一種腫瘤雙靶向的雙模式光學成像探針及其制備與應用
【專利摘要】本發明公開了一種具有腫瘤雙靶向功能的SERS?熒光雙模式光學成像探針的制備和應用。所述納米探針由成像功能核心及靶向功能外殼兩部分構成。成像功能核心部分包括吸附拉曼報告分子的銀納米粒子，以及摻雜熒光染料的二氧化硅殼層，使該探針同時具有SERS與熒光的雙模式成像的功能。靶向功能外殼包含聚乙二醇(PEG)偶聯劑及兩種特異性靶向腫瘤細胞的多肽。本發明的探針采用雙多肽修飾的方法，賦予了納米粒子更有效的靶向能力，能使探針更多的進入腫瘤細胞，增強探針對腫瘤細胞的識別，實現對腫瘤的SERS?熒光雙模式成像。
【專利說明】
一種腫瘤雙靶向的雙模式光學成像探針及其制備與應用
技術領域
[0001 ]本發明屬于生物分析化學技術領域，具體涉及一種腫瘤雙靶向的SERS-熒光雙模 式光學成像探針及其制備與應用。
【背景技術】
[0002] 納米科技在腫瘤診斷治療中應用前景十分廣泛。具有定向識別和殺死腫瘤細胞功 能的納米藥物載體和成像造影劑一直是納米科技研究的一大方向。怎樣較好的使納米顆粒 盡可能的富集在腫瘤細胞中，從而減少對正常細胞的傷害，是科學家們不懈努力的目標。納 米粒子的靶向分為被動靶向和主動靶向，被動靶向是指利用實體瘤血管的EPR效應，使小于 200nm的納米載體從腫瘤血管縫隙中漏出，被動的在腫瘤中富集停留；主動靶向則依賴于癌 細胞與健康細胞間的本征差異，例如，相比于正常細胞，腫瘤細胞表面會高表達一些蛋白質 或多糖，納米粒子通過修飾能與其特異性結合的抗體、多肽、核酸適配體等，實現定向識別 腫瘤細胞。
[0003] 在主動靶向的研究和應用中，普遍采用的是將一種靶點結合分子修飾在納米粒子 的表面。然而，由于腫瘤自身的復雜性和個體差異性，腫瘤細胞表面普遍存在多種受體的表 達上調，且受體并非均勻分布在膜表面，這使得僅對一種腫瘤表面過表達的受體進行識別 效果并不理想，靶向納米粒子仍然存在錯誤識別的情況，且納米粒子被腫瘤識別內吞的效 率也存在局限。因此，若能將一種以上的靶點結合分子集成在一個納米粒子上，增加其對腫 瘤的識別能力和親和性，或是一種提升納米粒子靶向能力的方法。
[0004] 在腫瘤的成像造影方法中，集合多模式的成像納米粒子能較好的克服單一成像方 法的缺陷，提升腫瘤成像的識別能力與定量精度。在眾多光學成像方式中，熒光是一種常用 的癌癥成像手段。盡管熒光成像快速直觀，但由于其較寬的光譜帶寬，使得熒光多元成像受 到極大局限。而表面增強拉曼散射（surface enhanced Raman scattering，SERS)技術，是 一種近年來備受矚目的新型檢測與成像技術。由于SERS信號具有高強度、高靈敏、光譜窄等 優點，使其在多元檢測方面有較高優勢。而SERS-熒光雙模式納米探針通過結合兩種成像分 子與一體，擴展了成像探針的功能，豐富了其光譜信息，賦予了探針更優的編碼能力。

【發明內容】

[0005] 發明目的：為了克服現有技術中存在的不足，本發明提供一種腫瘤雙靶向的SERS-熒光雙模式光學成像探針及其制備與應用，結合了 SERS-熒光雙模信息，同時修飾兩種與腫 瘤特異性識別的多肽，增強其對腫瘤細胞的識別能力和靶向效率。并且本發明提供一種該 雙模式光學成像探針的制備方法，簡便有效。
[0006] 技術方案:為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：
[0007] -種腫瘤雙靶向的雙模式光學成像探針，由成像功能核心和靶向功能外殼兩部分 組成；
[0008] 所述成像功能核心包括連接拉曼報告分子的銀納米粒子，外部包裹著摻雜熒光染 料的二氧化娃殼層；
