專利名稱：一種用于觀察水稻葉鞘組織胼胝質的葉鞘組織制片方法
技術領域：
本發明屬于顯微組織切片技術領域，具體涉及ー種用于觀察水稻葉鞘組織胼胝質的葉鞘組織制片方法。
背景技術：
植物維管束系統由韌皮部和木質部組成，是貫穿整個植株體內的主要輸導組織，承擔著植株體內的長距離運輸，是植物輸送光合產物、水分和礦質營養的通道。韌皮部組織由篩管、伴胞和薄壁細胞組 成，韌皮部篩管中含有胼胝質、胼胝質合成酶、韌皮蛋白等多種物質，在篩管的代謝中起著重要調節作用。胼胝質(callous)(主要成分為β-1，3-葡聚糖)的合成、分解直接關系到植物正常的生長代謝過程，在植物的篩管代謝、配子體發育等生命活動中發揮著重要的調節作用。研究表明，機械損傷、病原菌侵染、害蟲為害等外界逆境脅迫可誘導植物細胞合成胼胝質(Jaffemet al，1984)，而且胼胝質的積累與植物抗病、抗蟲特性有關(田國忠等，1994 ；Ecaleet al.，1995，1999 ；Serranoet al.，1998)。植物組織切片方法種類多，每ー種切片法都各有特點和局限性，常用有徒手切片法、石蠟切片法、冷凍切片法等。徒手切片法即用剃須刀切割材料，難以切得很薄、易產生厚薄不勻現象，難以獲得完整的切片；石蠟切片法雖是最常用的方法，但由于材料切片前需經過固定、脫水、透明和包埋等一系列步驟，易使材料變脆、變硬和變形，過程繁瑣、周期長；冷凍切片法是利用冷凍切片機使材料冷凍后進行切片的ー種快速方法。目前，植物組織中胼胝質的檢測常用苯胺藍染色法(李師翁等，1990;Adrienneet al. , 2005; Penet et al. , 2005 ；申業等，2006 ; 丁新倫等，2008)，也有用改良苯酚品紅-苯胺藍壓片法(劉曉瑞等，2008)，主要觀察植物葉片組織受病蟲害等逆境脅迫后和植物小孢子母細胞減數分裂過程中胼胝質的動態變化。丁新倫等(2008)采用徒手切片法及苯胺藍熒光染色技術研究了水稻條紋病毒(RSV)脅迫下杭、感水稻品種葉片中胼胝質沉積的影響。所用方法為對稻苗葉片組織做徒手切片，再在96%こ醇中浸泡過夜，置于磷酸緩沖液(O. 07mol/L, pH=9)中 30 min，用 O. 005% 苯胺藍(O. 07mol/L, pH=9)染色 60 min, 20%甘油封片，最后在Olympus熒光正置顯微鏡下用紫外光激發觀察。但徒手切片難以切得很薄、易產生厚薄不勻現象。由于水稻葉片組織與葉鞘組織中含水量不同，而且葉鞘組織的細胞腔大而壁薄，取樣后葉鞘組織中常有氣泡存在，無法用徒手切片，切片易破碎不完整，難以獲得完整的組織結構。

發明內容
針對現有技術存在的問題，本發明的目的在于設計提供一種用于觀察葉鞘組織胼胝質的葉鞘組織制片方法的技術方案。所述的ー種用于觀察水稻葉鞘組織胼胝質的葉鞘組織制片方法，其特征在于包括以下エ藝步驟
I)材料前處理取分蘗期的水稻葉鞘組織，洗浄擦干后迅速用刀片切成O. 3 O. 5 Cm的小段，然后立即放入10%的甘油溶液中，并用真空泵抽氣10 20 min,直至葉鞘組織下沉為止；
2)樣品固定在冷臺底座先加I滴組織冷凍膠，再將步驟I)得到的葉鞘組織小段垂直置于平放的冷臺上，再加2 5滴組織冷凍膠將葉鞘組織小段完全包裹住，并放在冷凍切片機中的樣品臺上，放置100 140 min后，即可用于冷凍切片； 3)冷凍切片將粘有葉鞘組織小段的冷臺固定在冷凍切片機的冷臺固定槽上，擰緊固定螺絲，并將切片厚度調節旋鈕調至切片厚度 ο μ m，箱體最低控制溫度為-40°c，切片頭最低控制溫度為_50°C，搖動旋轉手輪進行切片；
4)展片先將載玻片靠近切片刀，每切一張切片，用毛筆輕輕地將切片移到載玻片上，每塊載玻片貼上15 20張切片；
