一種殼聚糖酶突變體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因遺傳改造技術領域，具體涉及一種殼聚糖酶突變體。
【背景技術】
[0002] 殼寡糖是甲殼質在脫乙酰后形成的殼聚糖的基礎上進一步水解而得到的一種天 然生物高分子，是生物界中大量存在的唯一的一種堿性多糖。殼寡糖其獨特的功能性質使 其在廢水處理、食品工業、紡織、化工、日用化學品、農業、生物工程和醫藥等領域具有廣泛 的用途。我國年產甲殼質及衍生物3-4萬噸，產值幾十億元。但是我國甲殼質生物技術產業 以粗加工以及原料中間體銷售為主，在產業中處于弱勢的甲殼質資源主要是作為殼聚糖原 料低價出口或作為低附加值中間體進行開發出口。目前限制甲殼質資源開發利用的關鍵因 素是主要集中在以下兩個方面:一是傳統的甲殼質原料的化學法加工工藝技術粗放，對環 境的二次或三次污染嚴重，導致甲殼質生產技術一直不能形成工業化生產。二是現代的生 物酶法制備殼寡糖已經成為國際大趨勢，但是目前商品化的特異性水解殼聚糖的酶仍被丹 麥的諾維信以及日本的杰能科公司所壟斷，昂貴的價格成本以及酶自身性質的不穩定限制 了甲殼質以及殼聚糖的開發。
[0003] 能夠專一性水解殼聚糖的酶主要存在于細菌和真菌細胞中，主要包括殼聚糖酶和 溶菌酶。殼聚糖酶EAGl(GenBank登錄號AB008788)是來自芽孢桿菌Bacillus ehimensis的 一種多糖水解酶。它不僅能將殼聚糖分子中的糖苷鍵切斷，將其水解成不同分子量的殼寡 糖，而且在有機溶劑與金屬離子中依然保留著良好的催化活性，是一種極具應用前景的工 業用酶。然而，EAG1的熱穩定性較差，50°C時其活性急劇下降。因此，有必要提高殼聚糖酶 EAG1的穩定性，提高其在高溫條件下的催化效率。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的在于克服上述現有技術中存在的不足，對殼聚糖酶EAGl(GenBank登 錄號AB008788)進行改造，獲得了一種新的殼聚糖酶突變體。
[0005] 本發明提供的殼聚糖酶突變體，其氨基酸序列為SEQ ID NO: 1;
[0006] 編碼上述殼聚糖酶突變體的基因，其一種核苷酸序列為SEQ ID N0:2;
[0007] 本發明另一個方面還保護攜帶有上述編碼基因的重組表達載體；
[0008] 本發明再一個方面保護轉化/轉染有上述重組表達載體的宿主菌
[0009] 作為優選，所述的宿主菌為畢赤酵母。
[0010] 本發明的該突變體與殼聚糖酶EAG1相比，具有更優良的熱穩定性與更高的催化效 率，從而具有更廣泛的應用前景。
【附圖說明】
[0011 ]圖1:殼聚糖酶EAG1與EAG1突變體的氨基酸序列比對結果圖；
[0012] 圖2:殼聚糖酶EAG1突變體的SDS-PAGE電泳圖；
[0013] 圖3:殼聚糖酶EAG1突變體的熱穩定性影響圖；
[0014] 圖4:殼聚糖酶EAG1突變體的熱滅活實驗圖。
【具體實施方式】
[0015] 下面結合實施例對本發明進行詳細的描述
[0016] 實施例1:殼聚糖酶EAG1突變體基因的獲得
[0017] 對殼聚糖酶EAGl(GenBank登錄號AB008788)進行突變，具體步驟如下：
[0018]①人工合成一段編碼7個氨基酸的且富含甘氨酸的核酸片段：
[0019] 5'-ggaggaggatccggaggagga-3';該片段編碼的氨基酸為-GGGSGGG-
[0020]②采用PCR擴增的方法將上述序列引入EAG1基因；其中正向引物為 [0021 ] 57 -ggaggaggatccggaggaggaatgcatatgtccaatgcgaaaccat-37 入片段），反向引物為5' -cttcatttcccagttcgtgacttgag-3'，模板為EAG1 基因。
[0022]將上述擴增后的含有插入片段的EAG1基因 16°C下用T4DNA連接酶連接12小時。反 應體系如下： EAG1突變基因 2 |iL T4 DNA ligase 1 uL
[0023] 1〇χΤ4 DNA ligase buffer 1 pL. 雙蒸水
[0024] ③將上述連接成環的EAG1突變基因進行酶切開環。所用酶為Dnasel，為保證整個 基因環只產生一個切口，所用Dnasel的量為每30yg加入1U Dnasel。
[0025] 反應體系如下： _EAG1突變環狀基因 2 μL UOpig) Dnasel 1 liL (1U)
[0026] 1〇χΤ4 DNA ligase buffer 1 μL 雙蒸水 6 pL
[0027] 將開環后的EAG1突變基因通過l%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收900-1000 之間的DNA片段。
[0028] ④設計二次擴增引物，其中正向引物為5' -atccggtacagcgtcgaacaagcgc-3'，反向 引物為5' -atacacgttatagaaggtttcccaca-3'。以上述瓊脂糖凝膠電泳回收的DNA片段為模 板，采用PCR的方法擴增獲得EAG1突變基因。
[0029] 反應體系（50μ1)如下： !〇χ buffer 5.0 μL dN'TPs (2.5 mM) 4.0'uL 正向引物（50 mM) 1,0 μL
[0030] 反向引物（50 mM) 1.0 μΕ Taq DNA polymerase 0.5 μL? 模板 1.0 μL^ Η20 37.5 μL
