一種疫霉誘導性人工合成啟動子pmp2及其重組表達載體和應用
【專利摘要】本發明屬于生物技術領域，公開一種疫霉誘導性人工合成啟動子PMP2及其重組表達載體和應用，該啟動子是以ATCCAA順式元件及其上下游各12bp的側翼序列為核心序列。取該順式元件及其在基因啟動子中上下各12bp的側翼序列，共30bp的序列，人工合成四聚體序列作為啟動子PMP2，將PMP2融合GUS報告基因構建到植物表達載體pMDC162中，并通過農桿菌介導的煙草瞬時表達系統，對啟動子的病原菌誘導表達特性進行分析。結果發現人工合成PMP2啟動子能在疫霉菌的誘導下快速、高效的驅動GUS報告基因的上調誘導表達。由此可見，人工合成PMP2啟動子是病原誘導性啟動子，為植物抗疫霉基因工程提供有價值的病原誘導性啟動子。
【專利說明】
一種疫霉誘導性人工合成啟動子PMP2及其重組表達載體和 應用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物技術領域，涉及一種疫霉誘導性人工合成啟動子PMP2及其重組表 達載體和該疫霉誘導性啟動子、重組表達載體的應用。
【背景技術】
[0002] 有效控制植物病害一直是植物病理學研究的核心問題。長期以來，使用化學農藥 是病害控制的主要技術，但在實際應用中面臨的問題是:一方面缺少有效的藥劑，另一方面 在用藥的過程中伴隨的藥害，環境污染等問題。后來又提出抗病育種策略，但因其周期長， 成本高，規模大，精準度低等一系列的問題，很難進行推廣應用。隨著分子生物學和生物技 術的發展，進一步提出了抗病基因工程的策略，但伴隨的問題是：當組成性表達一個防衛反 應相關基因時，很難控制基因表達的精準度，往往會影響植物的正常生長發育。而病原誘導 性啟動子可能為解決這一問題提供新的希望，因為病原誘導性啟動子能在時空上精準的調 控基因在病原侵染點特異表達。
[0003] 疫霉屬(Phytophthora)目前已經鑒定的有100多種，他們中的大多數為植物病原 菌，所引起的植物病害常具有流行性和毀滅性，故稱為疫病。在生產上，控制疫霉病害的主 要方法是選育抗病品種，但隨著疫霉基因組的快速進化和變異，抗病品種的抗性也會在短 時間內喪失。因此，植物抗疫霉基因工程還面臨巨大的挑戰。目前在生產上還缺乏功能清 楚，有應用潛力的疫霉誘導性啟動子。因此利用抗病轉基因工程策略，人工合成出疫霉誘導 性啟動子，將為植物抗疫霉根腐病基因工程提供有價值的啟動子。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的是解決現有技術中對疫霉菌病害控制方法復雜、控制效果不明顯， 而新型的抗病基因工程技術中缺少可用的病原誘導性啟動子的問題，提供一種疫霉菌誘導 性啟動子。該啟動子來源于對180個疫霉誘導性啟動子序列的分析，獲得一個新型的順式元 件，提取順式元件ATCCAA及其上下游各12bp的側翼序列，共30bp的序列，人工合成四聚體形 成啟動子PMP2，將該啟動子構建在植物表達載體pMDCl62中，能在疫霉的誘導下特異的驅動 下游⑶S報告基因的上調表達。
[0005] 本發明的另一目的在于提供含有上述疫霉菌誘導性啟動子的重組表達載體、轉基 因細胞系和轉基因重組菌。
[0006] 本發明的又一目的在于提供上述疫霉菌誘導性啟動子及其重組表達載體的應用。
[0007] 本發明的目的通過以下技術方案實現：
[0008] -種疫霉誘導性啟動子PMP2,該啟動子是以ATCCAA順式元件及其上下游各12bp的 側翼序列(共30bp的序列)為核心序列。優選的，上游的側翼序列為TTCAGTTATTTG，下游的側 翼序列為AACGGAAGCAAG。該啟動子能夠在疫霉菌侵染下，快速的驅動其下游基因的上調表 達，即將其構建在GUS報告基因的上游，可以在疫霉菌的誘導下驅動GUS報告基因的表達。
[0009] 選擇GUS報告基因與疫霉誘導性啟動子結合，利于檢測疫霉誘導性啟動子的這種 病原菌誘導表達特征；當然，如果采用任何生物技術領域可用的報告基因與該疫霉誘導性 啟動子結合，能達到同樣的目的，均可，比如綠色熒光蛋白GFP等。