[0009] 所述靶向功能外殼為兩種特異性靶向多肽；
[0010] 所述成像功能核心和祀向功能外殼通過偶聯劑連接而成。
[0011] 成像功能核心以銀納米粒子作為SERS信號增強基底，其上共價連接拉曼報告分子 提供SERS信號，摻雜熒光染料的二氧化硅殼層集合，使其具備SERS與熒光雙模式成像功能。 靶向功能外殼部分包括起到連接作用的異種雙功能偶聯劑活性酯聚乙二醇馬來酰亞胺 (NHS-PEG2000-MAL)，及半胱氨酸修飾的兩種特異性靶向多肽c(RGDyC)和cys-HAIYPRH。而 兩種特異性靶向多肽使得探針同時靶向腫瘤細胞表面兩種高表達受體的能力。
[0012] 進一步的，所述成像功能核心為核殼結構，由內核層、阻隔層、外殼層構成，所述內 核層為連接拉曼報告分子的銀納米粒子，所述阻隔層為純二氧化硅層，所述外殼層為摻雜 熒光染料的二氧化硅層，所述外殼層表面修飾氨基。內核層以銀納米粒子作為SERS信號增 強基底，其上共價連接拉曼報告分子提供SERS信號;阻隔層分隔熒光分子與金屬，防止熒光 淬滅;外殼層提供熒光信號，同時為進一步修飾靶向多肽分子提供方便。
[0013] 進一步的，所述特異性靶向多肽為半胱氨酸修飾的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸環肽 c(RGDyC)和組氨酸-丙氨酸-異亮氨酸-酪氨酸-脯氨酸-精氨酸-組氨酸七肽cys-HAIYPRH， 分別靶向Hela細胞表面過表達的整合素 ανβ3和轉鐵蛋白受體。
[0014]進一步的，所述偶聯劑為異種雙功能偶聯劑活性酯聚乙二醇馬來酰亞胺。
[0015] -種腫瘤雙靶向的雙模式光學成像探針的制備方法，包括以下步驟：
[0016] 1)制備成像功能核心
[0017] 1-1)將制備好的銀納米粒子溶液離心分散于酒精溶液中，再加入拉曼報告分子與 銀納米粒子共價連接l-4h;
[0018] 1-2)外部包裹一層純二氧化硅殼層，作為阻隔層；
[0019] 1-3)阻隔層上再包裹一層摻雜熒光染料的二氧化硅層，作為外殼層；
[0020] 2)成像功能核心氨基化
[0021]將步驟1)制備好的成像功能核心離心洗滌分散于酒精中，加入3-氨丙基三乙氧基 硅烷(APTES)和水對其進行氨基化，40°C水浴超聲2h以上；目的是對納米探針表面氨基化處 理；
[0022] 3)偶聯靶向功能外殼
[0023]將步驟2)所得氨基化的成像功能核心離心洗滌分散于水中，用偶聯劑將其表面的 氨基與兩種特異性靶向多肽的巰基橋連起來，反應產物即為所述腫瘤雙靶向的雙模式光學 成像探針。
[0024] 進一步的，步驟2)中所述酒精、3-氨丙基三乙氧基硅烷和水的體積比為50:1:1。 [0025]進一步的，步驟3)具體方法為:所述銀納米粒子與偶聯劑置于室溫反應lh，離心洗 滌后溶于水中，加入所述的兩種特異性靶向多肽的混合液，所述偶聯劑將氨基與兩種特異 性靶向多肽的巰基橋連起來；
[0026]其中，所述銀納米粒子與偶聯劑的濃度比例為1:1000到1:5000,所述兩種特異性 靶向多肽混合修飾比例為摩爾比1:1，所述銀納米粒子與兩種特異性靶向多肽的濃度比為 1:1000到1:10000。
[0027]進一步的，所述熒光染料為異硫氰基羅丹明B染料，通過硅烷水解縮合反應摻雜在 二氧化硅殼層中；
[0028] 所述阻隔層的制備方法為:加入200yL氨水與5yL四乙氧基硅烷溶液，室溫攪拌4小 時以上；
