專利名稱：紅色諾卡氏菌細胞壁骨架增強樹突狀細胞功能的方法
技術領域：
本發明涉及免疫治療領域。具體而言，本發明涉及紅色諾卡氏菌細胞壁骨架的免疫調節的方法。
背景技術：
紅色諾卡氏菌細胞壁骨架作為一種免疫調節劑可以有效調動和激活機體的樹突狀細胞，樹突狀細胞是機體免疫系統中專職的抗原遞呈細胞，是啟動機體特異性免疫的關鍵細胞。1、樹突狀細胞的作用在機體免疫系統中樹突狀細胞是一個很重要免疫信號傳遞細胞，對于特異性免疫系統的啟動擔負專職的免疫信號傳遞作用，在特異性免疫中T細胞是定向清除病原體的重要的免疫細胞，但是T細胞的活化必須依賴樹突狀細胞的免疫信號傳遞作用，所以樹突狀細胞是免疫系統中的關鍵細胞，關系到機體特異性免疫功能有效發揮的成敗。近幾年，業內專業人士關注的目光轉向了人體免疫系統的研究，人們更注重對于免疫功能低下的原因的分析，進而注意到樹突狀細胞的功能作用弱化的現象，如樹突狀細胞呈現個體小、樹突少、細胞分布密度低等現象，人們認識到樹突狀細胞不發揮作用是免疫功能低下的重要原因。因此國內外爭相開發各類樹突狀細胞疫苗，廣泛用于增強樹突狀細胞的功能，其設計思想是通過樹突狀細胞功能的增強，進而啟動特異性免疫功能。到目前為止，臨床上仍然沒有理想的針對樹突狀細胞功能的免疫調節劑，各項樹突狀細胞疫苗的開發研究也沒有通過臨床試驗。因此，有效激活和調動樹突狀細胞的功能仍是一個業內共同的研究課題，人們期待一個能有效的激活和調動樹突狀細胞功能的新的制劑誕生。2、臨床上相關的適應癥目前，臨床上許多疾病的原因就是機體的免疫功能低下，而免疫功能的低下都與免疫系統不能正常發揮細胞免疫作用有關，而且免疫系統沒能發揮細胞免疫作用又與樹突狀細胞不能正常發揮正常免疫信息傳遞作用有關。目前人體大部分的腫瘤的發生，都與機體樹突狀細胞功能減弱有關，由于樹突狀細胞功能的弱化，使得機體的特異性免疫功能不能有效啟動。因為樹突狀細胞功能的弱化，使得病原體的信號不能通過樹突狀細胞有效的傳遞給T細胞，因此導致T細胞不能被激活而發揮作用。而體內的腫瘤主要依靠T淋巴細胞的清除作用，才能有效控制腫瘤的發展。因此， 可以說臨床上腫瘤的發生和發展，與機體的免疫系統中的樹突狀細胞的功能正常與否有關。所以，臨床上有關預防腫瘤發生和控制腫瘤發展的關鍵，就是能否有辦法調動和激活樹突狀細胞的功能，這已經成為臨床上的焦點難題。
3、臨床上的現狀針對腫瘤的免疫治療是繼手術、放療、化療之后第四種治療腫瘤的新方法。腫瘤的免疫治療是當前的研究熱點，樹突狀細胞與腫瘤的發生和發展有關聯，若患者體內樹突狀細胞功能缺陷或低下，不能有效遞呈腫瘤抗原，無法激活特異性免疫T細胞，則導致機體免疫無能和免疫耐受，使得腫瘤得以發生和發展。樹突狀細胞的不成熟狀態，不能有效提呈抗原，成為能否有效啟動特異性免疫的關鍵環節。目前，人們主要采用開發樹突狀細胞疫苗的方法，用以解決樹突狀細胞功能弱化的問題。許多實例證明，由樹突狀細胞激活的T細胞在抗腫瘤免疫過程中起主導作用。以樹突狀細胞為基礎的免疫治療將來會成為未來抗腫瘤治療的主要手段之一。本領域的主流研究方向是尋找能夠在體內外運用，相容性好，更安全和高效的抗腫瘤樹突狀細胞疫苗方式。與火熱的研發疫苗的情況對比；還沒有特定的藥物能夠用來調動和激活樹突狀細胞。4、樹突狀細胞疫苗應用及存在的問題以樹突狀細胞為基礎的腫瘤疫苗成為腫瘤免疫治療的新策略和主攻方向。