抗逆相關基因ZmHDZIV14在調控植物抗逆性中的應用方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種增強植物抗旱抗逆性的基因；本發明還涉及所述基因在改良植物 對干旱脅迫抗性方面的應用方法。
【背景技術】
[0002] 同源異型域-亮氨酸拉鏈(HD-Zip)是植物所特有的一類轉錄因子，廣泛存在于多 種植物中，不僅在高等植物生長發育、形態建成中發揮重要作用，同時調控植物對生物和非 生物脅迫等逆境的響應過程。擬南芥中的AtHDGll基因編碼一個屬于HD-ZipIV類家族的轉 錄因子，該基因的表達可促進根的伸長和氣孔關閉從而提高植物耐旱性，已有的研究表明 轉AtHDGll基因的擬南芥、煙草和草坪草均表現出較強的耐旱性。目前已經鑒定出玉米HD-Zip IV類轉錄因子基因 17個，進化分析表明ZmHDZIV14基因與AtHDGll基因的同源性較高， 推測這兩個基因與AtHDGll基因有相似的功能。但是目前對于玉米HD-Zip IV基因家族的研 究還較少，主要是其在植物不同組織的表達模式和在植物外表皮及毛狀根發育過程中的研 究，其生理功能特別是在環境脅迫中的生理功能還未見報道。本研究根據NCBI數據庫中與 AtHDGll基因同源的玉米HD-Zip IV基因 ZmHDZIV14的cDNA序列。研究了ZmHDZIV14基因克 隆，生物信息學分析及植物表達載體構建，并將這個基因轉入植物，從而快速獲得具有抗逆 性狀的轉基因植物。

【發明內容】

[0003] 本發明的目的是提供一種增強植物抗逆相關蛋白及其編碼基因；本發明的第二目 的是提供一種增強植物抗逆相關蛋白及其編碼基因的應用方法。
[0004] 本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：一種增強植物抗逆相關蛋白，名稱 為ZmHDZIV14,來源于玉米(Zea mays L.)自交系B73,是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋 白質： (1) 序列表中SEQ ID:2; (2) 序列表中SEQ ID:2的氨基酸殘基序列經過一個或者幾個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且與植物抗逆相關的蛋白質。
[0005] 其中，序列SEQ ID:2由692個氨基酸殘基組成。
[0006] 所述一個或者幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個氨基 酸的取代和/或缺失和/或添加。氨基酸優先取代如表1所示。
[0007]
上述ZmHDZIV14增強植物抗逆相關蛋白的編碼基因也屬于本發明的保護范圍。
[0008] 上述ZmHDZIV14增強植物抗逆相關蛋白的編碼基因具有下述核苷酸序列之一： (1) 序列表中SEQ ID NO: 1的核苷酸序列； (2) 編碼序列表中SEQ ID N0:2蛋白質序列的DNA; (3) 與序列表中SEQ ID NO: 1的DNA序列具有90%以上同源性，切編碼相同功能蛋白質的 DNA序列； (4) 在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQ ID NO: 1限制的DNA序列雜交的核苷酸序列。
[0009] 上述高嚴謹條件為在0.1 X SSC，0.1 X SDS的溶液中，在65°C下雜交并洗膜;其中， 序列表中的SEQ ID NO: 1由2079個脫氧核苷酸組成。
[0010] 含本發明基因的重組表達載體、轉基因細胞及工程均屬于本發明的保護范圍。
[0011] 本發明的第二目的是通過以下技術方案來實現的：一種增強植物抗逆相關蛋白的 編碼基因的應用方法;其特征在于:將攜帶有本發明的ZmHDZIV14基因的表達載體，通過使 用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、微注射、電導、農桿菌介導等常規生物方法 轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物經組織培育成植株，獲得抗旱抗逆性提高的植株。
[0012] 本發明的ZmHDZIV14基因可用現有的方法構建到現有的植物表達載體中，可在其 轉錄超始核苷酸前加包括組成型啟動子、增強啟動子、誘導型啟動子、組織特異性啟動子、 發育階段特異性啟動子在內的任何一種啟動子。為了便于對ZmHDZIV14基因植物細胞或植 物進行鑒定及篩選，可對所使的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記(bar基因、GUS基 因、熒光素酶基因等)或具有抗性的抗生物素標記物(慶大霉素、卡那霉素等）。被轉化的植 物宿主既可以是單子葉植物，也可以使雙子葉植物，如:水稻、小麥、玉米、煙草、擬南芥等。
