一種用于恩拉霉素微生物效價測定的檢定培養基的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種一種用于恩拉霉素微生物效價測定的檢定培養基，更具體地，本 發明涉及一種檢定恩拉霉素效價的培養基制備方法。
【背景技術】
[0002] 恩拉霉素，又名恩來霉素、安來霉素、恩霉素、持久霉素，系1966年自日本兵庫縣西 宮市土壤中分離出來的放線菌Streptomyces fungicidious N0.B5477發酵產生的一種多 肽類抗生素。恩拉霉素是由包括13個不同種類的17個氨基酸分子和脂肪酸分子所組成的有 機堿，主要成分為恩拉霉素 A和恩拉霉素 B，還有少量的C和D組分。
[0003] 恩拉霉素具有廣泛的抗革蘭氏陽性菌活性、優良的促生長、改善飼料利用率作用 及其低毒低殘留等優點，在臨床上常把恩拉霉素作為禽、豬、魚的抗生素促生長劑。恩拉霉 素作為一種新型肽類抗生素，具有廣譜、無殘留、不產生耐藥性等優點，已成為新型抗生素 的來源。
[0004] 目前，恩拉霉素含量測定主要有HPLC法和微生物檢定法(管碟法）APLC測定恩拉 霉素的文獻如ZL 201010226506.6、ZL201010528367.2和ZL 201410105471.9等，用恩拉霉 素 A和恩拉霉素 B作為標準品，雖然HPLC測定恩拉霉素的方法操作相對簡單，但是HPLC測定 恩拉霉素的方法還不是通用標準，國內和國際上還是不太認同該方法，同時涉及的HPLC儀 器價格也比較昂貴。現在我國國家標準和國際上通用的恩拉霉素含量測定標準仍然是微生 物檢定法，可能與恩拉霉素成分復雜，用其中主要成分恩拉霉素 A和恩拉霉素 B標定的HPLC 方法不能夠完全反應出產品的質量有關。
[0005] 在公開的關于恩拉霉素檢測方法的文獻中，微生物檢定法(管碟法)耗時長，高濃 度和低濃度抑菌圈差異不顯著，檢測范圍受限等缺陷。朱曦等的《恩拉霉素含量測定方法的 改進》通過對樣品提取、緩沖液及終濃度等檢測條件進行優化，使改進后標準品高濃度抑菌 圈直徑范圍在18-22_之間，大小圈差異明顯，使得檢測結果更精準。劉雅妮等的《恩拉霉素 預混劑含量測定方法的改進》將《進口獸藥質量標準》檢測方法中pH值4.0的醋酸鹽緩沖液 改為pH值7.8的磷酸鹽緩沖液，將儲備液濃度由1000單位/mL降低為200單位/mL，提取時間 延長至2~3h，對培養基組成、菌濃、緩沖液、樣品提取液和提取時間等檢測條件進行優化， 找出抑菌圈大小合適，邊緣清晰的試驗條件，提高了測定的準確性。雖然如此，但是發明人 發現現有技術的恩拉霉素微生物鑒定法的抑菌圈邊緣模糊的缺陷并沒有沒消除，而測量抑 菌圈直徑是取得試驗結果的重要環節，抑菌圈的模糊會使的測定誤差大。

【發明內容】

[0006] 為了克服管碟法的邊緣不清晰的缺陷，本發明提供一種恩拉霉素微生物效價測定 的檢定培養基，更具體地，本發明涉及一種恩拉霉素微生物效價測定的檢定培養基制備方 法，以及新的檢定培養基在恩拉霉素微生物效價測定中的應用。
[0007] 抑菌圈邊緣清晰度是影響測定結果的主要因素，導致抑菌圈邊緣不清晰的原因有 多種，在抑菌圈形成過程中抗生素的擴散系數紊亂、不均一，不符合動力學公式中各項之間 的關系或各擴散系統交叉，如培養基原材料的成分及質量、pH值、鹽濃度及培養時間均可影 響抑菌圈邊緣的清晰度;多組分抗生素例如恩拉霉素中，各組分抗菌活性的不同，擴散系數 也不同，其交叉作用影響抑菌圈邊緣的清晰度。
[0008] -種恩拉霉素檢定培養基，其特征在于所述培養基按重量計包括蛋白胨5份、肉膏 3-5份、NaCl 18-20份、磷酸氫二鈉2.2-3.5份、瓊脂14份。
[0009] 優選的，所述恩拉霉素檢定培養基按重量計包括蛋白胨5份、肉膏4.4份、NaCl 20 份、磷酸氫二鈉2.4份、瓊脂14份。
[0010] 優選的，所述恩拉霉素檢定培養基pH值為7.8-8.1.
