專利名稱：Nr2b重組腺病毒疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物制劑，具體涉及一種攜帶有NR2B抗原 基因的NR2B重組腺病毒疫苗。技術背景神經病理性疼痛是神經系統原發性損傷或功能異常所 導致的痛覺異常或痛覺過敏。創傷、缺血性損傷、感染或炎癥、腫瘤、 藥物和壓迫等原因均可以引起神經病理性疼痛。非甾體類抗炎藥和阿 片類鎮痛藥治療神經病理性疼痛的效果差，臨床上常使用三環類抗抑 郁藥和抗癲癇藥物進行治療，但療效差，副作用大，能夠有效緩解50 %以上疼痛癥狀的患者不足50%。因此尋找一種安全有效、作用持久 的鎮痛方法已成為神經病理性疼痛研究的重要方向。神經病理性痛的受體機制研究表明，神經元和神經膠質細胞膜上 的N-甲基一D—天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate rec印tor， 麗DAR)表達上調或過度激活可引起中樞敏感化，在神經病理性痛的 產生如自發性痛、觸誘發痛及痛覺過敏等起重要作用。NMDA受體拮抗 劑如氯胺酮、MK-801等對神經病理性痛具有良好的鎮痛作用，但由于 這些藥物具有如認知功能障礙、神經空泡樣改變等副作用限制了它們 的臨床廣泛應用。近期研究表明，麗DA受體亞型——NR2B型麗DA受體 (NR2B)在體內呈選擇性分布，主要集中于脊髓背角、前腦等與痛傳 遞和痛情緒有關的區域，與痛感覺和痛情緒的形成密切相關，這提示 NR2B可能是一個潛在的鎮痛治療的靶點。據此，以NR2B為抗原制備疫 苗誘導機體產生NR2B抗體，該抗體與神經元或膠質細胞膜上的NR2B結合，下調NR2B的表達或阻斷NR2B的激活，可能發揮鎮痛作用。現在疫苗技術的發展提供了一種新的免疫方法一一基因疫苗。基 因疫苗作為第三代疫苗，構建和改造相對方便，抗原性強，且保護時 間長。重組腺病毒載體是目前最常用的基因疫苗載體之一，具有感染 滴度高、熱穩定性好、基因容量大、可以口服、能產生粘膜免疫等諸 多優點。因此，構建NR2B重組腺病毒(Recombinant adenovirus serotype 5 encoding NR2B gene， rAd5/NR2B)鎮痛疫苗，并通過口 服免疫，可能對神經病理性痛痛感覺和痛情緒產生抑制作用。
發明內容
本發明的目的是為了解決上述背景技術存在的不足， 提出一種攜帶有NR2B抗原基因的NR2B重組腺病毒疫苗，使其為神經病 理性痛的治療開辟了新途徑。本發明所述NR2B重組腺病毒疫苗是通過將服2B基因插入腺病毒 載體構建的，其保藏號為CCTCC NO: V200713,保藏單位中 國武漢大學中國典型培養物保藏中心，保藏日期2007年11月23日， 分類命名；腺病毒血清5型(C12N15/861) Adenovirus V type。 所述NR2B基因插入腺病毒載體的方法是1) 分別取NR2B基因質粒和腺病毒穿梭pDC515，以EcoR I和BamHI雙酶切后經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，再利用低熔點瓊脂糖挖塊法 純化回收目的基因片段NR2B和載體片段pDC515，在T4DNA連接酶作用 下獲得質粒pDC515-NR2B;2) 以攜帶NR2B基因的腺病毒穿梭質粒p515-NR2B和腺病毒骨架 質粒pBHGfrt(del)El, 3FLP共轉染腺病毒包裝細胞293，獲得NR2B重組腺病毒；3)通過上述293細胞大量擴增重組腺病毒，并采用氯化銫溴化 乙錠平衡密度梯度離心純化法，得到大量高滴度高純度的NR2B重組腺 病毒疫苗。 '本發明所述NR2B重組腺病毒疫苗的特征疫苗名稱NR2B重組腺病毒疫苗(Recombinant adenovirus serotype 5 encoding NR2B gene, rAd5/NR2B vaccine)病毒種名(Species):雙鏈DNA病毒(一種復制缺陷、非輔助病 毒依賴型載體)血清型Ad5分子生物學特性腺病毒顆粒是二十面體的無包膜雙鏈DNA病毒， 直徑為70-90um，基因組大小為36kb。該疫苗是復制缺陷型重組腺病 毒，無致瘤性。