通過體外負載樹突狀細胞，回輸體內免疫治療策略；體內致敏樹突狀細胞的策略在樹突狀細胞疫苗應用中，收到很多療效，但是也遇到許多問題①、體外培養易于污染；②、體外培養成本高；③、容易引發自身免疫性疾病；④、 藥效不穩定；⑤、尚待尋找最佳的制備方法；⑥、繼續篩選理想的腫瘤抗原負載的方式；⑦、 技術難度較大；⑧、大規模培養制備有難度；⑨臨床治療方案差異性大；⑩、瘤苗回輸注意避免T細胞耗竭；樹突狀細胞腫瘤疫苗已經顯示出來廣闊的臨床應用前景，將會是一種很有前途和使用價值的抗腫瘤策略。但同時也應該看到，當前研究的樹突狀細胞抗腫瘤疫苗遠遠沒有達到人們期待的效果，尚處于臨床試驗階段，主要是許多重要的分子免疫機制如治療免疫逃逸、免疫耐受、細胞毒T細胞(CTL)活性降低、或無反應，以及樹突狀細胞遞呈抗原時所受周圍環境的影響，等問題有待深入研究和闡明。另外，如何尋找最佳的樹突狀細胞制備的方法選擇最佳的樹突狀細胞成熟和激活的狀態及腫瘤抗原的負載的方法等問題目前還沒有公認的答案。總之，樹突狀細胞疫苗尚未達到人們的理想要求，仍處于臨床試驗階段，樹突狀細胞疫苗的研發還屬于未成熟狀態。

發明內容
通過多次生物等效性實驗，發明人發現作為生物制劑的紅色諾卡氏菌細胞壁骨架可以有效調動和活化樹突狀細胞，樹突狀細胞是機體免疫系統中專職的遞呈細胞，樹突狀細胞能否活化對于啟動機體特異性免疫非常重要。因此這一實驗結果可以說明紅色諾卡氏菌細胞壁骨架通過激活和調動樹突狀細胞，進而有利于樹突狀細胞發現和識別致病抗原并加以處理，因此更利于活化T細胞，使人體的特異性免疫更易于被有效激活。本發明的實驗結果說明，紅色諾卡氏菌細胞壁骨架可以明顯增加樹突狀細胞的密度和迅速改善樹突狀細胞的形態和功能，使樹突狀細胞處于激活狀態。
紅色諾卡氏菌細胞壁骨架作用人體后，能夠有效激活和強化樹突狀細胞的功能， 進而利于調動人體特異性免疫功能，使得T細胞易于被激活，促使人體細胞免疫系統的活化，引起人體特異性免疫抗腫瘤免疫應答。紅色諾卡氏菌細胞壁骨架通過糾正機體免疫缺陷，啟動患者自身特異性腫瘤殺傷機制，依靠激活自身的免疫功能清除腫瘤細胞。紅色諾卡氏菌細胞壁骨架這一活化樹突狀細胞作用的發現，填補了臨床上對于樹突狀細胞功能低下癥狀沒有安全有效治療藥物的空白，結束了醫生們面對眾多樹突狀細胞功能低下的患者尚無良策的尷尬局面，使人們針對免疫低下的病癥有了新的治療手段。
因此，本發明一方面涉及紅色諾卡氏菌細胞壁骨架在制備用于調節哺乳動物樹突狀細胞功能的免疫制劑中的用途，其中所述的調節包括紅色諾卡氏菌細胞壁骨架激活、調動和增強哺乳動物機體樹突狀細胞的功能。本發明所述的哺乳動物包括人。本領域已知許多疾病與樹突狀細胞功能低下有關，例如，通過本發明紅色諾卡氏菌細胞壁骨架治療的樹突狀細胞功能低下病癥。在本發明涉及的用途中，樹突狀細胞可以是朗格漢斯細胞。在本發明涉及的用途中，所使用免疫制劑的有效量可以由本領域技術人員根據需要確定，例如所需免疫制劑的劑量可以為5ug-1200ug。在本發明涉及的用途中，免疫制劑可以通過體內、皮下或者接觸途徑給藥，優選為與皮膚和/粘膜接觸給藥。在本發明涉及的用途中，免疫制劑可以包含藥學上可接受的載體或賦形劑。本領域技術人員所知的任何適當的載體或賦形劑都可用于本發明。優選地，可使用的賦形劑包括凍干劑型、乳膏劑型或者擦劑。本發明還涉及一種調節哺乳動物樹突狀細胞功能的方法，包括向哺乳動物直接使用有效劑量的紅色諾卡氏菌細胞壁骨架，其中所述的調節包括紅色諾卡氏菌細胞壁骨架激活、調動和增強哺乳動物機體樹突狀細胞的功能。因此，本發明的內容涉及下述方面1、通過紅色諾卡氏菌細胞壁骨架的作用體內和皮膚以及粘膜，使得機體樹突狀細胞全面被激活，進而使機體的免疫功能大為加強；2、樹突狀細胞功能的增強體現在，樹突狀細胞的密度增大，樹突狀細胞的形態改變成激活狀態；3、通過樹突狀細胞功能的增強，使得機體的特異性免疫功能的啟動有了良好的基石出；4、在紅色諾卡氏菌細胞壁骨架作用機體過程中，藥物為微克級，安全可靠迅速發生作用；本發明具有下述特點1、紅色諾卡氏菌細胞壁骨架微量成分作用機體后，能夠幾個小時后迅速有效激活樹突狀細胞，用藥后藥效反應迅速；2、在紅色諾卡氏菌細胞壁骨架微量成分的作用下，機體的樹突狀細胞的密度明顯增加，樹突狀細胞形態展開飽滿，樹突狀細胞能夠被充分激活；
