專利名稱：白蛋白和抗體的親和生產工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術和生物醫藥領域，更具體地，本發明涉及一類新的白蛋白親和層析介質及其制備方法。本發明還涉及用這類新的親和層析介質純化生產白蛋白和丙種球蛋白的新方法。
血漿蛋白成份在動物體內具有重要的生理功用。這些蛋白成份可以分離、加工成適合臨床治療用的各種制劑，分別供臨床上對癥治療用。目前，國際上從血漿中制備的蛋白制品有白蛋白(albumin)制劑、免疫球蛋白(immunoglobulin)制劑、凝血因子Ⅷ制劑、凝血因子Ⅸ制劑、抗凝血酶Ⅲ(antithrombin Ⅲ)、纖維結合蛋白(fibronectin)、α2-巨球蛋白(α2-macroglobulin)、α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin)等。
通過充分合理的綜合利用血漿中的有效成份和血漿成份，可以達到全面綜合利用寶貴血漿的目的。既減少了輸用全血造成的不必要的浪費，又可以減少血源性疾病的傳播。這些制品大多都應用在人的生命受到危險和遺傳性疾病方面，需要輸入的量大，或持續時間長。因此，對產品的質量和安全性要求高，市場需求穩定。根據血液制品種類和生產技術的水平的不同，國際市場的容量為數百億美元。
目前，血液制品的生產技術主要采用低溫乙醇沉淀法。這種工藝已經有50年的歷史了。這類傳統方法操作步驟多，產品種類有限，血漿中的很多其他有效物質被浪費掉了。比如，生產滅毒合格的白蛋白和抗體，需要10步操作。這種工藝生產的白蛋白和抗體，產品純度不夠高，雖然生產過程中使用了病毒滅活步驟，但潛在病毒的遺傳物質(DNA和RNA)和組成蛋白并沒有去除干凈，在某些條件下仍然有危險。
雖然近年來發展出了以離子交換和凝膠過濾為中心的層析法生產工藝，但是生產滅毒合格的白蛋白和抗體仍需要10步左右的操作。使用這種工藝，產品的純度有所提高，但生產成本并沒有降低，產品種類也沒有增加，血漿中許多其它含量較少的寶貴蛋白質仍被浪費掉了。
低溫乙醇法的操作相對簡單，產量高，適宜工業化規模生產。低溫乙醇法還有保持蛋白質天然性質的優點乙醇沉淀血漿蛋白在接近血漿溶液冰點溫度下進行，能使蛋白質變性降至最低限度，保持其天然狀態。此外，低溫乙醇法分離過程中有抑菌作用。近年來的研究證明，適當的低溫乙醇工藝(6+9法、Kistler和Nitschmann法)有殺滅和清除艾滋病毒的作用，增強了制品的安全性。乙醇作為主要原材料，價格低廉，易于獲得。但低溫乙醇法的應用，應具備低溫冷室及連續冷凍離心機等設備條件，需要相當的資金。另外，工作人員需在相對低溫條件下操作。產品的純度有限，最終產品種難免含有微量的雜質和變性產品，易于引起負反應。國際上除一些發達國家之外的大多數國家，目前主要仍然采用傳統的乙醇沉淀及其改進工藝生產血液制品。由于工藝的限制，產品只有白蛋白制劑和免疫球蛋白制劑，其余的大部分寶貴成份都成了生產過程的廢料。
近年來，層析法被越來越廣泛地應用于生物制劑的純化制備。Curling等人1978年發表了應用離子交換層析(Ion-Exchange chromatography)分離白蛋白的方法。Suomela等人描述了小規模離子交換層析分離免疫球蛋白。將凝膠過濾(Gelfiltration，又稱分子篩層析)與離子交換及超濾技術相結合，用于大量血漿蛋白的分離是可行的。然而，雖然柱層析法制各的產品純度較高，能很好的保持蛋白質的天然性質而且產品收獲率也較高，但是生產成本偏高，生產效率低。
