一種混菌發酵農作物秸稈生產檸檬酸的方法
【專利摘要】本發明公開了一種混菌發酵農作物秸稈生產檸檬酸的方法，1）原材料處理：取當年的農作物秸稈，洗凈，粉碎，過160?180目水篩，在100W功率超聲處理15min，制得農作物秸稈粉；取豆粕粉碎，過80目水篩，制得豆粕粉；2）發酵培養基的配制和滅菌：3）接種發酵，該發酵過程由A、B和C三階段組成，接種發酵周期為112h；4）檸檬酸提取。本發明優點在于：以纖代糧，利用水稻秸稈發酵生產檸檬酸，節約糧食，降低成本，提高產品附加值；混菌同步糖化發酵技術，縮短發酵周期，減少生產設備投資，提高生產效率。
【專利說明】
一種混菌發酵農作物秸稈生產檸檬酸的方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種混菌發酵農作物秸桿生產檸檬酸的方法，屬于生物發酵生產有機酸技術領域。
【背景技術】
[0002]檸檬酸是目前世界上年生產量和消費量最大的有機酸，主要采用發酵法生產。發酵法的原料主要分為糖質原料、淀粉類原料和石油類原料。國外檸檬酸發酵主要采用糖蜜作為原料，我國主要采用淀粉質原料，20世紀九十年代，隨著我國檸檬酸工業的飛速發展，開啟了我國玉米等谷物原料發酵的新時代，目前是我國生產檸檬酸的主流。而石油類原料銀成本和安全想問題沒有堅持研究和生產。但檸檬酸發酵的糧耗一直徘徊在1.7?1.9t/t，所以我國檸檬酸發酵每年要消耗大量的糧食。出現了發酵生產和人畜爭糧的現象。本發明采用農作物的秸桿為原料發酵生產檸檬酸，同時采用混菌進行發酵，極大的降低了發酵生產的成本。農作物的秸桿來源廣泛、獲取容易、價格低廉，并且糖化發酵都采用微生物方法，極大降低了發酵生產成本。

【發明內容】

[0003]本發明的目的在于克服了發酵生產原料成本過高及與人畜爭糧的不足，提供了一種新的發酵工藝。
[0004]本發明是通過如下技術方案實現的:一種混菌發酵農作物秸桿生產檸檬酸的方法，按如下步驟進行:
步驟I)原材料處理:取當年的農作物秸桿，洗凈，粉碎，過160-180目水篩，在10W功率超聲處理15min，制得農作物秸桿粉；
取豆柏粉碎，過80目水篩，制得豆柏粉；
步驟2)發酵培養基的配制和滅菌:所述的發酵培養基各原料及用量為:固形物120g;(NH4)2SO4，4.8g;KH2PO4，3.6g;維生素bl，0.6g; Tween80，5.4g;微量元素混合液120ml ；將發酵培養基加水至1000ml，PH調節至4.5，制得發酵培養液；向20L機械通風發酵罐投料12L發酵培養液，在121°C下滅菌25min，制得培養基料；
所述的固形物是指農作物秸桿粉和豆柏粉按重量比4:1的混合物；
所述的微量元素混合液g/L:氨基乙酸，0.5g/L;MgS04.7H20,3.0g/L；FeS04.7H20,0.1g/L；CoS04,0.1g/L；CaCl2.2H20,0.lg/L；ZnSO4.7H20,0.19g/L；CuSO4.5H20,0.01g/L；AlK(SO4)2.12H20,0.01g/L；H3BO3,0.01g/L；Na2MoO4.2H20,0.01g/L；MnS04.H20,0.01g/L；步驟3)接種發酵:該發酵過程由A、B和C三階段組成，其中:
A階段、當培養基料溫度降到40 °C時，加入菌齡16h的黃孢原毛平革菌(PAaflerocAaeiecAixsoSjPori?)—級菌種，其接種量為13%，開動攪拌，轉速280r/min，通氣量為0.8VVM，發酵溫度設定32°C，調節發酵過程的PH為4.5，發酵12h;
B階段、A階段發酵進行12h后，加入種齡12h的里氏木霉(Trichoderma reesei)—級菌種，其接種量為10%，把攪拌轉速調為320r/min，通氣量為0.8VVM，發酵溫度調節為30 V，維持發酵過程的PH為4.5，發酵24小時；