5)染色貼好切片后，在室溫下讓冷凍膠稍稍干燥，放入96%酒精浸泡6 10小時后，取出并將酒精晾干，再加入I ml濃度為1/15 mol/L、pH值為7. O的磷酸緩沖液于切片上，45 min后再加I ml濃度為O. I mol、pH值為7. O的苯胺藍染色液，染色60 min后將載玻片緩慢傾斜倒掉染色液；
6)顯微觀察與拍照待切片剛剛干燥時，立即在OlympusBX51熒光正置顯微鏡下用紫外光激發觀察到葉鞘組織中的胼胝質，并用該顯微鏡專用的照相機進行拍照。所述的一種用于觀察水稻葉鞘組織胼胝質的葉鞘組織制片方法，其特征在于所述的步驟I)中真空泵為SHZ-CA型循環水式多用真空泵。所述的一種用于觀察水稻葉鞘組織胼胝質的葉鞘組織制片方法，其特征在于所述的步驟2)中葉鞘組織小段垂直置于平放的冷臺前，先用擦鏡紙將其表面上的殘余液體吸干。所述的一種用于觀察水稻葉鞘組織胼胝質的葉鞘組織制片方法，其特征在于所述的步驟3)中冷凍切片時如冷刀上的霜層較厚，應及時啟動除霜程序以除去切片刀上的霜層以防卷片。本發明顯著縮短了樣品固定、切片和染色的時間，基本上12小時左右即可完成樣品前處理到熒光顯微鏡下觀察拍照的整個過程，而且本發明得到的切片組織結構完整、圖像清晰，同時也有效解決了徒手切片材料組織易碎、切片厚薄不勻，石蠟切片過程繁瑣、周期長(通常需要2周時間)等問題，工作效率極顯著提高。


圖I熒光顯微鏡下觀察到的水稻葉鞘組織橫切面的超微結構(210倍)；
圖2熒光顯微鏡下維管束系統中葉鞘組織維管束的超微結構(放大820倍)；
圖3熒光顯微鏡下維管束系統中維管束篩管中胼胝質的超微結構(放大820倍)。
具體實施例方式以下通過具體實施例來進一步說明本發明。
實施例水稻品種和生育期TN1、苗期試驗時間2011年5-12月
試驗地點浙江省農業科學院植物保護與微生物研究所植保工程研究室 試驗方法材料前處理、固定樣品、冷凍切片、展片、染色和觀察拍照等過程。I)材料前處理取苗期的水稻葉鞘組織，輕輕洗凈后擦干后迅速用刀片切成O. 3 O. 5 Cm的小段，立即放入10%的甘油溶液中，用SHZ-CA型循環水式多用真空泵抽氣10 20 min,優選為15 min,直至葉鞘組織下沉為止。2)樣品固定將葉鞘組織取出，放在擦鏡紙上將其表面上的殘余液體吸干，在冷臺底座先加一滴冷凍切片機(Leica CM 1900 Cryostat ；Leica Microsystems NusslochGmbH, German)專用的組織冷凍膠(Jung Tissue Freezing Medium ),再將切好的葉鞘組織小段垂直置于平放的冷臺上，再加2 5滴組織冷凍膠將葉鞘組織完全包裹住，放在冷凍切片機中的樣品臺上，放置100 140 min后，優選為120 min，即可用于冷凍切片。3)冷凍切片將粘有葉鞘組織的冷臺固定在冷凍切片機(Leica CM 1900Cryostat ；Leica Microsystems Nussloch GmbH, German)的冷臺固定槽上,抒緊固定螺絲，并將切片厚度調節旋鈕調至切片厚度10 μ m,箱體最低控制溫度為-40°c，切片頭最低控制溫度為-50V。搖動旋轉手輪進行切片。其間如冷刀上的霜層較厚，應及時啟動除霜程序以除去切片刀上的霜層以防卷片。4)展片先將載玻片以合適的角度靠近切片刀，每切一張切片，用毛筆輕輕地將切片移到載玻片上，每塊載玻片貼上15 20張切片。5)染色貼好切片后，在室溫下讓冷凍膠稍稍干燥，放入96%酒精浸泡8 10小時后，取出將酒精晾干，加入I ml濃度為1/15 11101/1、？!1值為7.0的磷酸緩沖液于切片上，浸沒切片即可，45 min后再加I ml濃度為0.1 mol/L的苯胺藍染色液(苯胺藍染色液用濃度為1/15 mol/L, pH=7.0的磷酸緩沖液配制而成)，染色60 min后將載玻片緩慢傾斜倒掉染色液。