥化酶的新基因，并通過生物方法成功的由γ-三甲銨丁酸生產L-肉堿，所述的生物方法是使用該基因表達γ-丁基甜菜堿羥化酶。
附圖的簡要說明從下面的詳細說明及其附圖可更清楚地闡明本發明的上述以及其他目的，特點和其他優點，其中

圖1顯示了不含γ-丁基甜菜堿羥化酶(γ-BBH)基因的大腸桿菌(E.coli)BL21菌株和含γ-BBH基因并用IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖吡哺糖苷)進行誘導的E.coliBL21菌株的細胞溶解產物離心上清液的SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分析結果。
圖2顯示克隆到pT7-7的γ-BBH的cDNA擴增基因的0.8％瓊脂糖凝膠電泳結果。
圖3是多序列比對，其中將來自粗糙脈孢菌的γ-BBH的氨基酸序列與來自人，大鼠和假單胞菌的γ-BBH的氨基酸序列進行比對。
圖4是pT7-BBH2質粒的圖示；和。
圖5是由γ-三甲銨丁酸制備L-肉堿的生產流程示意圖。
本發明的最佳實施方式一方面，本發明提供了由粗糙脈孢菌產生的編碼γ-丁基甜菜堿羥化酶的基因，該基因用SEQ ID No.1表示。
為獲得由絲狀真菌粗糙脈孢菌產生的編碼γ-丁基甜菜堿羥化酶的基因，本發明人首先比較了編碼γ-丁基甜菜堿羥化酶的不同基因以找到“保存區”。對保存區及登記在基因數據庫中的粗糙脈孢菌的整個基因序列進行同源性搜索。從具有部分類似序列的基因中，選擇顯示γ-丁基甜菜堿羥化酶活性的候選基因。為克隆該候選基因，首先合成該基因特定的引物。制備粗糙脈孢菌的cDNA文庫，并使用合成的引物篩選目標基因。將由此獲得的cDNA克隆插入適當的載體內。將得到的重組體載體轉入大腸桿菌，對該轉化體進行的試驗表明基因被成功克隆。通過IPTG處理誘導該重組體載體攜帶的該基因進行蛋白質表達，并用SDS-PAGE法進行分析。與對照試驗進行比較，發現顯示特定蛋白質表達的大腸桿菌轉化體可利用三甲銨丁酸作為底物產生L-肉堿(表1)。
本發明基于發現了粗糙脈孢菌產生的編碼γ-丁基甜菜堿羥化酶新基因，按上述方法測定了該基因，而在本發明中之前該基因沒有被測定。本發明人首次測定了粗糙脈孢菌產生的γ-丁基甜菜堿羥化酶的多聚核苷酸序列，表示為SEQ ID No.1。
編碼具有γ-丁基甜菜堿羥化酶活性的多肽的SEQ ID No.1的多聚核苷酸的各種變體，如片段和衍生物也都包括在本發明的范圍內，只要在它們被表達的形式中含有具有SEQ ID No.1的多聚核苷酸的基因。
另一方面，本發明提供了一種多聚核苷酸，所述的多聚核苷酸所編碼的蛋白質與SEQID No.1的多聚核苷酸具有70％或以上同源性并具有γ-丁基甜菜堿羥化酶活性。
對于多聚核苷酸序列或由所述多聚核苷酸序列編碼的蛋白質或多肽，本文中所使用的術語“同源性”系指野生型氨基酸序列之間或野生型核苷酸序列之間的序列相似性。在蛋白質的情況下，“同源”包括75％氨基酸序列或更高，優選85％或更高，更優選90％或更高，以及最優選95％或更高與本發明的γ-丁基甜菜堿羥化酶蛋白質的氨基酸序列相同。典型的，蛋白質同源可含有與目標蛋白質相同的活性部位。在基因的情況下，“同源”包括基因序列75％或更高，優選85％或更高，更優選90％或更高，以及最優選95％或更高與本發明的編碼γ-丁基甜菜堿羥化酶蛋白質的多聚核苷酸序列相同。同源性評價可用肉眼或使用商業軟件進行。使用商業軟件時，兩個或更多序列之間的同源性可表示為百分率(％)，相鄰序列間的同源性(％)就可以進行評價了。
在一個優先方面，本發明提供一種多聚核苷酸，所述多聚核苷酸編碼的蛋白質與SEQID No.1序列有75％或更高，優選85％或更高，更優選90％或更高，甚至最優選95％的同源性并有γ-丁基甜菜堿羥化酶活性。
在另一方面，本發明提供編碼SEQ ID No.2表示的γ-丁基甜菜堿羥化酶的多聚核苷酸。