[0011] -種恩拉霉素檢定培養基，其特征在于所述培養基的制備方法包括：（1)稱取蛋白 胨5份、肉膏3-5份、NaCl 18-20份、磷酸氫二鈉2.2-3.5份、瓊脂14份，加蒸餾水使成1000mL 混合物；
[0012] ⑵用6M NaOH試液調步驟（（1)所述的1000mL混合物pH值，使滅菌后1000mL混合物 的pH值為7.9~8.1，混合物分裝。
[0013] (3)滅菌:將分裝的混合物高壓蒸汽滅菌，貼上標簽備用。
[0014]優選的，所述培養基的制備方法包括：（1)稱取蛋白胨5份、肉膏4.4份、NaCl 20份、 磷酸氫二鈉2.4份、瓊脂14份，加蒸餾水使成1000mL混合物；
[0015] ⑵用6M NaOH試液調步驟（（1)所述的1000mL混合物pH值，使滅菌后1000mL混合物 的pH值為7.9~8.1，混合物分裝。
[0016] (3)滅菌:將分裝的混合物高壓蒸汽滅菌，貼上標簽備用。
[0017] 發明人意外的發現，本發明使用所述的恩拉霉素檢定培養基培養后得到的抑菌圈 邊緣清晰，無雙圈，無莢膜，抑菌圈直徑適中，大大減少了測定誤差。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合具體實施例詳細描述本發明，但這些實施例僅是示例性的，并不對本發 明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下 可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的 保護范圍內。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照廠 商所建議的條件。
[0019] 實施例1 [0020] 1 準備
[0021] 1.1試液的準備
[0022]按照常規方法制備pH7.8磷酸鹽緩沖液、6m〇VL氫氧化鈉試液、1N鹽酸試液、丙酮-0.1N鹽酸-水混合液、0.1 %新潔爾滅溶液、75%乙醇溶液。
[0023] 1.2檢定培養基的制備
[0024] (1)稱取蛋白胨、肉膏、NaCl、磷酸氫二鈉、瓊脂，加蒸餾水使成1 OOOrnL混合物；
[0025] (2)用6M NaOH試液調步驟（（1)所述的1000mL混合物pH值，使滅菌后1000mL混合物 的pH值為7.9~8.1，混合物分裝。
[0026] (3)滅菌:將分裝的混合物高壓蒸汽滅菌，貼上標簽備用。
[0027] 1.3平皿的制備
[0028] A、將配制好的檢定培養基加熱溶解。
[0029] B、將培養皿平鋪在水平臺上，用量杯取培養基于培養皿中呈水平狀擴散，放置使 之凝固作底層。
[0030] C、底層所需培養基作菌層培養基并保溫在水浴鍋中。用時取出，待冷卻后往菌層 培養基里加試驗菌懸液，充分混合。
[0031] D、在上述盛有底層培養基的平板中，分別加入試驗菌懸液的菌層培養基5mL。用陶 瓦蓋蓋上，放置備用。
[0032] 1.4接種物的制備(枯草芽孢桿菌CMCC53501，購自中國獸醫藥品監察所）
[0033] A、將接種好的增殖培養基斜面的茄子瓶倒過來，在36±1°C的電熱恒溫培養箱中 培養7天。
[0034] B、培養結束后，從電熱恒溫培養箱中取出，取一支加滅菌水約40mL，從培養基的斜 面洗下菌苔制成芽孢懸液，并倒回至滅菌大試管中。
[0035] C、將大試管放進65±1°C的電熱恒溫水浴鍋里，加熱30分鐘待冷后放入冰箱（1~ l〇°C)貯藏，這稱為枯草芽孢桿菌菌懸液，保存期限為3個月。
[0036] 2.儀器設備TOMY ES215高壓蒸汽滅菌鍋;干燥箱;恒溫培養箱;ZY-300IV多功能微 生物自動測量分析儀，北京先驅威鋒技術開發公司生產。
[0037] 3.恩拉霉素樣品效價測定
[0038] A、吸取適量對照品儲備液（1000ug/mL)，用PH7.8磷酸鹽緩沖液精確定量稀釋，配 制成低稀釋度（高濃度)40u/mL的恩拉霉素對照品溶液和高稀釋度(低濃度）10u/mL的恩拉 霉素對照品溶液
[0039] D、按前面方法制備好平皿，把鋼圈放置在平板上，每個平板均一地放置4個鋼圈。
[0040] E、點樣:每份取8張平板，往平板上相對的2個鋼圈中注入對照品稀釋液(40u/mL)， 其它2個鋼圈中注入對照品稀釋液(10u/mL)。
[0041 ] F、培養:在36 ± 1°C的隔水式電熱恒溫培養箱里培養16-18小時。
[0042] G、培養結束后，從培養箱里取出平板，拆下鋼圈。
[0043] 步驟1.2中檢定培養基的組分如下表1所示：
[0044] 表1:檢定培養基組分
[0046]實驗結果：培養基2和培養基5的平皿，產生的抑菌圈邊緣模糊或不整齊，產生雙 圈，與菌層反差不夠明顯;培養基3的抑菌圈呈現心形或橢圓形，抑菌圈邊界比培養基2和培 養基5的抑菌圈邊緣清楚，但是仍然可以看到雙圈，與菌層反差比比培養基2和培養基5的得 到改善;培養基4的高濃度和低濃度抑菌圈直徑差異不大，并且邊緣模糊，不利于測量;培養 基1平皿上的抑菌圈邊緣比培養2-5都清楚，無雙圈，無莢膜，并且抑菌圈性狀為規則的圓 形，抑菌圈直徑適中，高低濃度的抑菌圈差異較大。基于此實驗結果發明人將在培養基1的 基礎上進行進一步的精密實驗，以找出更加合適的恩拉霉素檢定培養基成分配方。
[0047] 實施例2
[0048]按照實施例1的步驟1和2準備實驗。另外，為了找出更加合適的恩拉霉素檢定培養 基成分配方，發明人根據實施例1中培養基1成分配方進行了調整。
[0049]按照實施例1的步驟1和2完成準備實驗后，按照以下步驟進行操作：
[0050] A、吸取適量對照品儲備液（1000ug/mL)，用PH7.8緩沖液精確定量稀釋，配制成低 稀釋度(高濃度)40u/mL的恩拉霉素對照品溶液和高稀釋度(低濃度）1 Ou/mL的恩拉霉素對 照品溶液
[0051] B、稱量:精密地稱取恩拉霉素預混劑樣品適量于具塞三角瓶中（共6個）。
[0052] C、溶解與稀釋：用酸式滴