[0010] 人工合成上述核心序列的四聚體形成疫霉誘導性啟動子PMP2,即該啟動子是上述 核心序列的四聚體，包含有四個重復的順式元件ATCCAA，每個所述順式元件ATCCAA的上下 游各有12bp的側翼序列。
[0011] 優選的，該疫霉誘導性啟動子PMP2的序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0012] -種核苷酸序列，其在于該核苷酸序列中包含有上述的疫霉誘導性啟動子的序 列。
[0013] 含有上述的疫霉誘導性啟動子的重組表達載體、轉基因細胞系和轉基因重組菌。
[0014] 上述的重組表達載體，其在于該重組表達載體是將上述的疫霉誘導性啟動子的序 列構建在植物表達載體的報告基因上游，所述的疫霉誘導性啟動子能夠在疫霉菌的誘導下 驅動報告基因的表達。本發明中所使用的報告基因為GUS報告基因，但不限于此。本發明所 使用的植物表達載體為PMDC162。但是人工合成疫霉菌誘導性啟動子序列具有唯一性，植物 表達載體并不是唯一，本發明列舉出的植物表達載體PMDC162只是一種更適合用于本發明 提供的目的基因的轉化。
[0015]上述的疫霉誘導性啟動子在構建含有疫霉誘導性啟動子的重組表達載體上的應 用。
[0016] 上述的疫霉誘導性啟動子在構建具有疫霉菌誘導表達的轉基因植物中的應用。所 述的轉基因植物優選為煙草。
[0017] 上述的核苷酸序列或含有疫霉誘導性啟動子的重組表達載體在構建具有疫霉菌 誘導表達的轉基因植物中的應用。
[0018] 本發明基于大豆的2888張基因芯片，通過生物信息學分析180個疫霉誘導型基因 啟動子區，根據順式結構元件的出現頻率、位置分布以及與誘導性基因表達量的關系，獲得 核心序列為ATCCAA的新型順式作用元件。取該順式元件及其在基因啟動子中上下各12bp的 側翼序列，共30bp的序列，人工合成四聚體序列作為啟動子PMP2,將PMP2融合GUS報告基因 構建到植物表達載體PMDC162中，并通過農桿菌介導的煙草瞬時表達系統，對啟動子的病原 菌誘導表達特性進行分析。結果發現人工合成PMP2啟動子能在疫霉菌的誘導下快速、高效 的驅動GUS報告基因的上調誘導表達。由此可見，人工合成PMP2啟動子是病原誘導性啟動 子，為植物抗疫霉基因工程提供有價值的病原誘導性啟動子。
[0019] 本發明的有益效果：
[0020] 1.發明人通過大量試驗，發現來源于大豆的人工合成啟動子受疫霉菌的誘導，能 特異驅動下游基因的快速上調表達。因此，該啟動子在植物抗疫霉基因工程中具有較強的 應用潛力。
[0021 ] 2.由于病原菌侵染速度非常快，如果能夠使受侵染植物快速啟動其防衛相關基因 的表達，對提高其抗病性是至關重要。本發明通過試驗，證明用寄生疫霉游動孢子浸泡接種 的方法處理瞬時表達了人工合成的啟動子及其重組表達載體，可以在接種后的2h檢測到報 告基因的快速、高強度的表達。說明人工合成的啟動子PMP2是一個疫霉誘導性啟動子。 [0022] 3.提前在煙草中表達如下重組質粒：由PMP2啟動子融合GUS報告基因的PMP2: :GUS 重組質粒。72h后接種寄生疫霉Pp〇25,可以在侵染后2h驅動報告基因快速上調表達。說明人 工合成的啟動子PMP2是病原誘導性啟動子。該啟動子能在煙草瞬時表達系統中表達，在疫 霉誘導下快速驅動下游⑶S報告基因的上調表達，為植物抗疫霉基因工程提供有價值的病 原誘導性啟動子，其成為植物抗疫霉基因工程的候選材料，進一步可為生產上提供有持久 抗病潛力的育種材料。
【附圖說明】
[0023] 圖1獲得的新型順式元件與疫霉誘導表達基因表達量的關系(A)和在啟動子中的 定位(B)
[0024] 將基因芯片中受疫霉特異性誘導的180個基因分為兩組:含有該順序元件的為一 組和不含該順式元件的為另一組。然后對比這兩組基因在接種疫霉一天后誘導表達量升高 的倍數。從圖IA中可以看出，含有個ATCCAA順式元件的一組受疫霉誘導表達倍數更高。圖 1B:ATCCAA順式元件出現在基因啟動子中的位置及其分布。