[0029] 所述外殼層的制備方法為：加入200yL氨水、5yL lmg/mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷 處理過的異硫氰基羅丹明B酒精溶液、5yL四乙氧基硅烷溶液，室溫避光攪拌4小時。目的是 在阻隔層上再包裹一層摻雜熒光染料的二氧化硅層。
[0030] 一種腫瘤雙靶向的雙模式光學成像探針在腫瘤細胞的雙模成像中的應用。
[0031] 有益效果：與現有技術相比，本發明的雙靶向雙模式光學探針及其制備具有以下 優點：
[0032] 1、本發明結合兩種多肽對于腫瘤細胞的特異性識別能力，與傳統單一靶向探針相 比，增強了探針對腫瘤細胞的靶向識別和效率，提高了腫瘤細胞對探針的內吞。
[0033] 2、本發明的雙模式光學成像探針同時具有熒光信號和表面增強拉曼散射信號，靈 敏度高，能夠通過該換標記報告分子實現多元編碼的擴展功能，在腫瘤靶向成像方面具有 重要的應用價值。
【附圖說明】
[0034] 圖1為本發明提出的雙靶向雙模式探針及其制備方法示意圖；
[0035] 圖2是實施例1雙靶向雙模式探針的吸收光譜圖；
[0036] 圖3是實施例1雙靶向雙模式探針的熒光光譜；
[0037] 圖4是實施例1雙靶向雙模式探針的SERS光譜；
[0038]圖5是實施例2雙靶向雙模式探針在HeLa細胞內的熒光圖像；
[0039]圖6是實施例2雙靶向雙模式探針在He La細胞內的SERS圖像；
[0040]圖7是實施例3雙靶向探針和單靶向探針被HeLa細胞內吞的熒光與SERS成像比較 圖。
【具體實施方式】
[0041] 下面結合附圖對本發明作更進一步的說明。
[0042] 如圖1所示為一種雙靶向SERS-熒光雙模式探針及其制備方法示意圖，每個銀納米 粒子包括成像功能核心及靶向功能外殼兩部分，且探針具備同時靶向腫瘤細胞表面兩種高 表達受體的能力。
[0043] 成像功能核心由內核層、阻隔層、外殼層構成，其中內核層為均勻球狀銀納米粒 子，采用種子生長法制備，拉曼報告分子與銀納米球通過銀-硫鍵共價結合；中間層及外殼 層采用改進的Stdber法制備。靶向功能外殼包含聚乙二醇(PEG)偶聯劑及兩種特異性靶向腫 瘤細胞的多肽。
[0044] 實施例1
[0045] 制備對宮頸癌細胞(HeLa)具有增強靶向效果的雙模式探針，其制備方法如下：
[0046] 1)實驗采用種子生長法制備均勻球狀銀納米粒子溶液。在劇烈攪拌下，將5mLl % 濃度的檸檬酸鈉水溶液加入沸騰的245mL硝酸銀溶液(含90mg硝酸銀）中，持續攪拌一小時 得到銀膠溶液。取10mL銀膠溶液離心分散于酒精溶液中，加入lOuLlOmM拉曼報告分子4MBA， 混合攪拌1-4小時，觀察溶液顏色是否變化以防止聚集發生；
[0047] 2)在步驟1的溶液中加入200yL氨水，5yL四乙氧基硅烷溶液，室溫攪拌4小時以上， 觀察溶液變為土黃色；
[0048] 3)在步驟2的溶液中再加入200Λ氨水，5yL lmg/mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷處理 過的異硫氰基羅丹明B酒精溶液，5yL四乙氧基硅烷溶液，室溫避光攪拌4小時；
[0049] 4)將步驟3的溶液離心洗滌分散于酒精中后，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES) 和水對粒子氨基化，其中酒精、APTES和水的體積比為50:1:1，40 °C水浴超聲2h以上，使納米 探針表面修飾上氨基，以便進一步實施表面修飾；
