專利名稱：肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)系列疫苗和診斷試劑及生產方法
技術領域：
屬生物技術領域背景技術：
由流行性肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)引起的局限性或傳播性深部真菌病，屬流行病，生活在流行區的人多數會被感染，臨床表現分原發性和進行性兩種，原發性是急性、自限性的肺部感染，但少數發展為進行性急性、播散性深部真菌病，可以侵襲腦、肺、內臟和器官，嚴重者可危及生命。
流行性肺組織胞漿菌(球狀酵母)是一種雙相型真菌，寄生于人體組織內，本菌呈球形，稱為球體，球體成熟時含有園形或不規則圓形內生孢子，(endospore)，數目可由數個至數十個，或充滿球體。1周后球體成熟、破裂、釋放出內生孢子，每個內生孢子又發教育成新的球體，球體成熟后又釋放出生孢子，如此循環往復地生長繁殖，球體直徑約有10-80μm，少數可達100μm；內生孢子直徑1～2μm，少數可達10μm。菌體排出體外，在培養基上生長發芽，延長分支成為菌絲體，稱為關節菌絲。
SARS流行性肺組織胞漿菌病(球狀酵母病)，是最新發現的烈性傳染病，本病對人群呼吸系統高度易感，主要臨床表現為發燒、咳嗽、氣促、呼吸困難、軟弱、白細胞減少，X光診斷為非典型性肺炎。本病原體屬于真菌屬，是一種雙相真菌，在血瓊脂和沙保羅氏瓊脂培養生長緩慢，約2-3周才長出肉眼可見的白色小菌落，在動物模型病理組織切片中，肺、脾、肝、腦等組織可見大量園形、橢園形、周圍有一光亮帶的厚壁酵母樣孢子粒顆，在液體純培養中可形成大小不等的孢子體，(見附圖)。
3、發明內容采用SARS流行性肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)為原料制造滅活疫苗和減毒疫苗，制造提純精制系列特異性預防疫苗，包括多糖疫苗(糖蛋白)、核酸疫苗、亞單位疫苗、合成和半合疫苗、胞壁疫苗、多肽疫苗、毒素、類毒素疫苗、基因重組疫苗、抗獨特型抗體疫苗和生產特異性免疫球蛋白，以及用上述原料，制造出其他新生物制品，用SARS特異性預防疫苗。并同時通過免疫技術生產酶聯免疫試劑，PCR診斷試劑，免疫螢光抗體診斷、膠體金診斷試和基因芯片等診斷用品，制造抗體、多克隆抗體和單克隆抗體。
(1)技術關鍵①本發明制造的系列疫苗，主要通過菌株分離、擴增、純化、滅活、脫毒(死菌)制造而成，其滅活方法是使在水浴中或相當的加溫環境中用100℃10-40分鐘，或60-95℃，1-6小時滅活，或采用1％-3％甲醛滅活和同時脫毒，達到滅活目的，并保持疫苗抗原的免疫活性的最佳狀態。
②本發明生產SARS系列預防疫苗，主要通過菌種培養、擴增、發酵、濃縮然后用物理、化學方法或生物技術，分離免疫活性組分，經層析、提取、純化和精制。用細胞破碎器或用其他特殊的處理方法將細胞解體然后分離，提取、純化、精制加工制造成系列特異性預防疫苗和系列特異性診斷試劑。
(2)技術方案①本發明制造的疫苗，是采用一種前所未有的滅活和甲醛脫毒的方法制造出安全有效SARS的預防疫苗。
②用細菌破碎器破碎菌體，除去細胞碎片，硅膠吸附粗提糖蛋白、核酸、亞單位、細胞壁、毒素，然后用疏水層析法精提，經硫氰酸鹽或其他沉淀劑處理后，獲取目的產品，稀釋和除菌，然后進行純化，產品檢定。通過聚丙烯酸胺凝膠電泳、免疫印染、高壓液相等程序，使制品達到所需要求，進入疫苗半成品生產成注射液和噴喉氣霧劑以及滴鼻的粘膜免疫滴劑。成品檢定合格后分裝、包裝、商品化進入市場。為實現上述目標具體方法如下本發明的SARS預防疫苗，根據抗原活性對動物產生的抗原抗體免疫反應和免疫耐受性，通過菌株分離擴增、純化、滅活、脫毒和毒性、效力試驗、安全試驗等程序，SARS預防疫苗的臨床用量單位按含菌數計算，供皮下或肌肉注射的疫苗，用于滴鼻和噴喉氣霧劑。并制造球SARS預防苗的系列劑型，如氣霧劑、滴鼻霧劑(液體)和用于舌下含的片劑、供皮下或肌肉注射針劑，以及凍干粉針劑等。供預防SARS感染之用。采用減毒活疫苗的劑量是滅活疫苗減量的2～20倍。
(3)技術效果SARS病，當今被認為是一種烈性傳染病，本發明研制成功特異性預防疫苗，是徹底解決本病的傳播延和易感者預防的最佳途徑。世界公認，疫苗是最有效、最方便、最安全、最經濟的預防傳染病方法，SARS預防疫苗的研制成功，將于人類健康作貢獻。
本發明流行性肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)其制造方法是采用上述滅活方法，經反復多次離心洗滌，加入適量無菌溶劑，用超聲波粉碎和反復凍溶后，經毒性試驗、安全試驗、過敏試驗，用適當溶劑以1∶100-10000稀釋，無菌試驗合格，供特異性診斷SARS皮試應用(0.1ml/次皮內)。
