一種高純度萊氏野村菌酵母型細胞的培養方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及殺蟲真菌細胞領域，具體說是一種高純度萊氏野村菌酵母型細胞的培養方法O
【背景技術】
[0002]萊氏野村菌作為蟲生真菌成為生物防治領域理論研究和生產應用的熱點，萊氏野村菌在固體培養基表面出現兩型生長現象，即由酵母型細胞狀態向菌絲生長狀態轉換，一方面，萊氏野村菌酵母型細胞類似蟲體內的蟲菌體，在液體發酵中產生的芽生孢子生長迅速，適用于大規模的工業生產;另一方面，在邵長文研究開發的ATMT系統中酵母型細胞作為受體細胞，因此無論是工業生產或實驗室研究，都給萊氏野村菌酵母型細胞的培養提出了現實需求。
[0003]目前，萊氏野村菌酵母型細胞的獲得方法有兩種:一是用接種器在固體培養基表面劃線制備，這種方法制備量小，對分生孢子的分散效果不佳，這是由于萊氏野村菌由酵母型細胞向菌絲型的轉換受群體密度的影響，往往只能在劃線的末端區域會出現酵母型細胞菌落，而且所得的酵母型細胞的純度不高，在顯微鏡視野內有大量菌絲體，需要多次轉接純化才能得到高純度的酵母型細胞;第二種是采用制備分生孢子懸浮液的方法，這種方法雖然孢子的分散效果較好，但是很容易污染，并且酵母型菌落長出時邊界不明顯，不便于確定刮取酵母型細胞的時間，因此探索獲得高純度萊氏野村菌酵母型細胞的培養方法亟需研究。
【發明內容】
[0004]為解決上述問題，本發明的目的是提供一種高純度萊氏野村菌酵母型細胞的培養方法。
[0005]本發明為實現上述目的，通過以下技術方案實現:
一種高純度萊氏野村菌酵母型細胞的培養方法，包括以下步驟:
①將麥芽糖，蛋白胨和酵母膏加入到蒸餾水中溶解，然后加入瓊脂粉攪拌均勻，得到混合液，將混合液在120?125°C下滅菌20?30分鐘，然后均勻倒在平板上至2?3毫米的厚度，冷卻后得到培養基;所述麥芽糖、蛋白胨、酵母膏、瓊脂粉和蒸餾水的重量體積比為2?5g:0.8?3g: 0.8?3g:0.8?I.5g:90?95ml；
②用滅菌的接種器蘸取萊氏野村菌分生孢子，置于步驟①得到的培養基表面上方5?7厘米處，敲擊接種器，將萊氏野村菌分生孢子均勻撒在步驟①得到的培養基上，得到萊氏野村菌分生孢子接種的培養基，所述萊氏野村菌分生孢子接種培養基的分布密度為0.5?3個/cm2 ；
③將步驟②所得萊氏野村菌分生孢子接種的培養基置于溫度24?30°C，濕度為75?90%的光照環境中，96?120小時后在培養基表面得到半透明液滴狀的萊氏野村菌酵母型細胞；
④用滅菌的工具刮取步驟③所得的萊氏野村菌酵母型細胞至步驟①所得的培養基表面，用涂布器涂布均勻，置于溫度24?30°C，濕度為75?90%的光照環境中，18?24小時后得到5?10倍接種量的高純度萊氏野生菌酵母型細胞。
[0006]優選的高純度萊氏野村菌酵母型細胞的培養方法，步驟①為將麥芽糖，蛋白胨和酵母膏加入到蒸餾水中溶解，然后加入瓊脂粉攪拌均勻，得到混合液，將混合液在121°C下滅菌25分鐘，然后均勻倒在平板上至2.5毫米的厚度，冷卻后得到培養基;所述麥芽糖、蛋白胨、酵母膏、瓊脂粉和蒸饋水的重量體積比為4g:lg:lg:lg: 93ml。