[0050] 5)將步驟4的溶液離心洗滌多次，分散于去離子水中，取lmL溶液，加25yL 1 Omg/mL 異種雙功能偶聯劑NHS-PEG2000-MAL，搖床攪拌1小時。離心處理后分散在lmL水中，同時加 入15yL和25yLlmg/mL的靶向多肽c(RGDyC)和cys-HAIYPRH，搖床低速攪拌lh。離心后重新分 散于lmL水中。反應產物即為所述雙靶向雙模式光學探針。
[0051] 圖1所示為靶向探針的制備過程示意圖。圖2顯示的是制備好的探針吸收光譜圖。 通過熒光光譜儀測量該雙靶向雙模式光學成像探針的熒光光譜，結果如圖3所示，激發波長 為540nm。將探針滴于玻璃片干燥，共聚焦拉曼光譜儀用633nm氬離子激光器激發，收集探針 的SERS信號如圖4所示。
[0052] 實施例2
[0053]進一步，雙靶向雙模式熒光探針用于宮頸癌細胞HeLa的雙模成像中，具體方法如 下：
[0054] 1)將宮頸癌細胞接種于培養皿中，加入含10%胎牛血清和1 %青霉素-鏈霉素混合 液的MEM細胞培養基，置于培養箱中37°C，5 %C02環境下培養24小時。之后，以培養液與探針 比例4:1加入探針，混合均勻后重新置于培養箱中兩小時。待粒子被細胞內化之后，去除培 養液，用PBS沖洗細胞3次，4%多聚甲醛固定10分鐘，PBS清洗2次待用。
[0055] 2)加入少量緩沖液于步驟1所得固定細胞中，調節焦平面聚焦，選擇一個細胞區 域，以543nm激光激發，560nm-600nm為接受波長范圍，成像獲得細胞熒光圖像，如圖5所示。 在將激發波長換為633納米，接受波長范圍調制670nm-710nm，積分時間1分鐘，得到細胞的 SERS成像圖，如圖6所示。
[0056] 可見，該探針具有很好的生物兼容性，能被HeLa細胞較好的吞，同時在細胞內部 依然保持了良好的SERS和熒光信號，可適用于生物成像領域。
[0057] 實施例3
[0058] 進一步的，為了說明該雙靶向探針的靶向能力優于傳統單靶向探針，實施以下實 驗驗證其靶向能力：
[0059] 1)依照實施例1中步驟制備單靶向探針，唯一區別在于最后一步中，溶液只加入與 雙靶向探針制備同等濃度的一種多肽，此處以選擇cys-HAIYPRH為例。
[0060] 2)將宮頸癌細胞同濃度接種于兩個培養皿中，加入含10%胎牛血清和1 %青霉素-鏈霉素混合液的MEM細胞培養基，置于培養箱中37°C，5%C02環境下培養24小時。之后，以培 養液與探針比例4:1分別加入兩種探針，混合均勻后重新置于培養箱中兩小時。待粒子被細 胞內化之后，去除培養液，用PBS沖洗細胞3次，4%多聚甲醛固定10分鐘，PBS清洗2次待用。
[0061] 3)加入少量緩沖液于步驟2所得固定細胞中，調節焦平面聚焦，選擇一個細胞區 域，以543nm激光激發，560nm-600nm為接受波長范圍，成像獲得細胞熒光圖像。在將激發波 長換為633納米，接受波長范圍調制670nm-710nm，積分時間1分鐘，得到細胞的SERS成像圖。 再以同樣的SERS、熒光成像參數對對照組進行成像。對比成像結果如圖7所示。
[0062] 從SERS熒光雙模式的成像對比中可以看到，雙靶向的納米粒子相較于單靶向具有 更好的腫瘤細胞內吞效率和能力。
[0063] 以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出：對于本技術領域的普通技術人 員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應 視為本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種腫瘤雙靶向的雙模式光學成像探針，其特征在于：由成像功能核心和靶向功能 外殼兩部分組成； 所述成像功能核心包括連接拉曼報告分子的銀納米粒子，外部包裹著摻雜熒光染料的 二氧化娃殼層； 所述靶向功能外殼為兩種特異性靶向多肽； 所述成像功能核心和祀向功能外殼通過偶聯劑連接而成。