6)顯微觀察與拍照待切片剛剛干燥時，立即在Olympus BX51熒光正置顯微鏡下用紫外光激發觀察到葉鞘組織中的胼胝質(淡黃綠色熒光部分)，并用該顯微鏡專用的照相機(QIMAGING Micro Publisher 5. O RTV，Canada)進行拍照。試驗結果圖I顯示完整的水稻苗期葉鞘組織橫切面的超微結構，可以清楚觀察 到一個葉鞘組織橫切面上至少有五個維管束系統，每個維管束系統有韌皮部和木質部組成，韌皮部篩管中有胼胝質(淡黃綠色熒光部分)，木質部導管中沒有胼胝質。圖2 3顯示一個維管束系統中的超微結構以及維管束篩管中胼胝質和表皮組織上胼胝質的沉積狀況。
權利要求
1.一種用于觀察水稻葉鞘組織胼胝質的葉鞘組織制片方法，其特征在于包括以下工藝步驟 1)材料前處理取分蘗期的水稻葉鞘組織，洗凈擦干后迅速用刀片切成O.3 O. 5 Cm的小段，然后立即放入10%的甘油溶液中，并用真空泵抽氣10 20 min,直至葉鞘組織下沉為止； 2)樣品固定在冷臺底座先加I滴組織冷凍膠，再將步驟I)得到的葉鞘組織小段垂直置于平放的冷臺上，再加2 5滴組織冷凍膠將葉鞘組織小段完全包裹住，并放在冷凍切片機中的樣品臺上，放置100 140 min后，即可用于冷凍切片； 3)冷凍切片將粘有葉鞘組織的冷臺固定在冷凍切片機的冷臺固定槽上，擰緊固定螺絲，并將切片厚度調節旋鈕調至切片厚度 ο μ m，箱體最低控制溫度為-40°c，切片頭最低控制溫度為_50°C，搖動旋轉手輪進行切片； 4)展片先將載玻片靠近切片刀，每切一張切片，用毛筆輕輕地將切片移到載玻片上，每塊載玻片貼上15 20張切片； 5)染色貼好切片后，在室溫下讓冷凍膠稍稍干燥，放入96%酒精浸泡6 10小時后，取出并將酒精晾干，再加入I ml濃度為1/15 mol/L、pH值為7. O的磷酸緩沖液于切片上，45 min后再加Iml濃度為O. I mol、pH值為7. O的苯胺藍染色液，染色60 min后將載玻片緩慢傾斜倒掉染色液； 6)顯微觀察與拍照待切片剛剛干燥時，立即在OlympusBX51熒光正置顯微鏡下用紫外光激發觀察到葉鞘組織中的胼胝質，并用該顯微鏡專用的照相機進行拍照。
2.如權利要求I所述的一種用于觀察水稻葉鞘組織胼胝質的葉鞘組織制片方法，其特征在于所述的步驟I)中真空泵為SHZ-CA型循環水式多用真空泵。
3.如權利要求I所述的一種用于觀察水稻葉鞘組織胼胝質的葉鞘組織制片方法，其特征在于所述的步驟2)中葉鞘組織小段垂直置于平放的冷臺前，先用擦鏡紙將其表面上的殘余液體吸干。
4.如權利要求I所述的一種用于觀察水稻葉鞘組織胼胝質的葉鞘組織制片方法，其特征在于所述的步驟3)中冷凍切片時如冷刀上的霜層較厚，應及時啟動除霜程序以除去切片刀上的霜層以防卷片。
全文摘要
一種用于觀察水稻葉鞘組織胼胝質的葉鞘組織制片方法，屬于顯微組織切片技術領域。其包括1)材料前處理；2)樣品固定；3)冷凍切片；4)展片；5)染色；6)顯微觀察與拍照。本發明顯著縮短了樣品固定、切片和染色的時間，基本上12小時左右即可完成樣品前處理到熒光顯微鏡下觀察拍照的整個過程，而且本發明得到的切片組織結構完整、圖像清晰，同時也有效解決了徒手切片材料組織易碎、切片厚薄不勻，石蠟切片過程繁瑣、周期長等問題，工作效率極顯著提高。
文檔編號G01N1/28GK102620960SQ20121004829
公開日2012年8月1日 申請日期2012年2月29日 優先權日2012年2月29日
發明者何月平, 張玨鋒, 楊麗, 陳建明 申請人:浙江省農業科學院