3、紅色諾卡氏菌細胞壁骨架適量成分作用機體過程中，機體無毒副作用，顯示良好的安全性；4、紅色諾卡氏菌細胞壁骨架在臨床上應用操作簡便，方便患者使用。


圖1 朗格漢斯細胞染色圖。a為288X，b為1152X。圖2 納可佳組給藥小鼠和右旋糖酐對照組小鼠朗格漢斯細胞圖。圖3 納可佳組和右旋糖酐組對小鼠耳部LC細胞的影響折線圖。
具體實施例方式試驗材料1.藥品紅色諾卡氏菌細胞壁骨架(納可佳)，來源遼寧納可佳生物制藥有限公司，批準文號國藥準字S20030009。2.動物:6 8周健康雌性BALB/c小鼠，SPF級，14只，體重(20士2) g。來源北
京云菱動物繁育廠。3.鼠抗人HLA-DR，250 μ 1編號ΖΜ-0136，北京中杉金橋生物技術有限公司生產。4.鼠ABC試劑盒l/4kit，北京中杉金橋生物技術有限公司(美國VECTOR公司)。5.兔抗人 HLA-DR (Rabbit Anti-HLA-DR)，0. 2ml，編號 BS-1198R，北京博奧森生物技術有限公司。6.兔免疫組化染色試劑盒dml，編號SP-0023，北京博奧森生物技術有限公司。7.大鼠抗人 HLA-DR，0. 25ml，編號 MCA71R，serotec 公司生產。8.生物素化兔抗大鼠IgG(H+L)，編號觀_2040，北京中杉金橋生物技術有限公司生產。9. AEC酶底物試劑盒anl，編號zli-9036，批號K106718A，有效期08Λ011，北京中
杉金橋生物技術有限公司。10. PBS緩沖液2000ml/袋，北京中杉金橋生物技術有限公司。11. GVA封片劑5ml，編號ζ 1 i-9051，批號P92304H，有效期07/2011，北京中杉金橋生物技術有限公司。試驗設計本發明的驗證思路是利用生物等效性的原則，采用動物實驗的方式，發明人選擇了中國醫科大學國家重點學科實驗室的實驗方法，通過多次多組小鼠體內實驗，經過先進的檢測手段檢測和科學的統計計算方法的計算，證明紅色諾卡氏菌細胞壁骨架可以調動和激活樹突狀細胞的效能。動物試驗方案和步驟實驗方案的思路和設計原則采用小白鼠進行生物等效性實驗，隨即分成若干個實驗組和兩個對照組，參照專業論文的相關實驗方法，結合發明人自身實驗的特點，制定驗證本發明的動物實驗方案。實施例1試驗步驟
1.分組取3只小鼠隨機分為三組并編號，即空白組(1號)、20yg納可佳組O 號)及右旋糖酐賦形劑對照組(3號)。1號、3號采用一抗和二抗(大鼠抗人HLA-DR)，2號一抗為采用兔抗人HLA-DR。2.操作步驟取空白組小鼠1號，根據小鼠真表皮分離的方法進行操作，將真皮和表皮分離。2 號和3號小鼠分別注射0. 2ml納可佳溶液和0. 2ml右旋糖酐40溶液，于第二天進行剪耳分離，并進行免疫組化染色，鏡檢。小鼠真表皮分離①乙醚麻醉小鼠，剪下耳朵的一部分。②用刀片刮除表面的皮脂和皮屑，PBS反復沖洗3-5次。③用鑷子分開鼠耳的皮膚。刀片刮除軟骨，并切成0. 5cmX0. 5cm小塊。④加入EDTA分離液(PH7. 2)中37°C水浴，SOmin后取出皮片將真表皮分開，留表皮備用。3.