對于急性流行病病原學的正確診斷，是消除流行病的傳染源和對患者的及時治療以及預防的關鍵，本發流行性肺組織胞漿菌素和球狀孢子菌素研制成功，提供了一種特異性診斷用品，并同時用流行性肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)為原料生產酶聯免疫試劑，PCR診斷試劑，免疫螢光試劑膠體金和基基芯片等特異性診斷試劑。
為實現上述目標，本發明采用技術方案如下《SARS流行性肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)多糖疫、核酸疫苗制造方法》1.定義、組織及用途本品系用流行性肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)培養液，經提純獲得多糖抗原，并加入適宜穩定劑后凍干制成，供預防SARS感染之用。
2制造2.1基本要求2.1.1設施與生產質量管理按中國《藥品生產質量管理規范》要求實施。同時還必須具備三級安全實驗和生產工作(P3)條件，并須在二級以上生物安全匱中操作；動物模型須在P3和P3級以上實驗室中進行。
2.1.2原料及輔料應符合現行《中國藥典》或《中國生物制品主要原輔材料質控標準》的要求。未納入上述標準的化學試劑，應不低于化學純。
2.1.3生產用水生產用水源水應符合國家飲用水標準；純化水及注射用水應符合現行《中國藥典》標準。
2.1.4生產用器直接用于生產的金屬或玻璃等器具，必須嚴格清洗及去熱原質處理或滅菌處理。
2.1.5生產及檢定用動物小鼠、豚鼠應符合清潔級標準。
2.2菌種2.2.1菌種名稱及來源制造用疫區分離的SARS流行性肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)應經國家藥品管理當局批準，并由國家藥品檢定機構或國家指定的單位保管和分發。
2.2.2種子批的建立生產用菌種應采用種子批系統。原始種子批應驗明其記錄、歷史、來源和生物學特性。從原始種子批傳代、擴增后凍干保存為主種子批。從主種子批制備工作種子批。主種子批和工作種子批的各種特性應與原始種子批一致。工作種子批用于生產。
2.2.3種子批的檢定菌種接種在含10％羊血普通瓊脂培養基上25℃，2周后生長出細小白色棉花樣菌落，在GH改良液體培養24-48小時培養，涂片鏡檢應為純的園形大小不等的孢子體。
2.2.3.1生化反應接種葡萄糖、果糖及蔗糖，于35～37℃培養5-7日，發酵葡萄糖、麥芽糖，產酸不產氣。
2.2.3.3血清凝集試驗將在25℃-37℃培養24-48小時培養懸液于0.5％ 甲醛生理氯化鈉溶液或60℃加熱60分鐘殺菌以后，使每1ml含菌1.0×109-2.0×109，與特異血清定量凝集反應，應置35-37℃過夜，次日再放置室溫2小時觀察結果，以肉眼可見清晰凝集現象之血清最高稀釋度(+)為凝集效價，必須達到原血清效價之半。參考血清由國家藥品檢定機構分發或同意。
2.2.4菌種傳代及保存2.2.4.1菌種應凍干保存于2～8℃。主種子批自啟開后傳代最多不能超過5代。
2.2.4.2工作種子批生產前應檢查菌種的全部特性，合格后方可用于生產。
2.3原液制備2.3.1 生產用種子將工作種子批菌種啟開后，接種在GH改良液體培養基或其他適宜培養基上，放25～37℃培養一般不超過48小時，第2-4代菌種可用適宜的液體培養基，25-37℃。由此制備適宜數量的生產用工作種子，工作種子批開啟后至接種培養不得超過5代。
2.3.2生產用培養基生產多糖疫苗可選用適宜培養基。生產用的液體培養基不應含有能與加入的十六烷基三甲基溴化銨形成沉淀的成分。培養基中不應含有對人體有害或其他過敏原物質。
2.3.3菌種接種和培養采用密封培養罐液體培養。于培養基中接種生產用工作種子后。在培養過程中和殺菌前取樣進行純菌試驗，涂片做美蘭染色鏡檢，如發現污染雜菌，應去棄。
2.3.4收獲和殺菌培養物于對數生長期后或靜止期前期收獲。一般培養24-48小時為宜。將培養物加入甲醛溶液殺菌，或加熱殺菌，以確保殺菌安全并不損傷菌體多糖為宜。
2.3.5提純和精制2.3.5.1去核酸(保留用于生產核酸)將已殺菌的單一收獲物(或合并收獲物)離心去菌體，收集上清液，于其中加入十六烷基三甲溴化銨混勻，離心收集沉淀物。沉淀物中加入氯化鈣溶液，使最終濃度為1mol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化銨解離，加入乙醇至最終濃度為25％(ml/ml)。冷庫靜置3小時或過夜，離心去沉淀，收集澄清的上清液。
2.3.5.2沉淀多糖于上述上清液中加入冷卻乙醇至最終濃度80％(ml/ml)，充分振搖。離心收集沉淀多糖，然后用無水乙醇及丙酮各洗2次以上，將沉淀物(多糖粗制品)保存在-20℃以下待進一步提取。