近年來，西方國家采用的瑞典Amershan Pharmacia Biotech和Pharmardule聯合發展的血液制品層析生產工藝PharmaFrac。該工藝利用了四步層析，白蛋白的產率為25g/L血漿，丙種球蛋白的產率為5g/L血漿。這個工藝雖然可以避免微量組份變性成為廢料，并可通過增加生產線生產其它產品(如九因子)，但這些工藝沒有減少生產步驟，沒有提高產品的產率，也沒有降低生產成本，因而市場競爭力并不強。
其它的方法還有鹽析法(硫酸銨鹽析)、利凡諾(Rivanol)沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、熱乙醇/PEG法等，由于各種因素，沒有在工業上得到廣泛采用。
因此，本領域迫切需要開發高效率、低成本、步驟簡便的大規模生產生產血液制品的方法和材料，尤其是用于同時生產白蛋白和丙種球蛋白的方法和材料。
本發明的一個目的是提供一類新的親和層析介質，該親和介質可與白蛋白高親和性的結合，因而用于免疫球蛋白的親和純化。
本發明的另一目的是提供這類親和層析介質的制備方法。
本發明的另一目的是提供一種低成本、高效率、步驟簡便的大規模生產人白蛋白和丙種球蛋白的親和技術工藝。
在本發明的第一方面，提供了一種親和層析介質，它包括固相載體以及偶聯在固相載體上的3-氨甲基吡啶親和配位體。
在本發明的第二方面，提供了一種分離純化白蛋白和丙種球蛋白的方法，它包括用親和層析柱對含白蛋白和丙種球蛋白的原料進行親和層析，從而使白蛋白固定于親和層析介質，而丙種球蛋白則隨流穿液流過親和層析柱；對固定于親和層析介質上的白蛋白進行洗脫，從而獲得純化的白蛋白；以及對含丙種球蛋白的該流穿液進行離子交換層析或疏水層析，從而獲得純化的丙種球蛋白。
較佳地，在親和層析中所用的親和層析介質包括固相載體以及偶聯在固相載體上的3-氨甲基吡啶親和配位體。
在一個優選例中，該方法還包括還包括步驟在進行親和層析之前，對含白蛋白和丙種球蛋白的原料進行換緩沖液(buffer-exchange)處理。
在本發明的一個優選例中，對含丙種球蛋白的該流穿液的進一步分離純化是通過離子交換層析進行，其中使用含DEAE-或S-基團的離子交換樹脂，從而吸附除丙種球蛋白之外的雜質。
本發明的發明點在于，發現了一種新穎的高親和力的白蛋白親和層析介質，并在此基礎上首次將白蛋白的親和層析和丙種球蛋白的分離純化結合在一起，形成了一種新的大規模生產白蛋白和丙種球蛋白的親和技術生產工藝。
該工藝的特點是低成本、高效率和步驟簡便。這種親和技術工藝，成本和生產效率可以與低溫乙醇法相當，產品的純度和質量與PharmaFrac層析工藝相當，但生產步驟減少一半，產品回收率提高20％以上。此外本發明的親和純化工藝具有生產快速、工藝穩定的特點，可以耐受醫藥生產中必需的現場在線清洗和消毒，方便地滿足GMP(Good Manufacturing Practice)標準。
親和層析，又稱為生物選擇性吸附層析，已經成為純化生物大分子活性物質不可缺少的分離技術。隨著對生物制品中活性成分的純度和需求量的增加，雜質含量的降低，傳統分離技術如凝膠過濾和離子交換層析技術再也不能滿足工業生產和學術研究的要求。
與其它方法相比，親和層析方法具有以下幾個明顯的特點。親和層析介質允許對生物分子選擇地吸附和解離，可以取得很高的純化倍數，常常為1000多倍。此外，蛋白在純化過程中不僅得到濃縮，當結合到親和配位體上時，蛋白的性質也更加穩定；其結果又提高了目標產品的活性回收率。因此，親和分離技術非常適用于處理體積大，濃度低的生物活性物質。
在大規模生產的純化工藝中，采用親和層析技術可以大大減少純化過程的步驟，從而減少了合格產品的生產時間和成本。當下游生產成本占總生產成本的80％時顯得更加重要。在純化過程的任何環節都可以使用親和層析技術，但采用的越早，獲得的經濟效益越大。J.Bonnerjea(Biotechnology,4,954-958,1986)對生物制品生產工藝調查的結果顯示，在所有被考察的工藝中，一步純化效果最佳的單元操作中，有45％是利用親和步驟獲得的。