[0025]圖2構建人工合成疫霉誘導性啟動子的重組植物表達載體pMDC162示意圖 [0026]圖中的四個"motif"表示:將新型順序元件ATCCAA及其在基因啟動子中上下游各 12bp側翼序列作為一個"motif"，將"motif"以串聯的形式形成四個重復單元，作為人工合 成啟動子PMP2,經Kpn I和BgL II雙酶切后插入到該區。"35S min"是組成型CaMV35S啟動子 中的-46~+8區域。最終形成人工合成PMP2啟動子融合35S min和⑶S報告基因的pMDC162重 組植物表達載體。
[0027]圖3在煙草瞬時表達體系中檢測人工合成啟動子PMP2驅動⑶S報告基因表達的化 學組織染色結果
[0028]圖中人工合成PMP2啟動子，組成性表達強啟動子（陽性對照）、不能驅動基因表達 的小啟動子（陰性對照）分別在煙草上表達3d后，用辣椒疫霉P.c35游動孢子（IO5個/mL)接 種，并在接種后的Oh和2h用化學組織染色的方法檢測GUS報告基因的活性。
[0029]圖4在煙草瞬時表達體系中檢測人工合成啟動子PMP2驅動⑶S報告基因表達的酶 活及mRNA檢測
[0030] A.人工合成PMP2啟動子，在煙草上表達3d后，用辣椒疫霉P.C35游動孢子（IO5個/ mL)接種，并在接種后的Oh和2h檢測GUS報告基因的酶活性。
[0031] B.人工合成PMP2啟動子，在煙草上表達3d后，用辣椒疫霉P. C35游動孢子（IO5個/ mL)接種，并在接種后的Oh和2h用實時熒光定量PCR的方法檢測GUS報告基因轉錄水平的表 達。
【具體實施方式】
[0032]下面結合實施例對本發明做進一步說明，下列實施例中未注明具體條件的實驗方 法，通常按照本領域的公知手段。
[0033]實施例1新型順式元件ATCCAA的獲得
[0034] 1.根據芯片數據篩選疫霉特異誘導性基因啟動子結構元件
[0035] 根據三個不同的大豆品種：：V71-370，VPRIL9，Sloan受大豆疫霉侵染過程全基因 表達譜的芯片數據文獻（Zhou L，Mideros SX，Bao L，et al. Infection and genotype remodel the entire soybean transcriptome[J].BMC Genomics,2009,10(1):49-59.), 分析該文獻中涉及的180個在大豆疫霉侵染后上調表達基因的啟動子區。我們首先搜集了 一些已報到的作用元件序列，查找這些序列在這180個基因中出現的頻率以及其位置分布， 并將含有這些元件的啟動子在接種后Id的表達情況與不含這些元件的啟動子進行比較。然 后分析這些元件在各自啟動子中的位置分布。而對于新的結構元件的挑選，本發明的標準 是，在疫霉特異誘導的基因的啟動子中出現頻率明顯高于其他它基因，并且在三個品種的 大豆中，接種疫霉Id后含有該元件的基因上調表達的情況要明顯高于不含該元件的基因。 [0036] 2.順式元件特征分析
[0037] 根據順式結構元件的出現頻率、位置分布以及與誘導性基因表達量的關系。啟動 子中順式元件通常含有5~9個堿基，我們將5、6、7、8、9個堿基的不同組合全部列出，然后尋 找每種堿基組合在180個疫霉特異性誘導基因中出現的頻率，并在大豆基因組中挑選180個 基因，分析每種堿基組合在180個的基因中出現的頻率，同已知順序元件出現的頻率相比較 得出顯著性。挑取P <0.01的堿基組合，用分析已知順式元件的方法分析其與表達量的關 系，并挑選在三個大豆品種中，表達量變化趨勢一致的堿基組合。經過以上分析，我們共獲 得25個新的順式元件。
[0038] 本發明所涉及到的新型順式元件ATCCAA是其中的一個，當基因中含有該順式元件 時，其疫霉誘導表達量高于不含該順式元件基因，據此我們推測這些順式元件可能在大豆 基因受疫霉誘導表達方面起著重要作用，結果見圖1A。而圖IB則是各結構元件在啟動子中 位置的統計，該順式元件在基因啟動子中分布沒有明顯的趨向性。
[0039] 實施例2人工合成的PMP2啟動子是疫霉誘導性啟動子
[0040] 1.人工啟動子的合成與載體構建
[0041] 將由生物信息學分析獲得的新型順式元件ATCCAA，及其上下游各12bp的側翼序 列，共30bp，人工合成這30bp的四個重復單元，作為人工合成啟動子PMP2的序列（如SEQ ID NO. 5所示），用于構建植物表達載體。