2.3.5.3多糖精制將粗制品溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達10-20mg/ml，然后按1∶2容量用冷酚(100g結晶酚溶40ml 1/10飽和醋酸鈉溶液)提取2-3次，離心收集上清液，并用0.1mol/L氯化鈣溶液或適宜溶液透析。必要時可用其他方法去除內毒素。再加乙醇至最終濃度為75％-80％(ml/ml)。離心收集沉淀物，用無水乙醇及丙酮各洗2次以上。離心后傾去上清液，用注射用水溶解沉淀的多糖，所得溶液即為提取的多糖原液。原液經除菌過濾后，取樣進行無菌試驗、血清學試驗及各項生化測定。提取過程應在15℃以下進行。提純多糖應保存在-20℃或以下。
2.3.5.4再制若提純多糖的蛋白質、核酸及內毒素含量達不到要求時，可再制一次。
2.4原液檢定按3.1項進行。
2.5半成品檢定可將單批或多批檢定合格的多糖原液合并，然后加入無菌無熱原質乳糖和注射用水稀釋，使每人用劑量疫苗含多糖30μg，乳糖2.5-3.0mg。
2.6半成品檢定按3.2項進行。
2.7分批按本版規程通則《生物制品分批規程》進行。
2.8分裝及凍干按本版規程通則《生物制品分裝規程》進行。采用適宜條件凍干，凍干過程制品溫度不應高于30℃，真空或充氮封口。
2.9規格本品規格為每安瓿150μg或300μg多糖。每人和劑量含多糖30μg。
2.10包裝按本版規程通則《生物制品包裝規格》進行。
3檢定3.1原液檢定3.1.1固體總量測定每批提純多糖抗原的蛋白質含量應小于10mg/g，按Lowry法測定。
3.1.3.核酸含量每批提純多糖的核酸含量應小于10mg/g。按分光光度法，核酸在260nm波長處的吸收系數(E1％cm)為200。
3.1.4O-Z酰基含量測定每批提純多糖的O-Z酰基含量應不低于2mmol/g，按Herstrin法測定。
3.1.5磷含量每批提純多糖的磷含量應不低于80mg/g，用鉬酸銨法測定。
3.1.6分子大小測定每批提純多糖的分子大小應用瓊脂糖-4B或CL-4B凝膠層析法測定。KD值應不高于0.40。KD值在0.5以前的洗脫液多糖回收率應在65％以上。按附錄方法進行。
3.1.7特異性試驗每批提純多糖應用瓊脂擴散試驗(或國家藥品檢定機構認可的其他適宜免疫學方法)進行特異性試驗。多糖抗原在球狀酵母菌抗體存在下，應產生明顯的沉淀線。
3.1.8細菌內毒素含量測定每批提純多糖可用常規鱟試驗(半定量凝膠法)檢測內毒素含量。一般控制每1μg多糖內毒素含量應不高于100EU(如超過，可按3.3.7項家兔法確證)。
3.1.9原液應保存于-20℃或以下，自收菌之日起有效期為5年。
3.2半成品檢定無菌試驗按本版規程通則《生物制品無菌試驗規程》A項進行。
3.3成品檢定3.3.1鑒別試驗按3.1.7項方法進行。
3.3.2外觀凍干成品應為白色疏松體，加入所附PBS后迅速溶解。溶液應澄明無異物。
3.3.3化學檢定按本版規程附錄《生物制品化學及其他檢定方法》進行。
3.3.3.1水分不高于3.0％。
3.3.3.2多糖含量每劑量多糖含量應不低30μg。磷含量應不低于2.25μg。
3.3.4分子大小測定分裝的疫苗至少5批抽一批測多糖分子大小，用瓊脂糖-4B或CL-4B凝膠過濾法測定，KD值應不高于0.40。KD值小0.5的洗脫多糖加回收率應在65％以上。方法見附錄。
3.3.5無菌試驗按本版規程通則《生物制品無菌試驗規程》A項進行。
3.3.6異常毒性試驗每批疫苗應按本版規程通則《生物制品異常毒性試驗規程》進行，豚鼠注射劑量為500μg多糖(1ml)，小鼠注射劑量為100μg多糖(0.5ml)。
3.3.7熱原質試驗按本版規程通則《生物制品熱原質試驗規程》進行，家兔注射劑量為0.025μg/kg體重。
3.4疫苗稀釋液檢定稀釋疫苗用的pH6.8-7.2PBS應經過下列檢定。
3.4.1無菌試驗每批稀釋液應按本版規程通則《生物制品無菌試驗規程》A項進行。
3.4.2異常毒性試驗按本版規程通則《生物制品異常毒性試驗規程》進行。
3.4.3熱原質試驗按本版規程通則《生物制品熱原質試驗規程》進行。
3.4.3熱原質試驗按本版規程通則《生物制品熱朱質試驗規程》進行。
4保存、運輸及有效期于2-8℃避光保存和運輸，自凍干之日起有效期為3年。
5使用說明組成和性狀本品系用流行性肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)培養液，經提純獲得多糖抗原并加入適宜穩定劑后凍干制成的多糖疫苗。成品外觀為白色疏松體，加入所附PBS后可迅速溶解，溶液澄明無異物。
規格本品規格為注射用安瓿150μg或300μg多糖。每人用劑量含多糖30μg。氣霧劑和滴鼻劑疫苗含多糖1.5-3mg/瓶。