親和分離介質的關鍵是親和配位體(也可稱為“親和配位體”)。親和配位體必須能夠選擇性地和可逆地吸附生物大分子。傳統的親和配位體為親和介質的成功使用奠定的基礎。然而，在工業生產中，天然的親和配位體，如抗體、輔酶、氨基酸、多肽、蛋白、凝集素，具有不可克服的缺點最突出的因素是成本昂貴，生物和化學性質不穩定，生產中難于維持結合活性，也不能經受在線清潔和消毒，因此，還可能被其它物質，如病毒和內毒素污染。
針對根據白蛋白的結構和性質，本發明人篩選發現了一種成本低，親和力高的親和配位體3-氨甲基吡啶。將該化合物固定于層析介質上后，不僅能夠提供高效的純化倍數、重復性的結果，而且配位體極少脫落。更適合工業化、大規模生產醫用和試劑用白蛋白。而且，原料在去除了白蛋白之后的殘液，主要含有丙種球蛋白和其他雜質。對丙種球蛋白進行進一步的分離純化(如離子交換層析或疏水層析)之后，就可獲得高純度的丙種球蛋白。
用于本發明的親和配位體3-氨甲基吡啶是一種已知的化合物，可用常規方法合成或購得。
可用于本發明的固相載體可以是親和層析領域中任何具有活性連接基團(如羥基、氨基、羧基、環氧基、鹵素等)的固相載體。本發明的新穎的親和層析配位體還可通過橋連分子而連接于常用的固相載體上。代表性的固相載體包括(但并不限于)葡聚糖凝膠如Sephadex，交聯的葡聚糖珠如PDX，烯丙基葡聚糖和N,N’-亞甲基雙(丙烯酰胺)的交聯共聚物如Sephacryl，瓊脂糖凝膠如Sepharose、Sepharose CL、Sepharose FF，瓊脂糖和葡聚糖的交聯共聚物如Superdex、高度交聯的瓊脂糖和葡聚糖如Superose,N-三[羥甲基]甲基丙烯酰胺和羥基化交聯接頭的共聚物珠如Trisacryl、Trisacryl plus，瓊脂糖珠如Ultrogel A，聚丙烯酰胺/瓊脂糖復合物珠如Ultrogel AcA，纖維素珠如高孔隙度的再生纖維素珠、涂有聚合物的硅膠，或它們的混合物。
將本發明的3-氨甲基吡啶偶聯于或固定于固相載體的方法可選用本領域常規的方法，這取決于所用的固相載體種類。例如用環氧氯丙烷作為交聯劑或馬來酸酐等進行偶聯。對固定化技術的一般綜述，可參見Turkova,J.(1993)“Bioaffinity Chromatography”,Elsevier Science,London,U.K。
在本發明的新工藝中，可用本發明方法分離純化的含白蛋白和丙種球蛋白的原料可以是任何含白蛋白和丙種球蛋白的原料，例如人血漿，動物血漿、基因工程表達產物、低溫乙醇生產工藝中含白蛋白和丙種球蛋白的中間產物(例如，上清Ⅰ、上清a、上清b、上清Ⅳ、上清C以及沉淀A(組份Ⅱ+Ⅲ)、沉淀B(組份Ⅲ)、沉淀GG(組份Ⅱ)、沉淀Ⅳ)(見Kistler and Nitschmann法工藝)。
首先將含白蛋白和抗體的原料作適當稀釋，例如配成1-12％(較佳地2-10％，最佳地4-8％)的溶液。
為了提高親和層析的效率，可以對含白蛋白和抗體的原料或其稀釋液進行換緩沖液處理。例如經過Sephadex G-25凝膠過濾層析柱，將緩沖液交換為結合緩沖液，如磷酸緩沖液(20mM,pH6.0)。
之后，對于經過換緩沖液處理之后的樣品，進行親和層析，從而獲得純化的白蛋白。具體地，白蛋白的親和層析可以包括上樣(吸附)、洗滌和洗脫步驟。此外，對于親和層析后的白蛋白洗脫液，還可陰離子交換、陽離子交換和凝膠過濾層析以及超濾等方法對白蛋白進行進一步純化。
在白蛋白的親和層析步驟中，一種結合條件是使用如下結合緩沖液緩沖液的鹽濃度為0.005-0.03M,pH5.0-9.0；更佳地，0.01-0.02M,pH5.5-7.0；最佳地，是5mM磷酸緩沖液(pH6.0)。
