一種功能化納米配合物基因導入材料及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因導入材料技術領域，具體涉及一種功能化納米配合物基因導入材料及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]隨著人類基因圖譜測定的完成，我們對人類疾病發病機制的認識在基因水平上取得了突破性的進展。目前研究表明，有許多疾病的發生及發展與基因密切相關。如果可以篩查出與疾病特異相關的基因片段或者基因突變，就可以有針對性地在基因水平上進行特異治療，如通過導入相關缺失基因或沉默基因，以增強相關缺失功能或者沉默致病基因，從而達到徹底治療的目的。將目的基因安全有效地導入生物體內是目前此研究領域中的關鍵和難點。
[0003]基因導入方法可以分為兩類:第一類是病毒型基因導入方法，是以逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒為載體;第二類是非病毒型基因導入方法，如顯微注射、基因槍、磷酸鈣共沉淀、陽離子脂質體法、以及利用新興的納米基因導入材料進行基因轉染。
[0004]病毒型基因導入方法存在許多嚴重的不足，例如病毒轉染時有可能激活原癌基因。因此，非病毒型基因導入方法是目前的研究熱點，但是，上述所述的非病毒型基因導入方法均存在不足:顯微注射一次只能處理一個細胞，其轉染效率非常低;基因槍的穿透力十分有限；磷酸鈣共沉淀法的轉染效率受溫度、濃度、操作環境等眾多因素影響，轉染結果很不穩定；陽離子脂質體法雖然表現出良好的轉染效率，但是陽離子脂質體因毒性高，使得陽離子脂質體法的應用受到了限制;現有技術中的納米基因導入材料存在生產成本高、制備用原料不易得、難以普及推廣應用的缺點。
【發明內容】
[0005]本發明的目的之一在于針對現有技術的不足，提供一種功能化納米配合物基因導入材料的制備方法。
[0006]本發明的目的之二在于針對現有技術的不足，提供一種功能化納米配合物基因導入材料。
[0007]本發明的目的之三在于針對現有技術的不足，提供一種功能化納米配合物基因導入材料的應用。
[0008]為了實現上述目的之一，本發明采用如下技術方案:
一種功能化納米配合物基因導入材料的制備方法，它包括以下步驟:
步驟一，硫酸亞鐵水溶液通氮氣:往硫酸亞鐵水溶液中通入氮氣；
步驟二，加入氟尿嘧啶水溶液:往步驟一中持續通入氮氣的硫酸亞鐵水溶液中加入氟尿嘧啶水溶液，然后在一定溫度下攪拌一定時間，得到混合物；
步驟三，超聲:對步驟二中得到的混合物繼續通入氮氣，然后對步驟二得到的混合物進tx超聲震蕩一定時間； 步驟四，靜置:對步驟三完成超聲震蕩后的混合物進行靜置一定時間；
步驟五，離心并烘干:對步驟四完成靜置的混合物進行離心，得到沉淀物，然后對沉淀物進行烘干，即制得功能化納米配合物基因導入材料。
[0009]上述技術方案中，所述步驟一硫酸亞鐵水溶液通氮氣步驟中，所述硫酸亞鐵水溶液的質量體積濃度為0.5g/L?5g/L。
[0010]上述技術方案中，所述步驟二加入氟尿嘧啶水溶液步驟中，所述氟尿嘧啶水溶液的摩爾濃度為0.05mol/L?0.5 mol/L。
[0011]上述技術方案中，所述步驟二加入氟尿嘧啶水溶液步驟中，所述硫酸亞鐵水溶液與所述氟尿嘧啶水溶液的摩爾比為I?5:1。
[0012]上述技術方案中，所述步驟二加入氟尿嘧啶水溶液步驟中，所述攪拌溫度為40°060°C，所述攪拌時間為20min?40min。
[0013]上述技術方案中，所述步驟三超聲步驟中，所述超聲震蕩的時間為Ih?4h;所述超聲震蕩的超聲波的頻率為30 kHz-50 kHz ο