質量標準本品依據《中國生物制品規程》2000年版生產和檢定，質量符合要求。
作用和用途本疫苗接種后，可使機體產生免疫應答，用于預防SARS流行性肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)感染。
接種對象SARS病疫區人群，易感人群，對本病醫護人、實驗室研究人員和與患者近距離接的各類人員的預防。
用法與劑量(1)啟開疫苗瓶后，按瓶簽或盒簽標含量，加入所附PBS溶解，搖勻立即使用。
(2)將上臂外側三角肌附著處消毒后，皮下注射30μg(0.2ml或0.5ml)。
禁忌有下列情況者，不得使用本疫苗。
(1)嚴重心血管、高血壓、腦部疾患及有過敏史者。
(2)心臟病(3)急性傳染病及發熱者。
副反應及處理本疫苗反應輕微，偶有短暫低熱，局部稍有壓痛感，可自行緩解。
注意事項(1)使用前應檢查安瓿，如安瓿有裂紋、瓶塞松動或瓶內有異物者，不得使用。
(2)每一安瓿制品溶解后，應按規定人份(劑量)一次用完，不得分多次使用。
保存、運輸及使用期限于2-8℃避光保存和運輸。在盒簽(或瓶簽)標明的失效期前使用。
生產批準文號生產單位及地址6附錄球狀孢子菌多糖疫苗莢膜多糖抗原分子大小測定(瓊脂糖4B層析法)附錄流行性肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)多糖疫苗抗原分子大小測定(瓊脂糖4B層析法)1試驗材料1.1試劑1.1.1瓊脂糖4B凝膠1.1.20.2mol/L醋酸胺(pH7.0)1.1.3藍色葡聚糖2000(2mg/ml)1.1.4鉻酸鉀或維生素B12溶液(1mg/ml)1.2儀器1.2.1層析柱(1.5cm×90cm)1.2.2組分收集器及試管1.2.3凝膠及洗脫液貯瓶1.2.4適宜監測裝置及記錄器2試驗步驟2.1裝柱及層析柱的標定2.1.1瓊脂糖4B凝膠的漂洗取瓊脂糖4B凝膠約200ml，加0.2mol/L醋酸胺400ml，充分攪拌并放置約1小時使其沉淀，傾去混懸有顆粒的上層懸液。如此反復數次后，加200ml0.2mol/L醋酸胺溶液，置真空罐內抽去凝膠中的空氣。
2.1.2裝柱于1.5cm×90cm層析柱中，將瓊脂糖4B凝膠裝約87cm高，操作壓70-75cm，用0.2mol/L醋酸胺流洗，流速為15-20ml/h，以2-3倍量柱床體積的流洗液流洗，使柱床平衡。
2.1.3柱的標定2.1.3.1空流體積V取2mg/ml藍色葡聚糖2000(用0.2mol/L醋酸胺溶解)1ml，加于已平衡的柱上，用0.2mol/L醋酸胺流洗，用組分收集器收集流洗液，于260nm波長測定各管的A值。以A值為縱坐標，ml數為橫坐標作圖，第一個峰頂洗脫體積，即為Vo。
2.1.3.2柱床體積V1取鉻酸鉀或維生素B12溶液(1mg/ml，用0.2mol/L醋酸胺溶解)1ml，加于已平衡的柱上，用0.2mol/L醋酸胺流洗，用收集器收集流洗液，于37onm波長測定各管A值。以A值為縱坐標，ml數為橫坐標作圖，計算峰頂流洗體積，即為V1。
2.2多糖抗原KD的測定取約1ml樣品(含A群抗原3-5mg，如為固體可用0.2mol/L醋酸胺溶解)，加于已標定的瓊脂糖4B凝膠柱上，用0.2mol/L醋酸胺洗脫，以收集器收集，測定每管的磷含量(參看磷含量測定，但以流洗液作為對照)，以每管磷含量(或A值)為縱坐標、體積為橫坐標作圖。也可用紫外分光光度計206nm下檢測，測磷法為仲裁法。按下述公式(1)以多糖主峰峰頂洗脫體積(V0)計算分配系數(KD)；公式(2)計算KD0.5的多糖抗原回收率。
3結果計算按下列公式計算KD值及KD值在0.5以前的多糖回收率。
KD=Ve-VoVi-Vo]]>
《SARS亞單位、抗獨特型疫苗制造方法》1定義、組成與用途本品系由SARS流行性肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)經擴增、分離、提取、純化，加佐劑吸附后制成，用于預防SARS病感染。
2制造2.1基本要求2.1.1設施與生產質量管理按中國《藥品生產質量管理規范》要求實施。同時還必須具備三級生物安全實驗和生產工作(P3)條件，并二級以上生物安全柜中操作動物模型須在P3和P3級以上實驗室中進行。
2.1.2原料及輔料應符合現行《中國藥典》或《中國生物制品主要原輔材料質控標準》的要求。未納入上述標準的化學試劑，應不低于化學純。
2.1.3生產用水生產用水源水應符合國家飲用水標準；純化水及注射用水符合現行《中國藥典》標準。
2.1.4生產用器具直接用于生產的金屬或玻璃等器具，必須嚴格清洗及滅菌處理。
2.1.5檢定用動物小鼠、豚鼠應符合清潔級標準。