一種洗脫條件是使用如下的洗脫緩沖液緩沖液的鹽濃度為0.005-2.0M,pH2.0-5.0或9.5-11.0；較佳地，鹽濃度為0.01-0.50M,pH3.5-4.8；最佳地是15mM醋酸緩沖液(pH4.6)(如果需對白蛋白進行再純化，這樣就不必再換緩沖液)。
在親和層析同時，可收集上樣和洗滌過程中含丙種球蛋白和其他雜質的緩沖液，以用于丙種球蛋白的分離純化。
對于丙種球蛋白的分離純化，可選用離子交換層析、疏水層析和其他本領域常用于丙種球蛋白分離的方法。較佳地，選用離子交換層析，尤其是用含DEAE-或S-基團的離子交換樹脂(如DEAE-Sepharose、DEAE-Sepharose FF、S-Sepharose和S-Sepharose FF。)直接吸附除丙種球蛋白之外的雜質，從而直接從流穿液獲得純化的丙種球蛋白。在一種優選例中，是用DEAE-Sepharose FF進行離子交換層析，其中條件為pH為5.0-6.8，鹽濃度為1mM-50mM。
在本發明的一個具體優選例中，將原料用裝有層析介質AT23的親和層析柱，在磷酸緩沖液(20mM,pH6.0)的條件下吸附白蛋白。用足夠量的磷酸緩沖液(20mM,pH6.0)洗去未吸附的雜質后，再用醋酸溶液(15mM,pH4.6)專一洗脫白蛋白。從AT23的親和層析柱流穿的原料液，直接上到用磷酸緩沖液(20mM,pH6.0)平衡的DEAE-Sepharose FF離子交換柱上。原料液中的雜質被吸附，抗體直接流穿。這個工藝制備的白蛋白和抗體的半成品的純度為98％左右。高于中國藥典和美國藥典的標準。產品回收率在80％以上。
在說明書附圖中，

圖1顯示了化合物3-氨甲基吡啶的結構式。
圖2是用12％SDS-PAGE檢測親和層析后白蛋白的電泳圖。
圖3是用分子篩層析(Superose 12,1×30cm)測定白蛋白的流出峰結果。
圖4用10％SDS-PAGE檢測離子交換層析后丙種球蛋白的電泳圖。
圖5是用分子篩層析(Superose 12,1×30cm)測定丙種球蛋白的流出峰結果。
圖6是不同鹽濃度下AT23親和層析介質與白蛋白之間結合曲線圖。
圖7是不同pH下AT23親和層析介質與白蛋白之間結合曲線圖。
圖8是不同鹽濃度下從AT23親和層析介質上洗脫白蛋白的曲線圖。
圖9是不同鹽濃度下從AT23親和層析介質上洗脫白蛋白的曲線圖。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1制備親和層析介質AT23取化合物3-氨甲基吡啶(15g)，溶解于50ml Na2CO3(0.5M，pH11.0)，加入到盛環氧基Sepharose 6B(1000ml)的可密封瓶中，60℃搖振過夜。在停止之前，加入2ml的乙醇胺，保溫振蕩2小時。最后取出反應瓶中Sepharose 6B，經0.5M醋酸(1000ml)，0.1M NaOH(1000ml)和蒸餾水(1000ml×5)分別洗滌后，得到親和層析介質，命名為AT23，加入20％乙醇儲存待用。
實施例2制備親和層析介質AT24化合物3-氨甲基吡啶(20g)，溶解于50-400ml Na2CO3(0.2-0.8M,pH8.0-12.0)，加入到盛環氧基珠狀纖維素(又稱為纖維素珠)(1000ml左右)的可密封瓶中，40-60℃搖振過夜。在停止之前，加入1-10ml的乙醇胺，保溫振蕩2小時。最后取出反應瓶中珠狀纖維素，經0.5M醋酸(1000ml),0.1MNaOH(1000ml)和蒸餾水(1000ml×5)分別洗滌后，得到所需的纖維素基質的親和層析介質AT24，加入用20％乙醇儲存待用。