[0031] 最終獲得的殼聚糖酶EAG1突變體的基因序列，該序列含有927個堿基(SEQ ID Ν0: 2)，編碼309個氨基酸（SEQ ID NO: 1)，它與EAG1相比，不僅蛋白的一、二級結構排布順序不 同，而且增添了 一段富含甘氨酸的柔性序列（圖1)。
[0032] 實施例2殼聚糖酶EAG1突變體基因的表達與蛋白純化
[0033] 將實施例1得到的殼聚糖酶EAG1突變體基因與表達載體pIC9K連接通過電轉化的 方法轉入畢赤酵母GS115中。電穿孔轉化電擊條件：電壓：1500V;電阻:400 Ω ;電容:25yF;脈 沖時間：10mS;l-2次電擊。
[0034] 將含有突變基因的轉化子接入到BMGY液體培養基中，250-300rpm，28°C培養0D600 至12-16之間時；3000rpm，離心5分鐘，棄上清，收集細胞轉移到20mL BMMH液體培養基中， 20mLBMMY需使用100mL搖瓶配置，保證一定的通氣量，28°C繼續培養;每隔24小時在培養基 中加入100 %甲醇至終濃度為0.5 %。培養96小時，將發酵上清液離心，用lOKDa超濾膜濃縮， 經離子交換柱與分子篩進行純化，得到了電泳純的EAG1突變體樣品。
[0035]實施例3:殼聚糖酶EAG1突變體的酶學性質 [0036]①殼聚糖酶EAG1突變體的分子量
[0037]將純化后的EAG1突變體樣品進行不連續十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE) 凝膠電泳，結果如圖2所示。通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測為一條電泳帶，根據已知分 子量的標準蛋白質SDS-PAGE電泳圖譜進行比較，EAG1突變體的分子量約為34000道爾頓 (34kDa)，該酶為單體蛋白。
[0038]②純化后EAG1突變體的熱穩定性與50°C下半衰期
[0039]將純化后的EAG1突變體分別置于40-60°C范圍內孵育30分鐘，隨后轉移至冰上冷 卻5分鐘，37°C條件下測定殘余的殼聚糖酶活力，結果見圖3AAG1突變體的熱穩定性與EAG1 相比有了明顯的提高。50°C下的酶活性保持在81%以上。
[0040] 將純化后的EAG1突變體置于50°C孵育0-80分鐘，隨后轉移至冰上冷卻5分鐘，37度 條件下測定殘余的殼聚糖酶活力，結果見圖4。50°(：下EAG1突變體的半衰期明顯提高，EAG1 在50°C下保溫10分鐘，酶活力下降了50%，保溫50分鐘后酶活力下降了95%』AG1突變體50 °C下半衰期提高到70分鐘，比EAG1提高了 7倍。
[0041]③殼聚糖酶的活力測定：
[0042]殼聚糖酶的活力測定采用二硝基水楊酸(DNS)方法。酶活單位定義：1U表示在上述 條件下每分鐘釋放lymol還原糖所需要的酶量。
[0043] 為測定殼聚糖酶EAG1突變體對殼聚糖的Km和Vmax，將0.5mL不同濃度的殼聚糖溶 液(5、7.5、10、15、20mg/mL)分別與Ο. lmL殼聚糖酶EAG1突變體(最終酶濃度5. OU/mL)混合。 37 °C反應lOmin，加入4 · OmL 10 % TCA溶液終止反應。根據雙倒數作圖法(Lineweaver-Burk) 以1 /[S]為橫坐標1 /v為縱坐標作圖，直線的的斜率為Km/Vmax，截距為1 /Vmax，計算出動力 學常數Km和最大反應速度Vmax(表1)。與EAG1相比，EAG1突變體的最大反應速度(Vmax)與催 化效率(Kcat/Km)分別提高了 142%與203%。
[0044] 表1 :EAG1與EAG1突變體的動力學參數表
[0045]
[0046] 結果表明殼聚糖酶EAG1突變體特異性強，可以以內切方式有效的打斷殼聚糖中的 β_1，4糖苷鍵。每克殼聚糖添加1.0U單位的EAG1突變體，45°C下水解4個小時，可以將殼聚糖 完全分解成聚合度2-8糖的殼寡糖，水解率達到95%以上。
【主權項】
1. 一種殼聚糖酶突變體，其特征在于，所述的突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1。2. -種基因，其特征在于，所述的基因編碼權利要求1所述的殼聚糖酶突變體。3. 如權利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:2。4. 一種重組表達載體，其特征在于，所述的重組表達載體攜帶有權利要求2或3所述的 基因。5. -種重組菌，其特征在于，所述的重組菌為轉化/轉染有權利要求4所述的重組表達 載體的宿主菌。6. 如權利要求5所述的重組菌，其特征在于，所述的宿主菌為畢赤酵母。
【專利摘要】本發明提供了一種殼聚糖酶EAG1突變體，其氨基酸序列為SEQ？ID？NO:1。本發明的該突變體與殼聚糖酶EAG1相比，具有更優良的熱穩定性與更高的催化效率，對殼聚糖具有快速分解能力。通過對含有突變體基因的酵母工程菌的高效異源表達，可實現殼聚糖酶EAG1突變體的規模化制備。
【IPC分類】C12N1/19, C12R1/84, C12N9/42, C12N15/81, C12N15/56
【公開號】CN105602921
【申請號】CN201610212888
【發明人】盛軍, 沙珍霞, 鄭媛, 紀曉峰, 王致鵬
【申請人】中國水產科學研究院黃海水產研究所
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2016年4月7日