2.2菌種2.2.1菌種名稱及來源使用經國家藥品管理當局批準的，來自SARS疫區新分離的流行性肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)凍干保存菌種2.2.2種子批的建立疫苗生產用菌種以菌種種子批系統為基礎進行三級管理，即原始種子批、主種子批和工作種子批。原始種子批應驗明其記錄、歷史、來源和生物學特性。從原始種子批傳出、擴增后凍存的為主種子批。從主種子制備工作種子批。主種子批和工作種子批在規定代次內的生物學特性應與原始種子批一致。工作種子批用于生產。
2.2.3種子批菌種檢定2.2.3.1培養物純度試驗培養物接種于血瓊脂平板和沙保羅瓊脂平板，分別于20-25℃和30-35℃培養2-3周，應無細菌和其他真菌被檢出。
2.2.3.2純菌試驗菌種接種于10％血瓊脂平板2周后可見長出細小白色樣花樣菌落。
2.2.4菌種傳代主種子批經一代擴增制成工作種子批，工作種子批經檢定合格后用于生產。
2.2.5菌種保存主菌種及工作菌種保存于液氮中，為方便生產，小部分工作菌種短期內(6個月內)可保存于-70℃冰箱中。
2.3發酵2.3.1發酵工藝將工作菌種在適宜溫度和時間條件下進行三角瓶、種子罐和生產罐三級發酵，收獲孢子體細胞冷凍保存。
2.3.2發酵產物檢定2.3.2.1培養物純度按2.2.3.1項進行。
2.3.2.2菌種純度流行性肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)純度100％。
2.4純化2.4.1純化工藝用細胞破碎器破碎孢子體細胞，除去細胞碎片，硅膠吸附法粗提亞單位疫苗，抗獨特疫苗，疏水層析法精提抗獨特疫苗亞單位疫苗，經硫氰酸鹽處理后，稀釋和除菌過濾。
2.4.2純化產物檢定2.4.2.1無菌試驗按本版規程通則《生物制品無菌試驗規程》A項進行。
2.4.2.2蛋白質濃度用lowry法測試，蛋白質濃度應在20.0-27.0μg/ml之間。
2.4.2.3純度(1)免疫印染法所測樣品不得出現國家藥品檢定機構認可以外的孢子體雜蛋白。
(2)高壓液相色譜法雜蛋白應不高于1.0％。
2.4.2.5細菌內毒素按本版規程通則《生物制品細菌內毒素試驗規程》進行，應小于10EU/ml。
2.5疫苗原液配制及檢定2.5.1配制加入甲醛，37℃保溫適宜時間，氫氧化鋁吸附后，加入硫柳汞作為防腐劑，即為疫苗原液。
2.5.2原液檢定按3.1項進行。
2.6半成品配制、分批及檢定2.6.1配制滅活吸附后與鋁稀釋劑等量混合，即為半成品。
2.6.2分批按本版規程通則《生物制品分批規程》進行。
2..6.3半成品檢定按3.2項進行。
2.7分裝按本版規程通則《生物制品分裝規程》進行。
2.8規格本品規格為每安瓿0.5ml及1.0ml。每次人用劑量0.5ml。
2.9包裝按本版規程通則《生物制品包裝規程》進行。
3檢定3.1原液檢定3.1.1吸附完全性試驗吸附率應不低于80％。
3.1.2硫氰酸鹽含量應小于1.0μg/ml。
3.1.3TritonX-100含量應小于15.0μg/ml。
3.2半成品檢定3.2.1無菌試驗按本版規程通則《生物制品無菌試驗規程》A項進行。
3.2.2.化學檢定按本版規程附錄《生物制品化學及其他檢定方法》進行。
3.2.2.1游離甲醛含量應小于20.0μg/ml。
3.2.2.2pH值為5.5～7.2。
3.2.2.4鋁含量為0.35～10.62mg/ml。
3.2.2.5細菌內毒素應小于10EU/ml。
3.2.2.6冰用冰點儀測定，應為-0.52℃±0.12℃。
3.3成品檢定3.3.1鑒別試驗以免疫法測試，證明為流行性肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)抗原。
3.3.2物理檢查應為乳白色混懸液體，可因沉淀而分層，易搖散，不應有搖不散的塊狀物。
3.3.3化學檢定按本版規程附錄《生物制品化學及其他檢定方法》進行。
3.3.3.1鋁含量同3.2.2.3.項。
3.3.3.2硫柳汞含量同3.2.2.4項。
3.3.3.3pH值為5.5～7.2。
3.3.4效力測定將疫苗連續稀釋，每個稀釋度接種MIH 16-18克小鼠10只，每只腹腔注射1.0ml。4～6周后采血，用MIH小鼠測抗體。
3.3.5無菌試驗按本版規程通則《生物制品無菌試驗規程》進行。
3.3.6無菌試驗按本版規程通則《生物制品異常毒性試驗規程》進行。
3.3.7細菌內毒素同2.3.2.5項。
4保存、運輸及有效期于2～8℃避光保存和運輸，疫苗自效力檢定合格之日起有效期為2年。
5使用說明組成和性狀本品系由SARS流行性肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)經純化、加佑劑吸附后制成。注射劑、氣霧劑、滴鼻劑疫苗為白色混懸液體，可因沉淀而分層，易搖散，不應有搖不散的塊狀物。