rAd5/NR2B經擴增和純化后的滴度及純度rAd5/服2B經大量擴增 及純化后滴度達到5X10"(V.P./ml)，純度(HPLC法測定)達到IOO/o 。將NR2B基因插入腺病毒載體，成功構建NR2B重組腺病毒疫苗 rAd5/NR2B。該疫苗口服免疫可誘導機體產生高滴度的NR2B抗體，其 滴度和持續時間優于多肽疫苗。rAd5/NR2B疫苗口服免疫不但對神經 病理性痛痛感覺產生超前鎮痛作用，而且對神經病理性痛伴隨的痛情 緒反應也有抑制作用。本發明用途及意義.直接用途通過口服免疫對大鼠神經病理性痛具有鎮痛作用。 間接用途可作為一種載體用于NR2B基因相關機制的研究。 本發明對基因疫苗治療神經病理性痛具有重要的參考價值。
圖l是rAd5/NR2B感染293細胞后出現的病毒空斑(標尺100um)。 圖2是rAd5/NR2B的PCR鑒定。其中，M . DL2000Marker ; 1. rAd5/NR2B原液；2. rAd5/NR2B稀釋10倍；3. rAd5/NR2B稀釋100 倍；4. rAd5/NR2B稀釋1000倍；5.陽性對照pDC515-NR2B質粒；6.陰性對照。圖3是rAd5/NR2B的RT-PCR鑒定。其中，M. 100bpMarker; 1.未 感染rAd5-NR2B的293細胞；2.感染rAd5-NR2B的293細胞。圖4是rAd5/NR2B的ImmunobloUing鑒定。其中，1.感染rAd5/NR2B 的293細胞；2.未感染rAd5/NR2B的293細胞。圖5是免疫后10周內各組大鼠血清NR2B抗體滴度的改變。圖6是各組大鼠機械觸誘發痛的比較。與術前比較，#代0.05; 與naive組和rAd5/EGFP組相比，*代O. 05圖7是各組大鼠各時間點熱痛縮爪時間變化的比較。與術前比較， #P〈0. 05;與na'ive組和rAd5/EGFP組相比，*P〈0. 05。圖8是各組免疫大鼠SNI條件性位置回避時間的比較。與na'ive 和rAd5/EGFP組比較，*尸<0. 05。 具體實施步驟一、NR2B重組腺病毒(rAd5/NR2B)的構建1. rAd5/NR2B的包裝分別取質粒pcDNA3. l-NR2B (由浙江大學神經生物研究所羅建紅 教授惠增)和腺病毒穿梭pDC515,以EcoRI禾卩BamHI雙酶切后經lX 瓊脂糖凝膠電泳分離，再利用低熔點瓊脂糖挖塊法純化回收目的基因 片段NR2B和載體片段pDC515，在T4DNA連接酶作用下獲得質粒 pDC515-NR2B，并行酶切、電泳及DNA測序鑒定，證實穿梭質粒 pDC515-NR2B構建成功；在脂質體介導下將pDC515-NR2B轉染293細胞，并通過RT-PCR及 Western blotting方法分別從轉錄水平和翻譯水平檢測到目的基因 NR2B在包裝細胞293中能夠有效表達；以攜帶NR2B基因的腺病毒穿梭質粒p515-NR2B和腺病毒骨架質粒 pBHGfrt(del)El， 3FLP共轉染腺病毒包裝細胞293， 12天后可見293細 胞變圓并逐漸從壁上脫落，細胞核占據細胞大部分，形成所謂的細胞 病理效應(CPE) ， 15天后較多出現CPE的細胞聚集在一起形成肉眼可 見的病毒空斑(圖l),表明rAd5/NR2B包裝成功。2. rAd5/NR2B的鑒定病毒空斑出現后，挑取病毒空斑再感染293細胞提取病毒DNA、RNA 及蛋白，分別以PCR、 RT-PCR及western blotting從基因水平、轉錄 水平和蛋白水平對病毒空斑進行鑒定和篩選①分別以rAd5/NR2B原液、10倍、100倍，1000倍稀釋液的PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示600bp處均可見到特異性DNA 條帶，與陽性對照pDC515-NR2B的結果相同，而陰性對照(未用病毒感染的293細胞上清)未見到相應條帶(圖2),證明重組腺病毒中含有NR2B目的基因。② 以被rAd5/NR2B感染的293細胞的RNA行RT- PCR反應，可擴 增出600bp大小的DNA條帶，而未感染病毒rAd5/NR2B的293細胞未 擴增出相應條帶(圖3)，表明重組腺病毒中NR2B基因在轉錄水平表達正常。