根據本發明通過將粗糙脈孢菌產生的編碼γ-丁基甜菜堿羥化酶的多聚核苷酸基因插入一載體，并誘導所得到的重組載體表達蛋白質可大規模生產γ-丁基甜菜堿羥化酶。
因此，在又一方面，本發明提供了一重組體載體，該重組載體含有由粗糙脈孢菌產生的編碼γ-丁基甜菜堿羥化酶的多聚核苷酸基因。
本文中使用的術語“載體”系指DNA構建體，該構建體含有可操作性連接到調控序列的DNA序列以及為便于其他基因操作及優化蛋白質表達而導入的序列，其中所述的調控序列能調控蛋白質在合適宿主中的表達。該調控序列包括用于調控轉錄的啟動子，為了調控轉錄而選擇性加入的操縱子，合適的mRNA核糖體結合位點，以及調控轉錄/翻譯終止的序列。用于插入外源基因的載體可以是質粒，病毒，黏粒等。
載體包括克隆載體和表達載體。克隆載體是一插入外源DNA的可復制質粒，并將外源DNA帶入宿主細胞，宿主細胞由此被轉化。“表達載體”一般指插入一段外源DNA片段，通常為為雙鏈DNA片段。“外源DNA”指非宿主細胞自然形成的異源DNA。表達載體可在宿主細胞中獨立于宿主染色體DNA進行復制，因此可生產被插入的外源DNA。根據現有技術，為提高宿主細胞中轉染基因的表達水平，應將該基因可操作性地連接到被選作表達系統的宿主細胞中有功能的轉錄/翻譯調控序列上。
根據本發明構建的pT7-BBH2載體(Eshcherichia coli DH5αCJ2004)用于表達粗糙脈孢菌產生的編碼γ-丁基甜菜堿羥化酶的多聚核苷酸，該載體于2004年1月27日保存在國際保藏機構，韓國微生物培養中心(KCCM)，登記號為KCCM-10557。
在又一方面，本發明提供了使用含有所述基因的重組載體進行轉化的轉化體。
本文使用的術語“轉化”是指將DNA導入合適的宿主細胞，使該DNA作為染色體外元件或通過染色體整合進行復制。本發明中用于轉化的宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞。此外，典型使用具有外源DNA導入效率高并對所導入的DNA具有高表達水平的宿主細胞。宿主細胞的實例包括原核細胞及真核細胞，如細菌，例如埃希氏菌屬(Escherichia sp.)，假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)，桿狀菌屬(bacillus sp)和鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)，真菌和酵母菌，昆蟲細胞，如草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(sf9)，和動物細胞，如CHO，COS1，COS7，BSC1，BSC40和BMT10。可優先使用大腸桿菌(Escherichia coli)。
由SEQ ID No.1的多聚核苷酸編碼的氨基酸序列表示為SEQ ID No.2。因此，在另一個方面，本發明提供由粗糙脈孢菌產生的并具有SEQ ID No.2氨基酸序列的γ-丁基甜菜堿羥化酶。
仍然在另一個方面，本發明提供了選自包括下列變體的γ-丁基甜菜堿羥化酶，所述的變體與SEQ ID No.2的序列具有75％或更高，優選85％或更高，更優選90％或更高，以及甚至最優選95％的同源性，并且具有γ-丁基甜菜堿羥化酶活性。
如圖5所示，可使用本發明的γ-丁基甜菜堿羥化酶由γ-三甲銨丁酸生產L-肉堿，由此獲得光學純的L-肉堿。
因此，仍然在另一個方面，本發明提供一種制備L-肉堿的方法，所述方法包括使用前述γ-丁基甜菜堿羥化酶使γ-三甲銨丁酸羥基化。
如上述方法制得的L-肉堿可作為L-肉堿補充劑，治療肉堿缺乏癥及其他治療性的目的。
通過下列所列舉的用于說明的實例將有助于更好地理解本發明，這些實例不能解釋為限于本發明。
實例1粗糙脈孢菌cDNA文庫的構建。