規格本品規格為每安瓿節0.5ml及1.0ml或5～10ml/瓶。每次人用劑量0.5ml含5μg，氣霧和滴鼻5～10ml/瓶，50-100μg。
質量標準本品依據《中國生物制品規程》2000年版標準生產和檢定，符合質量要求。
作用和用途本疫苗接種后，可刺激機體產生免疫力，用于預防流行性肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)感染。
接種對象(1)SARS病疫區人群，易感人群和患者近距離接觸的種類人員的預防。
(2)從事醫療工作的醫護人員及接觸實驗人員。
用法和劑量(1)本疫苗注射時要充分搖勻。
(2)注射部位為上臂三角肌內。
禁忌患有急性嚴重疾病患者及對酵母成分過敏者禁止使用。
副反應處理本品很少有不良反應，個別人可能有中、低度發熱或注射局部微痛，24小時內即自行消失。
注意事項(1)用前搖勻。
(2)安瓿破裂、有搖不散塊狀物時不得使用。
保存、運輸及使用期限于2～8℃下避光保存和運輸，在盒簽或瓶簽標明的失效期前使用。
生產批準文號生產單位及地址《SARS滅活疫苗和SARS菌素制造方法》1.定義、組成及用途本品系用流行性肺組織胞漿菌(球酵母菌)培養后(以下簡稱SARS菌)，經甲醛溶液滅活、脫毒處理、制成每瓶含菌2-5×109/ml和適量保護劑，不含防腐劑制成。用于SARS病的預防。
2.制造2.1基本要求2.1.1設施與生產質量管理按中國《藥品生產質量管理規范》要求實施。
2.1.2原料及輔料符合現行《中國藥典》或《中國生物制品主要原輔材料質控標準》的要求。未納入上述標準的化學試劑，不低于化學純。
2.1.3生產用水生產用水符合國家飲用水標準，純化水及注射用水符合現行《中國藥典》標準。
2.1.4生產用器具直接用于生產的金屬或玻璃等器具，嚴格清洗及去熱源處理或滅處理。
2.1.5生產及檢定用動物家兔、小鼠、豚鼠符合清潔級。
2.2菌種2.2.1菌種名稱及來源制造用菌種由當地分離獲得并凍干保存或國家指定的單位保管和分發。
2.2.2種子批的建立生產用菌種采用種批系統。原始種子批應檢明其記錄、歷史、來源和生物學特性，從原始種子批傳代，擴增后凍干保存為主種子批。從主種子批備工作種子批。主種子批和工作種子批的各種特性與原始種子批一致。工作種子批用于生產。
2.2.3種子批菌種檢定2.2.3.1形態及培養特性將待檢菌種接種GH改良沙保羅瓊脂或其他適宜培養基，為SARS菌，在血瓊脂培養基上菌落初呈球狀、腦形、粉紅色至棕色。
2.2.3.2生化反應所用菌種均用細胞生化鑒定系統，鑒定為SARS菌。
2.2.3.3血清凝集試驗用25℃或37℃培養24-48小時的培養物，以1％甲醛滅活，用無菌生理氯化鈉溶液稀釋，使其含菌2×109ml，與SARS菌免疫診斷血清(做定量凝集試驗)，充分混合后，置37℃過夜，以肉眼見到凝集之血清最高稀釋度為凝集反應效價。凝集效價應不低于原血清效價之半。
2.2.3.4毒力試驗采用SARS菌分別用25℃或37℃培養24-48小時的GH改良沙保羅液體培養物，以無菌生理氯化鈉溶液稀釋成含菌1.2×109ml、8×108ml、4×108ml、2×108ml等濃度菌液，腹腔注射體重14-16g小鼠，同性或雌雄各半，每個濃度菌液使用至少5只小鼠，每只0.5ml，觀察3-7天。
2.2.3.5毒性試驗分別采用25℃或37℃培養24-48小時的GH改良沙保羅液體培養物混懸于生理氯化納液內，70℃加溫2小時(或其他方法)殺菌，不加防腐劑。殺菌試驗合格后，按一定比例混合，稀釋成每1ml含菌4.0×109、2.0×109及1.0×109共3個濃度，每個濃度菌懸液0.5ml腹腔注射體重16-18g小鼠5只，觀察3天，注射1.0×109至2.0×109個死菌體的小鼠應全部生存。
2.2.3.6抗原性試驗選體重2kg左右之家兔至少3只，以上述免疫力試驗用菌液注射家兔，注射8次，末次注射后7-10天，采血做定量凝集試驗，測定效價。2/3家兔血清凝集價應不低于1∶2560。
2.2.3.7免疫力試驗用終濃度不超過1.1％±0.1％的甲醛溶液殺菌，以不加防腐劑的菌液稀釋，使其含菌2.0×109ml。選體重14-16g小鼠至少30只，每次皮下注射菌液0.5ml，間隔5天注射1次，共注射3次，末次免疫后7-10天，用毒菌攻擊，觀察3天，對照組小鼠死亡數應不低于80％，免疫組小鼠保護率應不低于70％。
2.2.4菌種傳代及保存2.2.4.1菌種凍干保存于2-8℃，主種子批自啟開后傳代不得超過5批。
2.2.4.2生產前檢查菌種特性，合格后用于生產。
2.3原液制備2.3.1生產用種子將工作種子批菌種啟開后，接種于GH改良沙保羅培養基或其他適宜培養基，置℃培養傳代，一般不超過48小時，由此制備適宜數量的生產用工作種子。