抗體標記①丙酮室溫固定表皮4°C，20min, PBS沖洗5min，2次；②表皮放入含1 100大鼠抗人HLA-DR(2號為兔抗人HLA-DR)抗體的微量離心管內搖動，4°C過夜；③取出表皮，PBS沖洗5min，2次，放入含1 50的生物化的兔抗大鼠IgGQ號為山羊抗兔IgG)抗體的微量離心管內，孵育1. 5h后，PBS沖洗5min，2次；④表皮放入加辣根酶標記鏈酶卵白素微量離心管內，孵育60min，PBS沖洗5min，2 次4.免疫組化染色(按照AEC試劑盒使用)染色前，分別將123號試劑各50 μ 1加入到已盛有Iml蒸餾水的微量離心管，避光保存，30min內有效。①室溫下，小心在載玻片加上100μ 1的染色工作液，放入表皮(真皮面向上)，使其浸入工作液中。②室溫下孵育10至20min，或直至樣本出現紅色。③移去表皮上的染色工作液。④室溫下，將玻片置入50ml自備的PBS緩沖溶液中浸泡⑤移去表皮上的PBS緩沖溶液
⑥風干后甘油明膠封片。。⑦即刻在光學顯微鏡下觀察陽性呈現紅色。實施例2試驗步驟1.分組取8只小鼠隨機分為二組并編號，S卩40 μ g納可佳組(1-6號)及右旋糖酐賦形劑對照組(1-2號。)2.操作步驟納可佳組注射0. 2ml40 μ g/ml的納可佳溶液，右旋糖酐對照組注射0. ^113%的右旋糖酐40溶液，具體給藥和取耳染色時間見下表
權利要求
1.紅色諾卡氏菌細胞壁骨架在制備用于調節哺乳動物樹突狀細胞功能的免疫制劑中的用途。
2.根據權利要求1所述的用途，其中所述的調節包括紅色諾卡氏菌細胞壁骨架激活、 調動和增強哺乳動物機體樹突狀細胞的功能。
3.根據權利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的樹突狀細胞包括朗格漢斯細胞。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的用途，其特征在于所述的免疫制劑的劑量為 5ug-1200ug。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的用途，其特征在于所述的免疫制劑通過體內、皮下或者接觸途徑給藥。
6.根據權利要求1-4中任一項所述的用途，其特征在于所述的免疫制劑包含藥學上可接受的載體或賦形劑。
7.根據權利要求6的用途，其特征在于所述的賦形劑包括凍干劑型、乳膏劑型或者擦劑。
8.調節哺乳動物樹突狀細胞功能的方法，包括向哺乳動物直接使用有效劑量的紅色諾卡氏菌細胞壁骨架。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述的調節包括紅色諾卡氏菌細胞壁骨架激活、 調動和增強哺乳動物機體樹突狀細胞的功能。
10.根據權利要求8或9所述的方法，其特征在于所述的樹突狀細胞包括朗格漢斯細胞。
全文摘要
本發明涉及紅色諾卡氏菌細胞壁骨架增強樹突狀細胞功能的方法。發明人發現紅色諾卡氏菌細胞壁骨架可以有效調動和活化樹突狀細胞，通過樹突狀細胞抗原提呈功能的強化，進而利于樹突狀細胞識別致病抗原并傳遞抗原信息，有利于活化T細胞，促使人體的特異性免疫被有效激活。因此，紅色諾卡氏菌細胞壁骨架可用于制備治療機體樹突狀細胞功能低下病癥的免疫制劑。本發明通過紅色諾卡氏菌細胞壁骨架活化樹突狀細胞，為治療樹突狀細胞功能低下病癥提供了安全有效的免疫調節劑。
文檔編號A61K35/74GK102526119SQ20101060869
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月23日 優先權日2010年12月23日
發明者張策, 張紫真, 張紅陽, 張軼, 洪曉明 申請人:遼寧納可佳生物制藥有限公司