C階段、13階段發酵進行24h后，加入種齡15h的黑曲霉(yispergiHus fiiger)—級菌種，其接種量為12%，加入2%的甲醇，攪拌轉速調為240r/min，通氣量0.9 VVM，發酵溫度設定為280C，在該階段發酵過程中需添加聚醚類的消泡劑；
所述消泡劑添加的方法:在培養基料中一次性添加質量分數為0.1-0.3%。的消泡劑，然后在發酵周期再進行流加或滴加，使用的質量分數為0.3-0.5%0;
上述A、B和C三個階段的發酵周期共為112h;
步驟4)檸檬酸提取:采用色譜分離技術提取檸檬酸。
[0005]所述的農作物秸桿為水稻秸桿。
[0006]本發明的有益效果:
(1)以纖代糧，利用水稻秸桿發酵生產檸檬酸，節約糧食，降低成本，提高產品附加值；
(2)混菌(里氏木霉、黃孢原毛平革菌和黑曲霉)同步糖化發酵技術，縮短發酵周期，減少生產設備投資，提高生產效率。
【具體實施方式】
[0007]下面結合實施例對本發明作進一步說明。
[0008]實施例1
本實施例中接種發酵所用的菌種，均來源于市場購買，具體信息如下:
(I)黃抱原毛平革菌{Phanerochaete chrysosporiurn)
平臺資源號:1511C0005000004799;
菌株保藏編號:CICC40719;
中文名稱:黃孢原毛平革菌；
屬名:Phanerochaete ；
種名加詞:chrysosporium；
來源:天津市工業微生物研究所；
收藏時間:2006.11.10。(2)里氏木霉(r_ricAoc/e_raa reesei)
平臺資源號:1511C0005000003012;
菌株保藏編號:CICC40359 ；
中文名稱:里氏木霉；
屬名:Trichoderma ；
種名加詞:reesei ；
來源:上海市工業微生物研究所(M306);
收藏時間:2005.11.25。(3)黑曲霉(dus niger)
平臺資源號:1511C0005000008244;
菌株保藏編號:CICC41275;
中文名稱:黑曲霉；
屬名:Aspergi I Ius ；
種名加詞:niger; 來源:黑龍江輕工科學研究院(L242);
收藏時間:2008.4.15。一級菌種的制備
(I)黃抱原毛平革菌{Phanerochaete chrysosporium)一級菌種黃孢原毛平革菌一級菌種的制備:500ml三角瓶中，一級種子培養基裝量200ml，黃孢原毛平革菌孢子懸浮液的接種量為8%，在30°(:，24(^/1^11搖床培養，至菌種濃度約為7乂106CFU/ml;
所述的一級種子培養基:稻草秸桿粉(過180目篩)100g/L;豆柏粉(過80目篩)20g/L;葡萄糖 12g/L；KH2PO4 ,3.6g/L； (NH4)2SO4 ,0.lg/L；VBi,0.05g/L；MgS04.7H20,2.5g/L； jjp蒸饋水至1000ml，？11值自然。
[0009]所述的黃孢原毛平革菌孢子懸浮液的制備:將黃孢原毛平革菌接種到斜面培養基置于28°C恒溫箱中培養，5?7d開始形成孢子，向試管中加入無菌生理鹽水，用接種環輕輕地將孢子從斜面刮下，用6層紗布過濾，去除菌絲片段，制成2X 17個/ml的懸浮液，備用；
所述的斜面培養基為:土豆浸出液200g;葡萄糖20g;瓊脂20g; KH2PO4，3.2g、MgS〇4，1.8g;加水 1000ml，PH 自然。
[0010](2)里氏木霉(r_ricAot/er?a reesei)一級菌種
里氏木霉一級菌種的制備:500ml三角瓶中，一級種子培養基裝量200ml，里氏木霉孢子懸浮液的接種量為10%，28-30°(:全溫搖瓶柜中，22(^/1^11培養，至菌種濃度約為6 X 16CFU/ml ；