[0042] 根據 Chai C,Lin Y1Shen D , et al . Identification and Functional Characterization of the Soybean GmaPPOl2 Promoter Conferring Phytophthora sojae Induced Expression[J] .PloS One,2013,8(6) :1_6.文章中構建啟動子融合GUS報 告基因的植物表達載體方法獲得由四個重復單元融合⑶S報告基因的PMP2::⑶S重組質粒， 載體的構建模式圖如圖2所示。
[0043] 2.農桿菌介導的本氏煙瞬時表達與接種
[0044] 將PMP2: :GUS重組質粒的植物表達載體pMDC162通過電轉化技術轉入GV3101農桿 菌(Biovector)菌株(該菌株為本領域技術人員公知的植物轉化常用菌株，南京農業大學大 豆疫霉與植物互作實驗室保存）中，將農桿菌的陽性轉化子于3ml添加卡那霉素（50yg/mL) 的LB培養液中，220rpm，28-30°C培養48h，4000rpm離心4min，收集菌體，用IOmM MgCl2重懸， 重復三次后，用IOmM MgCl2定容至OD 600 = 0.4~0.6。取生長6-8周的煙草，從上數第三至 第六片完全展開的真葉被用于滲透接種農桿菌。用針頭在煙草下表皮造成一小傷口，用ImL 無針頭的注射器將30-50yL農桿菌懸液滲透到本氏煙葉片中。注射后72h接種。剪下注射的 煙草葉片，浸泡在辣椒疫霉孢子懸浮液中，孢子濃度為IO 5個/mL，分別在接種后0,和2h取 樣，迅速用液氮凍存，以備檢測GUS酶活性，或用浸泡在GUS染液中用于GUS染色。實驗重復三 次，每次設三個生物學重復，用于檢測煙草瞬時表達體系中的疫霉誘導表達的報告基因 GUS 活性。
[0045] 3. GUS活性分析
[0046] 3.1 GUS化學組織染色
[0047] 參照Jefferson等方法（Jefferson RA，Kavanagh TA，Bevan MW.GUS fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants[ J].EMBO J，1987,6(13):3901-3907.)測定煙草葉片和根毛中的GUS報告基因的表 達。將需要染色的葉片(來源于實例2的樣品材料)浸泡在⑶S染液(50mmoI I/1磷酸鈉緩沖液 pH 7.0, IOmol L-1EDTA, Immol !/1X-Gluc，0· I%Triton X-100，IOmmol !/1P-疏基乙醇）中， 置于37°C溫育12h，75%乙醇沖洗兩次，再用95%乙醇脫色，直至底色完全消失。分別在煙草 上表達3d后，用辣椒疫霉P. c35游動孢子（IO5個/mL)接種，并在接種后的0，和2h用化學組織 染色的方法檢測⑶S報告基因的活性。圖3顯示的是重組質粒瞬時表達煙草的化學組織染色 結果，結果表明:PMP2啟動子能在瞬時轉化的煙草葉片上驅動報告基因的表達，表現為染色 的藍色深度在2h時比與Oh的顏色深;在2h GUS染色的強度幾乎接近了陽性對照的強度，而 在陰性對照中沒有顏色變化。
[0048] 3.2 GUS酶活檢測
[0049] 將需要測定GUS酶活性的材料:葉片（來源于實例2的樣品材料)約IOOmg置研缽中 加液氮研磨成粉末加入提取緩沖液500yL(50mM NaH2P〇4，pH 7.0，10mM EDTA，0.1%Triton X-100，0.1 (w/v)十二烷基磺酸鈉，ΠΜΜβ-巰基乙醇），4°C離心，上清為⑶S蛋白提取液。用 BSA法測定蛋白濃度。取出部分加 GUS反應底物4-MUG，于37°C反應30min，在激發光365nm發 射光455nm的條件下進行熒光測定，3次生物學重復，最終以單位時間內產物的相對變化量 來計算GUS報告基因的酶活性值。圖4-A顯示的是重組質粒瞬時表達煙草檢測GUS報告基因 酶活的結果表明，與未接種的樣品相比，PMP2啟動子能在接種后的2h驅動報告基因上調表 達5.85倍。