為獲得粗糙脈孢菌的cDNA，首先從粗糙脈孢菌中分離出mRNA，并通過PCR(聚合酶鏈式反應)使用多聚胸腺嘧啶(polyT)引物由分離的mRNA合成cDNA。將cDNA插入AD5克隆載體的EcoR1/XhoI位點，并按下述方法在質粒中構建cDNA庫。將大腸桿菌BNN322菌株在添加了卡那霉素和0.2％麥芽糖的LB培養基中培養過夜，離心收集，并在1ml的10mM MgSO4中懸浮。將該細菌懸浮液與構建cDNA文庫的3.5×107λ噬菌體在30℃下一起培養30分鐘，不作攪拌。在培養物中加入2ml LB培養基，將感染菌株在30℃下培養60分鐘，并同時攪拌。將最終的培養物涂布在含氨芐西林(75μl-/ml)的LB平板上。從長出的菌落中分離出質粒，由此構建了cDNA文庫。
實例2為獲得γ-丁基甜菜堿羥化酶基因制備引物。
將粗糙脈孢菌產生的γ-丁基甜菜堿羥化酶(γ-BBH)的氨基酸序列與由人，大鼠及假單胞菌產生的γ-BBH的氨基酸序列進行比較(圖3)。序列1代表粗糙脈孢菌產生的γ-BBH的氨基酸序列，序列2代表人的γ-BBH的氨基酸序列，序列3代表鼠的γ-BBH的氨基酸序列，以及序列4代表假單胞菌的γ-BBH的氨基酸序列。序列同源性結果如下(以雙序列比對開始)序列(12)排列，得分11％；序列(13)排列，得分11％；序列(14)排列，得分10％；
序列(23)排列，得分88％；序列(24)排列，得分29％；序列(34)排列，得分29％。
發現粗糙脈孢菌產生的γ-BBH與由人的γ-BBH有11％的同源性。
為克隆粗糙脈孢菌產生的γ-BBH，根據粗糙脈孢菌基因組的序列資料設計了下列一對引物。
引物1(SEQ ID No.3)5’-ATG AAT TCC ATA TGA TGG CCA CGG CAG CGG TTC AG-3’引物2(SEQID No.4)5’-ATT AGT CGA CTC AAT ACC CTC CCC CAC CCT G-3’實例3γ-BBH的編碼基因的獲得。
由實例1制備的粗糙脈孢菌cDNA文庫，通過PCR方法，使用實例2中制備的一對引物，將γ-BBH基因擴增。將PCR產物在瓊脂糖凝膠上進行電泳，在約1.4kb處觀察到一條帶。使用自動DNA測序儀測定被擴增基因的核苷酸序列。同時，使用NCBI公司的BLAST程序對測定的核苷酸序列進行同源性搜索。結果在粗糙脈孢菌的基因組序列中發現與被擴增基因100％相同的基因，并且被發現的基因的翻譯產物的功能僅為一種假想的蛋白質。然后將PCR產物用EcoRI和Sal I消化，與用相同限制酶消化的pUC19連接，并導入大腸桿菌DH5。使用藍/白斑篩選法鑒定轉化體。當質粒從轉化體中分離出來并進行分析時，發現γ-丁基甜菜堿羥化酶基因已成功插入質粒中。
實例4pT7-BBH2質粒的構建將制得的含有γ-丁基甜菜堿羥化酶基因的質粒用Nde I和Sal I進行消化，并在低熔點的瓊脂糖凝膠上進行電泳。從凝膠上切除與γ-丁基甜菜堿羥化酶基因對應的DNA片段，純化，并插入用Nde I和Sal I處理過的pT7-7內(圖4)。將獲得的質粒轉入大腸桿菌DH5，并在含氨芐西林的固體平板上生長。從長出的菌落中分離重組質粒。當用Nde I和Sal I消化該重組質粒后，發現γ-BBH基因已成功插入質粒(圖2)。因此，該重組質粒稱為”pT7-BBH2”。將該重組體質粒導入大腸桿菌DH5α。由此獲得的轉化體稱為“大腸桿菌Escherichia coliDH5αCJ2004”，該轉化體于2004年1月27日保存在韓國微生物培養中心(KCCM)，登記號為KCCM-10557。
實例5將pT7-BBH2質粒轉入表達性細菌菌株大腸桿菌BL21(DE3)將具有氨芐西林選擇性標記的pT7-BBH2質粒轉入表達性細菌菌株大腸桿菌BL21(DE3)。大腸桿菌BL21(DE3)菌株在有乳糖或IPTG的存在下可產生T7RNA聚合酶，乳糖或IPTG可誘導γ-丁基甜菜堿羥化酶基因的翻譯。將轉化細胞涂布于含氨芐西林的固體培養基上。從長出的菌落中純化質粒，并用Nde I和Sal I消化，以測定所插入的基因及質粒的大小。結果發現，pT7-BBH2已成功導入大腸桿菌BL21(DE3)。