實施例3制備親和層析介質AT25將化合物3-氨甲基吡啶(18g)，溶解于50-400ml Na2CO3(0.2-0.8M,pH8.0-12.0)，加入到盛環氧基Trisacryl(1000ml左右)的可密封瓶中，40-60℃搖振過夜。在停止之前，加入1-10ml的乙醇胺，保溫振蕩2小時。最后取出反應瓶中Trisacryl，經0.5M醋酸(1000ml)，0.1M NaOH(1000ml)和蒸餾水(1000ml×5)分別洗滌后，得到所需的Trisacryl基質的親和層析介質AT25，加入用20％乙醇儲存待用。
實施例4(1)換緩沖液處理取500ml的冰凍的人血漿，于4℃融化，過濾除去沉淀。上樣到已經用磷酸緩沖液(20mM,pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱(25×40cm)上，繼續用磷酸緩沖液(20mM,pH6.0)洗脫。收集280nm的吸收峰，得到980ml樣品。放置約30分鐘以上，如該樣品有沉淀，則棄去沉淀。
(2)親和層析將實施例1制備的親和層析介質AT23(1000ml)，裝入層析柱(10×50cm)中。用4000ml磷酸緩沖液(5mM,pH6.0)平衡后，把已換為結合緩沖液的900ml人血漿樣品加到柱上。同時開始收集流穿液(含丙種球蛋白和其他雜質)。再用3000ml磷酸緩沖液(5mM,pH6.0)洗滌，去除未吸附的物質。同時繼續收集流穿液，直至用核酸蛋白檢測儀在280納米處檢測沒有蛋白流出為止，收集到流穿液共1500ml。
之后，用1500ml洗脫緩沖液(15mM醋酸緩沖液，pH4.6)洗脫被吸附的白蛋白，收集洗脫組份。用12％的SDS-PAGE檢測產品(圖2)，發現產品大小和含量與血漿中的白蛋白相同，產品的主要成份為白蛋白。用分子篩層析(Superose 12,1×30cm)測得(圖3)白蛋白的純度為98％以上。白蛋白的總回收率為(88％)。
(3)分離純化丙種球蛋白對應上述收集的親和柱AT23的流穿液(1500ml)，全部上到已經用磷酸緩沖液(5mM,pH6.0)平衡的DEAE-Sepharose FF柱(5×30cm)上，收集全部流穿液(含丙種球蛋白)。用10％的還原性SDS-PAGE檢測產品(圖4)，發現產品大小和含量與血漿中的抗體相同。用分子篩層析(Superose 12,1×30cm)測定(圖5)，得到抗體的純度為99％以上。抗體的總回收率為(90％)實施例5(1)換緩沖液處理將30g低溫乙醇工藝生產的中間產品(組份Ⅱ+Ⅲ)，于4℃溶解于500ml磷酸緩沖液(20mM,pH7.0)，過濾除去沉淀。上樣到已經用磷酸緩沖液(20mM,pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱(25×40cm)上，繼續用磷酸緩沖液(20mM,pH6.0)洗脫。收集280nm的吸收峰，得到1000ml樣品。
(2)親和層析親和層析介質AT23(1000ml)，裝入層析柱(10×50cm)中。用4000ml磷酸緩沖液(5mM,pH6.0)平衡后，把950ml經過Sephadex G-25柱的樣品加到柱上。用3000ml磷酸緩沖液(5mM,pH6.0)洗脫，去除未吸附的物質后，再用1500ml醋酸溶液(15mM,pH4.6)洗脫被吸附的白蛋白，收集洗脫組份。用12％的SDS-PAGE檢測產品，發現產品大小和含量與血漿中的白蛋白相同，產品的主要成份為白蛋白。用分子篩層析(Superose 12,1×30cm)測定，白蛋白的純度為98％以上。白蛋白的回收率為(80％)。
在親和層析過程中，如實施例4一樣收集含丙種球蛋白和其他雜質的流穿液。