[0050] 3.3 GUS mRNA的檢測
[0051] 以實施例2方法2獲得的材料為對象，采用實時熒光定量PCR的方法檢測以檢測GUS 報告基因轉錄水平的表達。將實施例2方法2獲得的材料，置研缽中加液氮研磨成粉末，加入 試劑盒RNeasy kit(Tiangen)的相應試劑，提取總RNA。用iScript cDNA Synthesis kit (TaKaRa)反轉錄為cDNA，并定量到lOOngyl-1。用SYBR master mix(TaKaRa)試劑盒，在ABI 7500Real_time PCR system焚光定量儀上采用SYBR greenl焚光染料法進行qRT-PCR分析， 采用相對定量2^Aet法分析基因的轉錄水平表達情況。實驗設計3個生物學重復。
[0052] 用本氏煙的EFla(Genbank accession no.AF120093.1)作為煙草的內參基因，其 引物：
[0053] 上游引物EFla-QF:序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0054] 下游引物EFla-QR:序列如SEQ ID NO.2所示。
[0055] 檢測⑶S轉錄水平表達用到的引物：
[0056] 上游引物mGUS-QF:序列如SEQIDN0·3所示；
[0057] 下游引物mGUS-QR:序列如SEQIDN0·4所示。
[0058]圖4-B顯示的是PMP2::⑶S重組質粒瞬時表達煙草檢測⑶S報告基因轉錄水平的表 達，結果表明：人工合成的PMP2啟動子在疫霉接種后的2h能夠驅動GUS報告基因在轉錄水平 上調表達3.72倍。
[0059]用煙草瞬時表達系統，兩種不同的檢測⑶S報告基因活性的方法，最終驗證了人工 合成的PMP2啟動子能在疫霉誘導早期快速驅動其下游報告基因上調表達。由此可見，PMP2 啟動子是疫霉誘導性啟動子。本研究中所用到的引物見表1。
[0060]表1本研究中所用到的熒光定量引物
[0064]可以知道，上述實施例僅為了說明發明原理而采用的示例性實施方式，然而本發 明不僅限于此，本領域技術人員在不脫離本發明實質情況下，可以做出各種改進和變更，這 些改進和變更也屬于本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種疫霉誘導性啟動子，其特征在于:該啟動子是以ATCCAA順式元件及其上下游各 12bp的側翼序列為核心序列。2. 根據權利要求1所述的疫霉誘導性啟動子，其特征在于：上游的側翼序列為 TTCAGTTAITTG，下游的側翼序列為 AACGGAAGCAAG。3. 根據權利要求1或2所述的疫霉誘導性啟動子，其特征在于:該啟動子包含有四個重 復的順式元件ATCCAA，每個所述順式元件ATCCAA的上下游各有12bp的側翼序列。4. 根據權利要求3所述的疫霉誘導性啟動子，其特征在于：該啟動子的序列如SEQ ID NO. 5所示。5. -種核苷酸序列，其特征在于該核苷酸序列中包含有權利要求1~4任意一項所述的 疫霉誘導性啟動子的序列。6. 含有權利要求1~4任意一項所述的疫霉誘導性啟動子的重組表達載體、轉基因細胞 系和轉基因重組菌。7. 根據權利要求6所述的重組表達載體，其特征在于該重組表達載體是將權利要求1、 2、3或4所述的疫霉誘導性啟動子的序列構建在植物表達載體的報告基因上游，所述的疫霉 誘導性啟動子能夠在疫霉菌的誘導下驅動報告基因的表達。8. 權利要求1~4任意一項所述的疫霉誘導性啟動子在構建含有疫霉誘導性啟動子的 重組表達載體和構建具有疫霉菌誘導表達的轉基因植物中的應用。9. 根據權利要求8所述的應用，其特征在于所述的轉基因植物為煙草。10. 權利要求5所述的核苷酸序列以及權利要求6或7所述的重組表達載體在構建具有 疫霉菌誘導表達的轉基因植物中的應用。
【文檔編號】C12N15/113GK105861508SQ201610452614
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月21日
【發明人】竇道龍, 柴春月, 曾文韜
【申請人】南京農業大學