實例6γ-丁基甜菜堿羥化酶的表達將BL21(DE3)/pT7-BBH2轉化體進行培養，以評估γ-丁基甜菜堿羥化酶的表達，所述BL21(DE3)/pT7-BBH2轉化體通過將pT7-BBH2質粒轉入大腸桿菌BL21(DE3)已在實施例5中被制備。在含50ml LB培養基或加入氨芐西林的LB培養基的250ml錐形瓶(baffle flask)中培養該轉化菌株。當培養物的OD600值達0.6時，向培養基加入1mM IPTG后，轉化株細胞再培養4小時。將轉化株細胞離心分離(4,000×g)15分鐘進行收集，再在1ml裂解緩沖液(140mM NaCl，200g/升甘油，1mM DTT，10mM磷酸鈉緩沖液，pH7.4)中懸浮。將細胞懸浮液放入冰浴，并以超聲發生器進行超聲振蕩10秒×5次，以破壞細胞。破壞后的細胞在4℃下離心分離(10,000×g)20-30分鐘。收集上清液后將細胞碎屑丟棄。SDS-PAGE分析顯示了與γ-丁基甜菜堿羥化酶大小一致的約49kDa的帶(圖1)。根據預期用途使用Bradford分析法測定蛋白質濃度。
實例7L-肉堿的測定將粗糙脈孢菌的粗提物在500ul分析緩沖液(20mM KCl，3mM酮戊二酸，10mM抗壞血酸鈉，2g/升三硝基甲苯X-100，0.25mM(NH4)2Fe(SO4)2，0.2mMγ-三甲銨丁酸，20mM磷酸鉀緩沖液，pH7.0)中在37℃下孵育1小時。將500μl提取物上清液與500μl1.2M高氯酸混合。混合液在室溫下孵育10分鐘后，離心分離5分鐘。將600ul上清液與320μl0.7M K3PO4混合后，在冰浴中孵育20分鐘。混合液離心分離5分鐘后，將750μl上清液用250μl無菌蒸餾水稀釋。稀釋后的上清液加入100μl DNTB/H2O2后，在室溫下孵育10分鐘。向反應后混合液中加入50μl過氧化氫酶溶液后，在室溫下孵育30分鐘，然后離心分離。將1ml上清液與50μl乙酰基-輔酶A混合后，在室溫下孵育10分鐘。在405nm處測定吸收值，并計算L-肉堿濃度。
實例8評估粗糙脈孢菌產生的γ-丁基甜菜堿羥化酶利用γ-三甲銨丁酸作為底物生產L-肉堿的能力將實例5中用γ-丁基甜菜堿羥化酶基因轉染的大腸桿菌BL21(DE3)菌株在含50mlLB培養基或加入氨芐西林的LB培養基的250ml錐形瓶中進行培養。當培養物的OD600值達0.6時，向培養基中加入1mM IPTG，并將細胞在25℃下培養8小時以上，以防止在誘導形成蛋白質正確的三級結構時形成包涵體。然后，通過離心(4,000×g)15分鐘收集細胞，并按實例6中相同方法制備蛋白質粗提物。將含1.0mg/ml蛋白質的粗提物在含0.5mg/mlγ-三甲銨丁酸的反應緩沖液中孵育4小時。按實例7相同方法測定L-肉堿濃度，結果如下列表1所示。
表1分析混合物 L-肉堿濃度(μg/ml)γ-BBH分析緩沖液+1.0mg/ml0.0BL21(DE3)粗提物γ-BBH分析緩沖液+1.0mg/ml0.8BL21(DE3)/pT7-BBH2(由IPTG誘導)粗提物工業實用性如前所述，這種新型的由粗糙脈孢菌產生的編碼γ-丁基甜菜堿羥化酶的基因，可用于從γ-三甲銨丁酸生產光學純L-肉堿。
關于國際承認的用于專利程序目的的微生物保藏的布達佩斯條約國際表格致希杰株式會社 初次受理韓國，首爾，中區 由韓國國際保存管理機構根據條約南大門路5街500號 7.1的規定(在本頁的底部確認)

1根據條約6.4(d)，該日期為獲得國際保存管理機構資格的日期；在獲得國際保存管理機構資格之后，在將布達佩斯條約之外所做的保藏轉為布達佩斯條約之下的保藏的情況下，則該日期為該國際保存管理機構收到該微生物的日期。
序列表<110>CJ Corp.