所述的一級種子培養基:稻草秸桿粉(過180目篩)100g/L、豆柏粉(過80目篩)20g/L、葡萄糖 12g/L、(NH4)2S04 2.2g/L、MgSO4.7H20 0.5g/L、KH2P04 4.2g/L、CaCl2.2H200.4g/L ， PH為4.5。
[0011]所述的里氏木霉孢子懸浮液的制備:將里氏木霉接種到PDA培養基并斜面置于25°C恒溫箱中培養，培養6d，產生大量孢子，向試管中加入無菌生理鹽水，用接種環輕輕地將孢子從斜面刮下，用6層紗布過濾，去除菌絲片段，制成2 X 17個/ml的里氏木霉孢子懸浮液，備用。
[0012](3)黑曲霉niger)一級菌種
黑曲霉(dSjOe1-g'iDus—級菌種的制備:1000ml三角瓶中加入250ml的搖瓶培養基，紗布封口，滅菌，待溫度下降至40°C以下時，接入上述黑曲霉孢子懸液100ml，35°C恒溫搖瓶柜中，280r/min，培養至黑曲霉菌絲球濃度約為80萬個/ml。合格的菌絲球致密、直徑不超過0.1mm，菌絲短、粗，分枝少，部分膨脹；
所述的搖瓶培養基:稻草秸桿粉(過180目篩)30g/L、葡萄糖20g/L、豆柏粉(過80目篩)20g/L^(NH4)2SO4 3.2g/L、NH4N03，2.6g/L ^KH2PO4，2.4g/L、PH 4.5。
[0013]所述的黑曲霉孢子懸浮液的制備:1000ml三角瓶中裝入25g麩皮，15g稻草粉，(NH4)2SO4，0.6g;加水50ml，拌勻、121°C滅菌lh;(35±l)°C培養，開始時每天早晚各翻動一次，以降低品溫，3d后靜置培養，5-7d制成麩曲種;每瓶加入無菌生理鹽水用六層紗布過濾，制成2.5 X 17個/ml的孢子懸液備用。
[0014]實施例2
本實施例所采用的農作物秸桿為水稻秸桿。
[0015]—種混菌發酵農作物秸桿生產檸檬酸的方法，按如下步驟進行: 步驟I)原材料處理:取當年的農作物秸桿，洗凈，粉碎，過160-180目水篩，在10W功率超聲處理15min，制得農作物秸桿粉；
取豆柏粉碎，過80目水篩，制得豆柏粉。
[0016]步驟2)發酵培養基的配制和滅菌:所述的發酵培養基各原料及用量為:固形物120g ； (NH4)2SO4，4.8g;KH2PO4，3.6g;維生素bl，0.6g; Tween80，5.4g;微量元素混合液120ml；
將發酵培養基加水至1000ml，PH調節至4.5，制得發酵培養液；向20L機械通風發酵罐投料12L發酵培養液，在121°C下滅菌25min，制得培養基料；
所述的固形物是指農作物秸桿粉和豆柏粉按重量比4:1的混合物；
所述的微量元素混合液g/L:氨基乙酸，0.5g/L;MgS04.7H20，3.0g/L;FeS04.7H20，0.1g/L;CoS04，0.1g/L;CaCl2.2H20,0.lg/L；ZnSO4.7H20,0.19g/L；CuSO4.5H20,0.01g/L；AlK(SO4)2.12H20,0.01g/L；H3BO3,0.01g/L；Na2MoO4.2H20,0.01g/L；MnS04.H20，0.01g/L。
[0017]步驟3)接種發酵:該發酵過程由A、B和C三階段組成，其中:
A階段、當培養基料溫度降到40 °C時，加入菌齡16h的黃孢原毛平革菌(PAaflerocAaeiecAixsoSjPori?)—級菌種，其接種量為13%，開動攪拌，轉速280r/min，通氣量為0.8VVM，發酵溫度設定32°C，調節發酵過程的PH為4.5，發酵12h;
B階段、A階段發酵進行12h后，加入種齡12h的里氏木霉(Trichoderma reesei)—級菌種，其接種量為10%，把攪拌轉速調為320r/min，通氣量為0.8VVM，發酵溫度調節為30°C，維持發酵過程的PH為4.5，發酵24小時；