(3)分離純化丙種球蛋白收集親和柱AT23的流穿液共1400ml，全部上到已經用磷酸緩沖液(5mM,pH6.0)平衡的DEAE-Sepharose FF柱(5×30cm)上，收集流穿液。用10％的還原性SDS-PAGE檢測產品，發現產品大小和含量與血漿中的抗體相同。用分子篩層析(Superose 12,1×30cm)測定得抗體的純度為98.5％以上。抗體的總回收率為(85％)實施例6(1)換緩沖液處理500ml的冰凍狗血漿，于4℃融化，過濾除去沉淀。上樣到已經用磷酸緩沖液(20mM,pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱(25×40cm)上，繼續用磷酸緩沖液(20mM,pH6.0)洗脫。收集280nm的吸收峰，得到900ml樣品。
(2)親和層析親和層析介質AT23(1000ml)，裝入層析柱(10×50cm)中。用4000ml磷酸緩沖液(5mM,pH6.0)平衡后，把900ml經過Sephadex G-25柱的狗血漿加到柱上。用3000ml磷酸緩沖液(5mM,pH6.0)洗脫，去除未吸附的物質后，再用1500ml醋酸溶液(0.1M AcH,pH4.6)洗脫被吸附的白蛋白，收集洗脫組份。用10％的SDS-PAGE檢測產品，發現產品大小和含量與血漿中的白蛋白相同，產品的主要成份為白蛋白。用分子篩層析(Superose 12,1×30cm)測定可以看出產品的流出峰是比較完美的正態分布。對峰面積積分可以算出，白蛋白的純度為97％以上。白蛋白的總回收率為(87％)。
在親和層析過程中，如實施例4一樣收集含丙種球蛋白和其他雜質的流穿液。
(3)分離純化丙種球蛋白收集親和柱AT23的流穿液共1300ml，全部上到已經用磷酸緩沖液(5mM,pH6.0)平衡的DEAE-Sepharose FF柱(5×30cm)上，收集流穿液。用10％的還原性SDS-PAGE檢測產品，發現產品大小和含量與血漿中的抗體相同。用分子篩層析(Superose 12,1×30cm)測定算抗體的純度為96％以上。抗體的總回收率為(90％)實施例7將親和層析介質AT24(1000ml)，裝入層析柱(10×50cm)中。用4000mlTris·HCl(5-100mM,pH5-9.0)平衡后，把人血漿(500ml，已經將緩沖液換為Tris·HCl(5-100mM,pH5-9.0)加到柱上。用3000ml Tris·HCl(5-100mM,pH5-9.0)洗去未吸附的物質后，再用1500ml醋酸溶液(15-200mM,pH2.4-5.0)洗脫被吸附的白蛋白，收集洗脫組份。用12％的SDS-PAGE檢測產品發現產品大小和含量與血漿中的白蛋白相同，產品的主要成份為白蛋白。用分子篩層析(Superose 12,1×30cm)測定表明，產品的流出峰是比較完美的正態分布。對峰面積積分可以算出，白蛋白的純度為99％以上(表1)。白蛋白的總回收率為(88％)。
表1
對于含丙種球蛋白和其他雜質的流穿液，按實施例6所述的方法處理。
實施例8在該實施例中，將實施例4中的獲得白蛋白洗脫液調節pH至pH4.8、離子強度0.05。再上到Q-Sepharose柱(5×20cm)，收集流穿液，白蛋白的回收率＞81％，純度為99.99％。
實施例9對親和層析中結合條件和洗脫條件的優化在該實施例中，分別對親和層析中結合條件和洗脫條件(鹽濃度和pH值)進行優化。選用實施例1制備AT23親和層析介質，在中性條件下進行結合條件的鹽濃度優化→在緩沖液電導率不變情況下進行結合酸堿度條件優化→在緩沖液電導率不變情況下進行洗脫酸堿度條件優化→在緩沖液電導率不變情況下進行洗脫鹽濃度條件優化。
結果如圖7-9所示，在白蛋白的結合的鹽濃度為0.005-0.03M，更佳地0.01-0.02M(圖6)，pH條件為pH5.0-9.0更佳地pH5.5-7.0(圖7)。