[0013] 攜帶有本發明的ZmHDZIV14基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒 載體、直接DNA轉化、微注射、電導、農桿菌介導等常規生物方法轉化植物細胞或組織，并將 轉化的植物經組織培育成植株，獲得抗逆性提高的植株。
[0014] 實驗證明，在逆境條件下，轉ZmHDZIV14擬南芥比野生型擬南芥具有較強的抗旱 性。在干旱脅迫條件下，轉基因擬南芥存活率、生物量和相對含水量均高于非轉基因植株， 同時脯氨酸含量得到提高，丙二醛含量降低。
[0015] 將本發明的植物抗逆性相關蛋白的編碼基因按常規方法轉入其他植物中，可增強 植物的抗旱性。
【附圖說明】
[0016] 圖1為玉米ZmHDZIV14基因全長PCR擴增產物； 圖2為載體pUCm-T-ZmHDZIV14的酶切鑒定； 圖3 為載體 pCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV14-bar 的酶切鑒定； 圖4為6個限制性酶BamH I、EcoR I、Hind III、Sma I、Xba I、Sac I消化擬南芥基因組 的對比圖； 圖5為玉米和擬南芥HD-Zip IV型轉錄因子基因編碼蛋白的進化分析； 圖6為玉米ZmHDZIV14和擬南芥AtHDGll基因編碼蛋白序列的同源性比較； 圖7為植株表達載體PCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV14-bar的構建過程； 圖8為玉米ZmHDZIV14基因轉基因擬南芥獲取過程(A表示野生擬南芥種植;B表示花 序侵染后擬南芥;C表示T0代混收種子;D表示T1代抗性苗;E表示T2代抗性苗;F表示T3代抗 性苗）； 圖9為轉基因擬南芥的PCR鑒定(M為DNA Marker D5000; CK+為陽性對照;CK一為陰性對 照；1-10為抗性植株）； 圖10為部分經PCR檢測的陽性轉基因擬南芥植株的Northern blot分析結果，雜交結果 表明SEQ ID NO: 1核苷酸序列能在轉基因擬南芥中表達； 圖11為20%PEG對ZmHDZIV14轉基因擬南芥幼苗生長的影響； 圖12為20%PEG脅迫下ZmHDZIV14轉基因擬南芥存活率的影響； 圖13為20%PEG脅迫下ZmHDZIV14轉基因擬南芥生物量的影響； 圖14為20%PEG脅迫下ZmHDZIV14轉基因擬南芥相對含水量的影響； 圖15為20%PEG脅迫下ZmHDZIV14轉基因擬南芥和野生擬南芥中丙二醛含量； 圖16為20%PEG脅迫下ZmHDZIV14轉基因擬南芥和野生擬南芥中脯氨酸含量。
【具體實施方式】
[0017] 下述實施中的方法，如無特別說明，均為常規方法。
[0018] 實施例l、ZmHDZIV14蛋白及其編碼基因的獲得 野生型擬南芥(Arabidopsis 1:1^1丨31^，(]〇1)種子為甘肅省干旱生境作物學玉米重點 實驗室保存。
[0019] 菌株：大腸桿菌（Eschrichiacoli) DH5a，用于擬南芥遺傳轉化的根癌農桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)為LBA4404,兩個菌株均為甘肅省干旱生境作物學玉米重點 實驗室保存。
[0020] 質粒：T/A克隆載體pUCm-T購自生工生物工程（上海）有限公司，植物表達載體 PCAMBIA3300-35S-PR0II MCS-bar為甘肅省干旱生境作物學玉米重點實驗室改造，卡那抗 性用于T/A克隆。
[0021 ] 實施例1;SEQ ID N0:2蛋白及其編碼基因的獲得 菌株：大腸桿菌（Eschrichiacoli) DH5a，用于煙草遺傳轉化的根癌農桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)為LBA4404,兩個菌株均為甘肅省干旱生境作物學玉米重點 實驗室保存。
[0022]質粒：T/A克隆載體pUCm-T購自生工生物工程（上海）有限公司，植物表達載體 PCAMBIA3300-35S-PR0II MCS-bar為本實驗自己改造，卡那抗性用于T/A克隆。
[0023] 一、核苷酸序列SEQ ID NO: 1的克隆步驟如下： (一)玉米總RNA的提取與純化 玉米RNA的提取(Trizol法）： 實驗前準備工作:DEPC水的配置：1L水中加入lml的DEPC(DEPC體積份數是0.1%)，37°C 溫浴12h。高壓滅菌至少20min，滅菌2次，使DEPC徹底失活。PCR管，1.5ml離心管，2ml離心管， 各種槍頭等用DEPC水(未滅菌)浸泡，37°C過夜，次日滅菌備用。
[0024] 試劑:trizol，氯仿，異丙醇，75%乙醇(DEPC水配