③ 提取rAd5/NR2B感染293細胞的蛋白進行western blotting 檢測，結果顯示感染病毒rAd5/NR2B的293細胞有180kDa的蛋白條 帶，而未感染該病毒的293細胞無此蛋白條帶(圖4)，證明重組腺 病毒中NR2B基因能夠正常表達翻譯為蛋白質。以上的結果證實我們構建的NR2B重組腺病毒(rAd5/NR2B)不僅 結構完整，而且在293細胞內能夠有效表達。之后，通過293細胞大量 擴增重組腺病毒，并采用氯化銫溴化乙錠平衡密度梯度離心純化法， 得到大量高滴度高純度的rAd5/NR2B。 二、 rAd5/NR2B口服免疫對神經病理性痛的鎮痛作用大鼠口服rAd5/NR2B (1X10"PFU)免疫，2周后以相同劑量加強 免疫一次。分別于免疫后2、 4、 6、 8、 10、 15周截尾法取血0. 5 1. 0ml 離心取血清檢測免疫血清NR2B抗體的滴度。結果口服rAd5/NR2B免疫 后兩周，血清NR2B抗體的滴度為5.5士1.9ug/ml， 4周后升高至13.4 ±3.2ug/ml (圖5)，并能夠持續到10周以后，提示機體對該疫苗產 生了較強的免疫應答。加強免疫后2周，結扎大鼠左側坐骨神經的脛神經和腓總神經分支，保留腓腸神經，建立SNI模型。術后隔日檢測大鼠術側后爪機械
痛閾和熱痛縮爪時間的改變，結果發現自SNI模型建立后7天開始至42 天，rAd5/NR2B免疫組機械觸誘發痛明顯高于空白組及rAd5/EGFP組
(圖6)，且熱痛縮爪時間明顯縮短(圖7)，提示該疫苗對神經病理 性痛機械觸誘發痛和熱痛覺過敏具有抑制作用。進一步通過大鼠SNI 條件性位置回避實驗發現，疫苗rAd5/NR2B免疫對神經病理性痛時的 痛情緒反應有抑制作用(圖8)。
以上結果證明重組腺病毒疫苗rAd5/NR2B口服免疫可誘導產生 高滴度的NR2B抗體，其滴度高且持續時間長；rAd5/NR2B疫苗口服 免疫不但對神經病理性痛痛感覺產生超前鎮痛作用，而且對神經病理 性痛伴隨的痛情緒反應也有抑制作用。
本發明采用重組腺病毒制備技術，將NR2B基因插入腺病毒重組載 體，成功構建NR2B重組腺病毒疫苗，并從痛感覺和痛情緒兩方面觀察 了該疫苗具有鎮痛作用，為神經病理性痛的治療開辟了一嶄新途徑。
使用本疫苗行免疫鎮痛，對神經病理性痛不但具有預防作用，而 且具有選擇性，即未發生神經病理性痛時，產生的抗體在血腦屏障的 阻礙下不會進入脊髓和ACC。但發生了神經病理性痛后，血腦屏障通 透性增加，NR2B特異性抗體便進入神經中樞發揮鎮痛作用。
權利要求
1、一種NR2B重組腺病毒疫苗，該疫苗是通過將NR2B基因插入腺病毒載體構建的，其保藏號為CCTCC NOV200713。
2、 根據權利要求1所述的NR2B重組腺病毒疫苗，其特征是將 NR2B基因插入腺病毒載體，具體方法是1) 分別取NR2B基因質粒和腺病毒穿梭pDC515，以EcoR I禾nBamH I雙酶切后經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，再利用低熔點瓊脂糖挖塊法純化回收目的基因片段服2B和載體片段pDC515，在T4DNA連接酶作用 下獲得質粒pDC515-NR2B;2) 以攜帶NR2B基因的腺病毒穿梭質粒p515-NR2B和腺病毒骨架 質粒pBHGfrt(del)El， 3FLP共轉染腺病毒包裝細胞293，獲得NR2B重組 腺病毒；3) 通過上述293細胞大量擴增重組腺病毒，并采用氯化銫溴化 乙錠平衡密度梯度離心純化法，得到大量高滴度高純度的NR2B重組腺病毒疫苗。
全文摘要
本發明涉及一種NR2B重組腺病毒疫苗，該疫苗是通過將NR2B基因插入腺病毒載體構建的，其保藏號為CCTCC NOV200713。本發明采用重組腺病毒制備技術，將NR2B基因插入腺病毒重組載體，成功構建NR2B重組腺病毒疫苗，并從痛感覺和痛情緒兩方面觀察了該疫苗具有鎮痛作用，為神經病理性痛的治療開辟了一嶄新途徑。
文檔編號A61P25/00GK101306198SQ20071016896
公開日2008年11月19日 申請日期2007年12月20日 優先權日2007年12月20日
發明者輝 楊, 楊少兵, 王公明, 田學愎, 田玉科, 峰 高 申請人:華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院