洗脫條件是洗脫緩沖液的鹽濃度為0.005-2.0M，較佳地，鹽濃度為0.01-0.50M(圖8)。pH條件為pH2.0-5.0或pH9.5-11.0(圖9)，較佳地，pH3.5-4.8。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1．一種親和層析介質，其特征在于，它包括固相載體以及偶聯在固相載體上的3-氨甲基吡啶親和配位體。
2．如權利要求1所述的親和層析介質，其特征在于，所述的固相載體選自葡聚糖凝膠、交聯的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N,N’-亞甲基雙(丙烯酰胺)的交聯共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖和葡聚糖的交聯共聚物、高度交聯的瓊脂糖和葡聚糖、N-三[羥甲基]甲基丙烯酰胺和羥基化交聯接頭的共聚物珠、瓊脂糖珠、聚丙烯酰胺/瓊脂糖復合物珠、纖維素珠、和涂有聚合物的硅膠。
3．如權利要求1所述的親和層析介質，其特征在于，所述的固相載體選自Sephadex、PDX、Sephacryl、Sepharose、Sepharose CL、Sepharose FF、Superdex、Superose、Trisacryl、Trisacryl plus、Ultrogel A、UltrogelAcA、高孔隙度的再生纖維素珠。
4．一種分離純化白蛋白和丙種球蛋白的方法，其特征在于，它包括用親和層析柱對含白蛋白和丙種球蛋白的原料進行親和層析，從而使白蛋白固定于親和層析介質，而丙種球蛋白則隨流穿液流過親和層析柱；對固定于親和層析介質上的白蛋白進行洗脫，從而獲得純化的白蛋白；以及對含丙種球蛋白的該流穿液進行離子交換層析或疏水層析，從而獲得純化的丙種球蛋白。
5．如權利要求4所述的方法，其特征在于，親和層析中所用的親和層析介質包括固相載體以及偶聯在固相載體上的3-氨甲基吡啶親和配位體。
6．如權利要求4所述的方法，其特征在于，還包括步驟在進行親和層析之前，對含白蛋白和丙種球蛋白的原料進行換緩沖液處理，從而使緩沖液的鹽濃度為0.005-0.03M且pH為5.0-9.0。
7．如權利要求4所述的方法，其特征在于，對含丙種球蛋白的該流穿液進行離子交換層析，使用含DEAE-或S-基團的離子交換樹脂，從而吸附除丙種球蛋白之外的雜質。
8．如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的離子交換樹脂選自下組DEAE-Sepharose、DEAE-Sepharose FF、S-Sepharose和S-Sepharose FF。
9．如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的含白蛋白和丙種球蛋白的原料選自下組人血漿、動物血漿、低溫乙醇生產工藝的含白蛋白和丙種球蛋白的中間產物。
10．如權利要求4所述的方法，其特征在于，親和層析中所用的親和層析介質包括固相載體以及偶聯在固相載體上的3-氨甲基吡啶親和配位體；而且在進行親和層析之前，對含白蛋白和丙種球蛋白的原料進行換緩沖液處理，從而使緩沖液的鹽濃度為0.005-0.03M且pH為5.0-9.0；而且對結合的白蛋白進行洗脫時，所用的條件是0.005-2.0M的鹽，pH2.0-5.0或9.5-11.0的緩沖液。
全文摘要
本發明公開了一種同時生產白蛋白和抗體(丙種球蛋白)的生產工藝,包括將原料先用親和技術分離出白蛋白,然后用離子交換層析或疏水層析精制出抗體(丙種球蛋白),即可得到高純度的白蛋白和丙種球蛋白的試劑級和醫用級產品。本發明還公開了用于此工藝的新穎的親和層析介質。
文檔編號C07K1/00GK1296951SQ9912406
公開日2001年5月30日 申請日期1999年11月22日 優先權日1999年11月22日
發明者李榮秀, 王繼武, 肖齊世, 陳冬星 申請人:上海中路生物工程有限公司