[0007]優選的高純度萊氏野村菌酵母型細胞的培養方法，所述接種器為接種環、接種針或玻璃棒。
[0008]優選的高純度萊氏野村菌酵母型細胞的培養方法，涂布器為不銹鋼筷子或頂端燒圓的玻璃棒。
[0009]優選的高純度萊氏野村菌酵母型細胞的培養方法，工具為平頭鑷子。
[0010]優選的高純度萊氏野村菌酵母型細胞的培養方法，步驟②中萊氏野村菌分生孢子接種培養基的分布密度為2個/cm2。
[0011]優選的高純度萊氏野村菌酵母型細胞的培養方法，將步驟②所得萊氏野村菌分生孢子接種培養基置于溫度26°C，濕度為80%的光照環境中，96小時后在培養基表面得到半透明液滴狀的萊氏野村菌酵母型細胞。
[0012]進一步優選的高純度萊氏野村菌酵母型細胞的培養方法，包括以下步驟:
①將麥芽糖，蛋白胨和酵母膏加入到蒸餾水中溶解，然后加入瓊脂粉攪拌均勻，得到混合液，將混合液在121°C下滅菌25分鐘，然后均勻倒在平板上至2.5毫米的厚度，冷卻后得到培養基;所述麥芽糖、蛋白胨、酵母膏、瓊脂粉和蒸饋水的重量體積比為4g:lg:lg:lg: 93ml ；
②用滅菌的接種環蘸取萊氏野村菌分生孢子，置于步驟①得到的培養基表面上方6厘米處，敲擊接種環，將萊氏野村菌分生孢子撒在步驟①得到的培養基上，得到萊氏野村菌分生孢子接種的培養基，所述萊氏野村菌分生孢子接種培養基的分布密度為2個/cm2;
③將步驟②所得萊氏野村菌分生孢子接種的培養基置于溫度26°C，濕度為80%的光照環境中，96小時后在培養基表面得到半透明液滴狀的萊氏野村菌酵母型細胞；
④用滅菌的平頭鑷子輕輕刮取步驟③所得的萊氏野村菌酵母型細胞至步驟①所得的培養基表面，用不銹鋼筷子涂布均勻，置于溫度26°C，濕度為80%的光照環境中，18小時后得到10倍接種量的高純度萊氏野生菌酵母型細胞。
[0013]本發明相比現有技術具有以下優點:
本發明的高純度萊氏野村菌酵母型細胞的培養方法，酵母型細胞的生長期持續時間長，酵母型細胞向菌絲狀態轉換的時間相應的延遲，因而可以提高酵母型細胞的產量，并且在顯微鏡鏡檢中檢測不到菌絲體，純度高;本發明的高純度萊氏野村菌酵母型細胞的培養方法，由于瓊脂的加入量適中，延長了酵母型細胞的生長期，解決了現有技術中培養基表面硬度低，酵母型細胞不易刮取的問題;本發明的高純度萊氏野村菌酵母型細胞的培養方法，孢子的分散效果好，生長出的各個菌落相對獨立，邊界明顯，容易確定酵母型細胞的刮取時間，從而能得到高純度的萊氏野村菌酵母型細胞;采用本發明方法所得的高純度萊氏野村菌酵母型細胞可在新制備的培養基進行轉接和擴大培養，以獲得足量高純度萊氏野村菌酵母型細胞，為實驗室研究和大規模的工業生產提供原料保障。
【附圖說明】
[0014]圖1為培養基表面萊氏野村菌產生大量分生孢子的照片；
圖2為長出酵母型細胞的菌落圖片；
圖3為400倍顯微鏡下酵母型細胞的圖片；
圖4為轉接擴大培養的萊氏野村菌酵母型細胞菌落照片。
【具體實施方式】
[0015]本發明的目的是提供一種高純度萊氏野村菌酵母型細胞的培養方法，通過以下技術方案實現:
一種高純度萊氏野村菌酵母型細胞的培養方法，包括以下步驟:
①將麥芽糖，蛋白胨和酵母膏加入到蒸餾水中溶解，然后加入瓊脂粉攪拌均勻，得到混合液，將混合液在120?125°C下滅菌20?30分鐘，然后均勻倒在平板上至2?3毫米的厚度，冷卻后得到培養基;所述麥芽糖、蛋白胨、酵母膏、瓊脂粉和蒸餾水的重量體積比為2?5g:0.8?3g: 0.8?3g:0.8?I.5g:90?95ml；
②用滅菌的接種器蘸取萊氏野村菌分生孢子，置于步驟①得到的培養基表面上方5?7厘米處，敲擊接種器，將萊氏野村菌分生孢子均勻撒在步驟①得到的培養基上，得到萊氏野村菌分生孢子接種的培養基，所述萊氏野村菌分生孢子接種培養基的分布密度為0.5?3個/cm2 ；
③將步驟②所得萊氏野村菌分生孢子接種的培養基置于溫度24?30°C，濕度為75?90%的光照環境中，96?120小時后在培養基表面得到半透明液滴狀的萊氏野村菌酵母型細胞；
④用滅菌的工具刮取步驟③所得的萊氏野村菌酵母型細胞至步驟①所得的培養基表面，用涂布器涂布均勻，置于溫度24?30°C，濕度為75?90%的光照環境中，18?24小時后得到5?10倍接種量的高純度萊氏野生菌酵母型細胞。
[0016]優選的高純度萊氏野村菌酵母型細胞的培養方法，步驟①為將麥芽糖，蛋白胨和酵母膏加入到蒸餾水中溶解，然后加入瓊脂粉攪拌均勻，得到混合液，將混合液在121°C下滅菌25分鐘，然后均勻倒在平板上至2.5毫米的厚度，冷卻后得到培養基;所述麥芽糖、蛋白胨、酵母膏、瓊脂粉和蒸饋水的重量體積比為4g:lg:lg:lg: 93ml。
[0017]優選的高純度萊氏野村菌酵母型細胞的培養方法，所述接種器為接種環、接種針或玻璃棒。
[0018]優選的高純度萊氏野村菌酵母型細胞的培養方法，涂布器為不銹鋼筷子或頂端燒圓的玻璃棒。
[0019]優選的高純度萊氏野村菌酵母型細胞的培養方法，工具為平頭鑷子。
[0020]優選的高純度萊氏野村菌酵母型細胞的培養方法，步驟②中萊氏野村菌分生孢子接種培養基的分布密度為2個/cm2。
[0021]優選的高純度萊氏野村菌酵母型細胞的培養方法，將步驟②所得萊氏野村菌分生孢子接種培養基置于溫度26°C，濕度為80%的光照環境中，96小時后在培養基表面得到半透明液滴狀的萊氏野村菌酵母型細胞。
[0022]進一步優選的高純度萊氏野村菌酵母型細胞的培養方法，包括以下步驟: ①將麥芽糖，蛋白胨和酵母膏加入到蒸餾水中溶解，然后加入瓊脂粉攪拌均勻，得到混合液，將混合液在121°C下滅菌25分鐘，然后均勻倒在平板上至2.5毫米的厚度，冷卻后得到培養基;所述麥芽糖、蛋白胨、酵母膏、瓊脂粉和蒸饋水的重量體積比為4g:lg:lg:lg: 93ml ；
②用滅菌的接種環蘸取萊氏野村菌分生孢子，置于步驟①得到的培養基表面上方6厘米處，敲擊接種環，將萊氏野村菌分生孢子撒在步驟①得到的培養基上，得到萊氏野村菌分生孢子接種的培養基，所述萊氏野村菌分生孢子接種培養基的分布密度為2個/cm2;
③將步驟②所得萊氏野村菌分生孢子接種的培養基置于溫度26°C，濕度為80%的光照環境中，96小時后在培養基表面得到半透明液滴狀的萊氏野村菌酵母型細胞；
④用滅菌的平頭鑷子輕輕刮取步驟③所得的萊氏野村菌酵母型細胞至步驟①所得的培養基表面，用不銹鋼筷子涂布均勻，置于溫度26°C，濕度為8