2.3.2生產用培養基用pH7.2-7.4的GH改良沙保羅培養基或國家藥品管理當局批準的其他培養基。培養基中不含對人體有害或其他過敏原物質。
2.3.3菌種接種和培養采用密封三角燒瓶種法，接種后置37℃搖床培養24-48小時，在過程中滅菌前權樣做純菌試驗，涂片染色鏡檢、如發現雜菌，應廢棄。
2.3.4收集和殺菌培養結束后，立即加熱100℃，10-30分種80℃一小時滅菌，然后加入終濃度為1.0％-1.2％的甲醛溶液，置37℃，7天，取樣種于GH改良沙保羅培養基做無菌試驗，4℃離心洗滌去甲醛后，加無菌PBS洗二次PBS補至原量，置2-8℃保存。
2.4原液檢定按3.1項進行。
2.5半成品配制單批或多批檢定合格的原液合并，用PBS稀釋，加入適量保護劑，與原液混合，使每1ml含SARS病原菌5×109。
2.6半成品檢定按3.2項進行。
2.7分批按本版規程通則《生物制品分批規程》進行。
2.8分裝或凍干。
按本版規程通則《生物制品分裝規程》進行。
2.9規格本品規格為每小瓶1-55×109ml，內含適量保護劑。
2.10包裝按本版規程通則《生物制品包裝規程》進行。
3檢定3.1原液檢定3.1.1無雜菌。
3.1.2無菌試驗按本版規程通則《生物制品無菌試驗規程》A項進行。
3.1.3濃度測定按“中國細菌濁度標準“進行濃度測定，相當每1毫升含菌應為5×109稀釋時按此濃度計算，誤差不超過103.1.4原液保存原液靜置保存于2-8℃。
原液采集保存期，自原液合并之日起不超過4個月。保存期自采集滅菌之日起不超過6個月。
3.2半成品檢定3.2.1無菌試驗按本版規程通則《生物制品無菌試驗規程》A項進行。
3.2.2制劑濃度每1ml含組織胞漿5×109。
3.3成品檢定3.3.1鑒別試驗與本菌的特異性免疫血清進行玻片凝集試驗，應呈明顯凝集反應。
3.3.2外觀為白色混懸液或白色凍干粉針劑、溶解后應為乳白色混懸液，不應含有搖不散的凝塊或異物3.3.3化學檢定按本版規程附錄《生物制品化學及其他檢定方法》進行。
3.3.3.1PH值為6-7。
3.3.3.2游離甲醛含量不應高于0.1g/L。
3.3.3.3乳糖按現行《中國藥典》進行。含乳糖。
3.3.4無菌試驗按本版規程通則《生物制品無菌試驗規程》A項進行。
3.3.5異常毒性試驗按本版規程通則《生物制品異常毒性試驗規程》進行。
3.3.6濃度測定用“中國細菌濁度標準”進行濃度測定，每小瓶含SARS病原功菌5×109ml。
3.3.7質量標準適應癥接種后能提高機體特異性免疫，用于預防SARS菌病感染。
《流行性肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)診斷試劑的制造方法》在完成SARS疫苗的(3、1、4)制造程序基礎上，取上述合并后的組織漿菌(球狀酵母菌)原液離心洗滌三次，用超聲波充分粉碎，并同時在-100℃以下反復凍溶三次，取出，4℃ 12000次/分離心一小時，棄沉淀，取上清，用注射用水1∶100～10000稀釋，供疑似SARS病患者皮膚試驗之用，《SARS流行性肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)特異性診斷試劑制造方法》主要采用羊抗免或兔抗羊抗體具體方法是用上述未稀釋的原菌液，加入適量羊毛脂或花生油作佐劑，然后注射到羊或兔，抽取免疫后的血清，制成羊抗免或免抗羊的抗血清，或直接從血清提取IgG抗體，制成診斷試劑盒，或制成抗抗體，酶聯免疫試劑、膠體金診斷試劑，PCR診斷試劑，或用螢光素標記抗體制成螢光免疫試劑盒。亦可通過細胞融合制成單克隆抗體。
1.酶聯免疫診斷試劑免疫酶技術是19世紀發展的一項新技術，酶聯免疫吸附技術簡稱ELISA是將SARS病原體的可溶性抗原或抗體吸附在固相載體上，利用酶標記抗體或抗原定量測定相應的抗原或抗體。由于酶的高效催化作用，再結合抗原抗體反應的高度特異性，使ELISA測定具有靈敏、特異性的優點，其操作簡便，出結果快，用流行性肺組織胞漿菌(球酵母菌)做抗原，制造出一種免疫診斷試劑(具體祥細制造方法另附或隨時提供)。
2、熒光抗體診斷試劑20世紀初熒光顯微技術已萌芽，30年代由于熒光素的發展以及采用超高壓水銀石英燈作光源，使熒光染色技術有了顯著進步，用異氰酸熒光黃(FITC)等標記流行性肺組織漿菌(球酵母菌)免疫抗體蛋白能保護抗體的活性，兩者結合物制作診斷特異性試劑，主要是用熒光素標記抗體，免疫熒光技術又稱為熒光抗體技術，它是利用免疫學的特異性和敏感性同顯微鏡的精確性相結合，達到特異性、敏感、快速和簡便地檢出樣品中的抗原物質，熒光抗體診斷試劑(詳細具體制造方法另附或隨時提供)。