<120>Gamma-Butyrobetaine hydroxylase originated from Neurospora crassa<160>4<170>KopatentIn1.71<210>1<211>1346<212>DNA<213>Neurospora crassa<400>1atggccacgg cagcggttca ggtttcagtc ccagctccgg ttggacaacc agatatcggg 60tacgctcctg accacgacaa gtacctcgca agagtcaaaa gacgacgaga aaacgagaag 120ctggagtcgt ctcttccgcc aggtttccct cgaagactag actcggacct tgtgtgggac 180ggcaacaccc tcgccgagac gtacgactgg acctacagac tgacagaaga ggccattgat 240gaaatcgagg ccgcgcttcg tcattttaag agttagtaca gaatctctcc ttcctgtcct 300tgggcatcaa gccatcaact aaccatcacc gcatgacagg cctcaacaag cccctaggct 360acatcaacca agaaaccttc ccccttcccc gcctacacca cactctccgc tccctctccc 420acgagctcca ccacggccac ggcttcaaag tcctccgcgg gctccccgtc acctcccata 480cacgcgagga aaacatcatc atctacgccg gcgtctcctc gcatgtcgct cctatccgcg 540gccgccagga caaccagcac aacggccacc cagccgacgt agtcctagca cacatcaaag 600acctgtccac gactgtttct gacgtgagca aaatcggtgc acccgcctac accaccgaga 660aacaagtctt ccacaccgac gcaggcgaca tcgtcgccct cttttgcttg ggagaggccg 720
ccgagggcgg acagagttac ctgtccagca gctggaaggt gtacaacgag ctggcagcca 780ctcggcccga tctggttcgc acgctggcgg agccgtgggt ggcggacgag tttggcaagg 840aagggaggaa gttttctgtg cgaccgcttt tgcattttca gtctactgct gctgctgctt 900ctagggaagc aaagcccgag tctgaacggc tcatcatcca gtacgcccgc cgcacgttta 960cggggtattg gggattaccg aggtcggcgg atatcccgcc cattacggag gcgcaggcgg1020aggcgttgga tgcgctgcac tttacggcgg agaagtacgc ggtggcgctg gatttcaggc1080agggggatgt ccagtttgtg aataacttga gtgtgttcca ttcgagggcg gggtttagag1140atgaggggga gaagcagagg catttggtta ggttgtggtt gagagatccg gagaatgcgt1200gggagacgcc cgaggcgttg aaggaacggt gggaacgcgt gtatggcggg gtgagtccgg1260agagggaggt gtttccgctt gagccgcaga ttaggagcgc gagtaagggg gagagcgtgg1320ggacgcaggg tgggggaggg tattga 1346<210>2<211>425<212>PRT<213>Neurospora crassa<400>2Met Ala Thr Ala Ala Val Gln Val Ser Val Pro Ala Pro Val Gly Gln15 10 15Pro Asp Ile Gly Tyr Ala Pro Asp His Asp Lys Tyr Leu Ala Arg Val20 25 30Lys Arg Arg Arg Glu Asn Glu Lys Leu Glu Ser Ser Leu Pro Pro Gly35 40 45
Phe Pro Arg Arg Leu Asp Ser Asp Leu Val Trp Asp Gly Asn Thr Leu50 55 60Ala Glu Thr Tyr Asp Trp Thr Tyr Arg Leu Thr Glu Glu Ala Ile Asp65 70 75 80Glu Ile Glu Ala Ala Leu Arg His Phe Lys Ser Leu Asn Lys Pro Leu85 90 95Gly Tyr Ile Asn Gln Glu Thr Phe Pro Leu Pro Arg Leu His His Thr100 105 110Leu Arg Ser Leu Ser His Glu Leu His His Gly His Gly Phe Lys Val115 120 125Leu Arg Gly Leu Pro Val Thr Ser His Thr Arg Glu Glu Asn Ile Ile130 135 140Ile Tyr