2. 根據權利要求1所述的腫瘤雙靶向的雙模式光學成像探針，其特征在于:所述成像功 能核心為核殼結構，由內核層、阻隔層、外殼層構成，所述內核層為連接拉曼報告分子的銀 納米粒子，所述阻隔層為純二氧化硅層，所述外殼層為摻雜熒光染料的二氧化硅層，所述外 殼層表面修飾氨基。3. 根據權利要求1所述的腫瘤雙靶向的雙模式光學成像探針，其特征在于:所述特異性 靶向多肽為半胱氨酸修飾的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸環肽和組氨酸-丙氨酸-異亮氨酸-酪 氨酸-脯氨酸-精氨酸-組氨酸七肽，分別靶向Hela細胞表面過表達的整合素 ανβ3和轉鐵蛋 白受體。4. 根據權利要求1所述的腫瘤雙靶向的雙模式光學成像探針，其特征在于:所述偶聯劑 為異種雙功能偶聯劑活性酯聚乙二醇馬來酰亞胺。5. -種腫瘤雙靶向的雙模式光學成像探針的制備方法，其特征在于:包括以下步驟： 1) 制備成像功能核心 1-1)將制備好的銀納米粒子溶液離心分散于酒精溶液中，再加入拉曼報告分子與銀納 米粒子共價連接l_4h; 1-2)外部包裹一層純二氧化硅殼層，作為阻隔層； 1-3)阻隔層上再包裹一層摻雜熒光染料的二氧化硅層，作為外殼層； 2) 成像功能核心氨基化 將步驟1)制備好的成像功能核心離心洗滌分散于酒精中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷 和水對其進行氨基化，40°C水浴超聲2h以上； 3) 偶聯靶向功能外殼 將步驟2)所得氨基化的成像功能核心離心洗滌分散于水中，用偶聯劑將其表面的氨基 與兩種特異性靶向多肽的巰基橋連起來，反應產物即為所述腫瘤雙靶向的雙模式光學成像 探針。6. 根據權利要求5所述的腫瘤雙靶向的雙模式光學成像探針的制備方法，其特征在于： 步驟2)中所述酒精、3-氨丙基三乙氧基硅烷和水的體積比為50:1:1。7. 根據權利要求5所述的腫瘤雙靶向的雙模式光學成像探針的制備方法，其特征在于： 步驟3)具體方法為:所述銀納米粒子與偶聯劑置于室溫反應lh，離心洗滌后溶于水中，加入 所述的兩種特異性靶向多肽的混合液，所述偶聯劑將氨基與兩種特異性靶向多肽的巰基橋 連起來； 其中，所述銀納米粒子與偶聯劑的濃度比例為1:1000到1:5000,所述兩種特異性靶向 多肽混合修飾比例為摩爾比1:1，所述銀納米粒子與兩種特異性靶向多肽的濃度比為1: 1000到1:10000。8. 根據權利要求5所述的腫瘤雙靶向的雙模式光學成像探針，其特征在于:所述熒光染 料為異硫氰基羅丹明B染料，通過硅烷水解縮合反應摻雜在二氧化硅殼層中； 所述阻隔層的制備方法為:加入200yL氨水與5yL四乙氧基硅烷溶液，室溫攪拌4小時以 上； 所述外殼層的制備方法為：加入200yL氨水、5yL lmg/mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷處理 過的異硫氰基羅丹明B酒精溶液、5yL四乙氧基硅烷溶液，室溫避光攪拌4小時。9. 一種腫瘤雙靶向的雙模式光學成像探針在腫瘤細胞的雙模成像中的應用。
【文檔編號】A61K49/00GK105833296SQ201610321525
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月16日
【發明人】王著元, 張益之, 伍磊, 宗慎飛, 崔平, 崔一平
【申請人】東南大學