3、膠體金免疫診斷試劑免疫金和免疫銀一般是采用間接步驟進行，即用流行性肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)特異性抗體與抗原反應，再用膠體金標記“二抗”與“一抗”反應顯示抗原的位置，這就是免疫金法，其結果可直接用于光鏡觀察。膠體金免疫試劑是應用膠體金為標記物，膠體金即金的水溶膠，它具有一般的溶膠特性，用膠體金標記流行性肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)抗原或特異性抗體，制成特異性免疫試劑，用于診斷病原體有高度特異性和靈敏性，(膠體金免疫試劑的具體詳細方法另附或隨時提供)。
4、PCR診斷試劑原理是用流行性肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)免疫動物(羊、兔等)分離特異性抗體或用單克隆抗體，通過將樣品的抗原物質解離成DNA遺傳物，并通過使其抗增后達到供檢測的量，然后經儀器直接檢測獲得病原體抗原的正確診斷。(具體制造方法另附)。
5、制造抗體、多克隆抗體和單克隆抗體采用流行性肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)作抗原制備高特異性、高效價的免疫血清，制備方法一是以純化的抗原免疫羊、兔、馬等動物，從動物血清中獲得多克隆抗體，二是應用雜交瘤技術制造單克隆抗體。作診斷試劑或醫藥用途。(具體詳細制造方法另附或隨時提供)。
(附圖)

圖1是SARS肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)純培養形態圖，圖2是SARS肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)動物模型小鼠腦膜組織切片形態圖。
權利要求
1.本發明涉及一種SARS流行性肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)系列特異性預防疫苗，和系列特異性診斷試劑及其生產方法，其特征是由SARS流行性肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)制成SARS特異性預防疫苗，或用生物技術生產SARS系列精制特異性疫苗和制造系列特異性診斷試劑及其各種不同劑型的制品，或作醫藥科學研究用途。
2.根據權利要求1所述的SARS系列特異性預防疫苗，其特征是包括混合疫苗、多糖疫苗(糖蛋白)疫苗、核酸疫苗、亞單位疫苗、細胞壁(壁酸)疫苗、多肽疫苗、毒素、類毒素疫苗、合成疫苗和半合成疫苗、基因重組疫苗，抗獨特型抗體疫苗和特異性免疫球蛋白，或單克隆抗體，以及其它新生物制品。
3.根據權利要求1所述的SARS系列特異性診斷試劑，其特征是包括酶聯免疫診斷試劑、PCR診斷試劑，、免疫螢光抗體、膠體金診斷試劑，基因芯片診斷試劑，、和SARS流行性肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)素皮試診斷試劑。
4.根據權利要求1 所述制品劑型，流行性肺組織漿菌(球狀酵母菌)的劑型，其特征是包括制品的注射液，生產出注射針劑、噴喉氣霧劑和滴鼻制劑。
5.根據權利要求1所述SARS流行性肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)系列制品制造方法，其特征是由SARS流行性肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)經過擴增、發酵、縮濃，然后用物理和化學方法或生物技術將流行性肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)細胞破碎(溶解)然后分離、層析提取、純化、精制加工制造成系列特異性疫苗和系列特異性診斷試劑。
6.根據權利要求1所述的科學研究用途，其特征是包括基因測試、特效藥物篩選和醫藥研究用途。
全文摘要
本發明涉及一種由SARS流行性肺組織胞漿菌(球狀酵母菌)，生產SARS系列特異性預防疫苗，其中包括混合疫苗、多糖疫苗(糖蛋白)，核酸疫苗、多肽疫苗、亞單位疫苗、細胞壁疫苗、毒素、類毒素疫苗、合成和半合成疫苗、基因重組疫苗、抗獨特型抗體疫苗和生產特異性免疫球蛋白或單克隆抗體。以及特異性診斷試劑，包括酶聯免疫診斷試劑、PCR診斷試劑、熒光抗體免疫診斷試劑、膠體金診斷試劑。供SARS流行疫區人群和各類易感人群特異性預防和診斷之用。
文檔編號A61K39/00GK1513552SQ0313971
公開日2004年7月21日 申請日期2003年7月8日 優先權日2003年7月8日
發明者余國華 申請人:余國華