Ala Gly Val Ser Ser His Val Ala Pro Ile Arg Gly Arg Gln145 150155160Asp Asn Gln His Asn Gly His Pro Ala Asp Val Val Leu Ala His Ile165 170 175Lys Asp Leu Ser Thr Thr Val Ser Asp Val Ser Lys Ile Gly Ala Pro180 185 190Ala Tyr Thr Thr Glu Lys Gln Val Phe His Thr Asp Ala Gly Asp Ile195 200 205Val Ala Leu Phe Cys Leu Gly Glu Ala Ala Glu Gly Gly Gln Ser Tyr210 215 220Leu Ser Ser Ser Trp Lys Val Tyr Ash Glu Leu Ala Ala Thr Arg Pro225 230 235 240Asp Leu Val Arg Thr Leu Ala Glu Pro Trp Val Ala Asp Glu Phe Gly245 250 255
Lys Glu Gly Arg Lys Phe Ser Val Arg Pro Leu Leu His Phe Gln Ser260 265 270Thr Ala Ala Ala Ala Ser Arg Glu Ala Lys Pro Glu Ser Glu Arg Leu275 280 285Ile Ile Gln Tyr Ala Arg Arg Thr Phe Thr Gly Tyr Trp Gly Leu Pro290 295 300Arg Ser Ala Asp Ile Pro Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ala Glu Ala Leu305 310 315 320Asp Ala Leu His Phe Thr Ala Glu Lys Tyr Ala Val Ala Leu Asp Phe325 330 335Arg Gln Gly Asp Val Gln Phe Val Asn Asn Leu Ser Val Phe His Ser340 345 350Arg Ala Gly Phe Arg Asp Glu Gly Glu Lys Gln Arg His Leu Val Arg355 360 365Leu Trp Leu Arg Asp Pro Glu Asn Ala Trp Glu Thr Pro Glu Ala Leu370 375 380Lys Glu Arg Trp Glu Arg Val Tyr Gly Gly Val Ser Pro Glu Arg Glu385 390 395 400Val Phe Pro Leu Glu Pro Gln Ile Arg Ser Ala Ser Lys Gly Glu Ser405 410 415Val Gly Thr Gln Gly Gly Gly Gly Tyr420 425<210>3<211>35<212>DNA<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer for amplifying the gene of gamma-Butyrobetaine hydroxylaseoriginated from Neurospora crass<400>3atgaattcca tatgatggcc acggcagcgg ttcag 35<210>4<211>31<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>primer for amplifying the gene of gamma-Butyrobetaine hydroxylaseoriginated from Neurospora crass<400>4attagtcgac tcaataccct cccccaccct g 3權利要求
1.一種基因，所述基因選自SEQ ID No.1表示的多聚核苷酸，或編碼SEQ ID No.2表示的γ-丁基甜菜堿羥化酶的多聚核苷酸。
2.含有權利要求1所述的基因的重組載體。
3.根據權利要求2所述的重組載體，其保藏編號為KCCM-10557。
4.一種轉化體，所述的轉化體被含有權利要求1所述的基因的重組載體轉化。
5.根據權利要求4所述的轉化體，其為大腸桿菌。
6.一種γ-丁基甜菜堿羥化酶，所述的γ-丁基甜菜堿羥化酶含有的氨基酸序列選自由SEQ ID No.1表示的多聚核苷酸編碼的氨基酸序列或者由SEQ ID No.2表示的氨基酸序列。
7.一種制備L-肉堿的方法，該方法包括使用權利要求6所述的γ-丁基甜菜堿羥化酶使γ-三甲銨丁酸羥基化。
全文摘要
本發明公開了由粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)產生的編碼γ－丁基甜菜堿羥化酶(γ－BBH)的多聚核苷酸。還公開了包含該多聚核苷酸的重組載體，用該重組載體轉化的轉化體，由該多聚核苷酸編碼的γ－BBH，以及一種制備L－肉堿的方法，所述方法包括使用由該多聚核苷酸編碼的γ－BBH將γ－三甲銨丁酸羥基化。
文檔編號C12N9/02GK101014709SQ200580006308
公開日2007年8月8日 申請日期2005年2月25日 優先權日2004年2月26日
發明者鐘孫歐, 李宏克, 康萬庫, 久杰永, 寇運孫, 帕孫斯, 帕永宏 申請人:希杰株式會社