C階段、13階段發酵進行24h后，加入種齡15h的黑曲霉(yispergiHus fiiger)—級菌種，其接種量為12%，加入2%的甲醇，攪拌轉速調為240r/min，通氣量0.9 VVM，發酵溫度設定為280C，在該階段發酵過程中需添加聚醚類的消泡劑；
所述消泡劑添加的方法:在培養基料中一次性添加質量分數為0.1-0.3%。的消泡劑，然后在發酵周期再進行流加或滴加，使用的質量分數為0.3-0.5%0;
上述A、B和C三個階段的發酵周期共為112h。
[0018]步驟4)檸檬酸提取:采用色譜分離技術提取檸檬酸，經檢測檸檬酸可達108.6g/L。
【主權項】
1.一種混菌發酵農作物秸桿生產檸檬酸的方法，其特征在于:按如下步驟進行: 步驟I)原材料處理:取當年的農作物秸桿，洗凈，粉碎，過160-180目水篩，在10W功率超聲處理15min，制得農作物秸桿粉； 取豆柏粉碎，過80目水篩，制得豆柏粉； 步驟2)發酵培養基的配制和滅菌:所述的發酵培養基各原料及用量為:固形物120g;(NH4)2SO4，4.8g; KH2PO4，3.6g;維生素bl，0.6g; Tween80，5.4g;微量元素混合液120ml ；將發酵培養基加水至1000ml，PH調節至4.5，制得發酵培養液；向20L機械通風發酵罐投料12L發酵培養液，在121°C下滅菌25min，制得培養基料； 所述的固形物是指農作物秸桿粉和豆柏粉按重量比4:1的混合物； 所述的微量元素混合液g/L:氨基乙酸，0.5g/L;MgS04.7H20，3.0g/L;FeS04.7H20，0.1g/L;CoS04，0.1g/L;CaCl2.2H20,0.lg/L；ZnSO4.7H20,0.19g/L；CuSO4.5H20,0.01g/L；AlK(SO4)2.12H20,0.01g/L；H3BO3,0.01g/L；Na2MoO4.2H20,0.01g/L；MnS04.H20,0.01g/L；步驟3)接種發酵:該發酵過程由A、B和C三階段組成，其中: A階段、當培養基料溫度降到40 °C時，加入菌齡16h的黃孢原毛平革菌(PAaflerocAaeiecAixsoSjPori?)—級菌種，其接種量為13%，開動攪拌，轉速280r/min，通氣量為0.8VVM，發酵溫度設定32°C，調節發酵過程的PH為4.5，發酵12h; B階段、A階段發酵進行12h后，加入種齡12h的里氏木霉(7>icAoc/er?a reesei)—級菌種，其接種量為10%，把攪拌轉速調為320r/min，通氣量為0.8VVM，發酵溫度調節為30°C，維持發酵過程的PH為4.5，發酵24小時； C階段、13階段發酵進行24h后，加入種齡15h的黑曲霉(yispergiHus fiiger)—級菌種，其接種量為12%，加入2%的甲醇，攪拌轉速調為240r/min，通氣量0.9 VVM，發酵溫度設定為280C，在該階段發酵過程中需添加聚醚類的消泡劑； 所述消泡劑添加的方法:在培養基料中一次性添加質量分數為0.1-0.3%。的消泡劑，然后在發酵周期再進行流加或滴加，使用的質量分數為0.3-0.5%0; 上述A、B和C三個階段的發酵周期共為112h; 步驟4)檸檬酸提取:采用色譜分離技術提取檸檬酸。2.根據權利要求1所述的一種混菌發酵農作物秸桿生產檸檬酸的方法，其特征在于:所述的農作物秸桿為水稻秸桿。
【文檔編號】C12R1/685GK105886556SQ201610413776
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年6月14日
【發明人】孫科, 王 鋒, 宋凱, 曹夢竺
【申請人】徐州生物工程職業技術學院