[0014]上述技術方案中，所述步驟四靜置步驟中，所述靜置的時間為1h?15h。
[0015]上述技術方案中，所述步驟五離心并烘干步驟中，所述烘干的溫度為50°C~70°C，所述烘干時間為5h~7h。
[0016]為了實現上述目的之二，本發明采用如下技術方案:
一種功能化納米配合物基因導入材料，運用上述所述的一種功能化納米配合物基因導入材料的制備方法所制得的功能化納米配合物基因導入材料，所述功能化納米配合物基因導入材料為一種平均直徑為150nm左右的納米球狀材料。
[0017]為了實現上述目的之三，本發明采用如下技術方案:
提供一種功能化納米配合物基因導入材料的應用，上述所述的一種功能化納米配合物基因導入材料的制備方法所制得的功能化納米配合物基因導入材料在抗腫瘤藥物中的應用。
[0018]本發明與現有技術相比較，有益效果在于:
(一)本發明提供的一種功能化納米配合物基因導入材料的制備方法具有制備方法簡單的優點，所制得的功能化納米配合物基因導入材料為一種平均直徑為150nm左右的納米球狀材料，且該納米球狀材料的粒徑能夠通過反應時間的控制進而控制納米顆粒的粒徑，從而擴大了粒徑的選擇范圍。該功能化納米配合物基因導入材料能和綠色熒光蛋白質粒基因PGFP以非共價方式結合，形成無機納米基因導入系統，用于基因轉染。該功能化納米配合物基因導入材料與綠色熒光蛋白質粒基因PGFP結合后再與DNA中的氫氧化鈣和磷酸離子的正電性根發生作用，能夠達到穩定的轉染效率，并且能夠降低高濃度鈣離子可能導致的活性，從而使得本發明所制得的功能化納米配合物基因導入材料能夠在人體內得到進一步應用。與現有技術相比，本發明所述制得的功能化納米配合物基因導入材料具有以下優點:
(1)具有較高的轉染效率，在人乳腺癌細胞中轉染效率能夠達到45%左右；
(2)低毒性，因硫酸亞鐵具有良好的生物相容性，使得所制得的球狀的功能化納米配合物基因導入材料具有良好的生物相容性，因此，使得細胞生存率很高；
(3)該功能化納米配合物基因導入材料的分散性良好，符合對轉染的要求；
(4)制備成本極低，因制備該功能化納米配合物基因導入材料所用的原材料的價格低廉，且易得。
[0019](5)材料制備反應簡單，容易操作，可重復性好；
(6)應用前景良好，可以應用于制備抗腫瘤藥物。
[0020](二)本發明提供的一種功能化納米配合物基因導入材料的制備方法，其步驟一往硫酸亞鐵水溶液中通入氮氣，是為了去除硫酸亞鐵水溶液中的氧氣，從而防止硫酸亞鐵水溶液中的二價鐵發生氧化反應，并在步驟二和步驟三的全過程均保持通入氮氣，進一步防止亞鐵離子發生氧化反應。
【附圖說明】
[0021 ]圖1是本發明的一種功能化納米配合物基因導入材料的制備方法的實施例1所制得的功能化納米配合物基因導入材料的透射電鏡圖。
[0022]圖2是本發明在轉染實驗中的功能化納米配合物基因導入材料和pEGFP-Cl的聯合體在轉染后的倒置熒光顯微鏡下的熒光圖。
[0023]圖3是本發明在轉染實驗中的功能化納米配合物基因導入材料和pEGFP-Cl的聯合體在轉染后的細胞存活率圖。
[0024]圖4是本發明在轉染實驗中的功能化納米配合物基因導入材料和pEGFP-Cl的聯合體的轉染效率圖。
[0025]其中，在圖3至圖4中，ce 11 viabi I ity(%)代表細胞存活率，transfect1nefficiency(%)代表轉染效率。
【具體實施方式】
[0026]下面結合實施例對本發明作進一步的說明。
[0027]其中，本發明提及的氟尿嘧啶水溶液也稱作:2，4_二羥基-5-氟嘧啶或5-FU或5-氟-2，4(1H，3H)_ 嘧啶二酮。
[0028]實施例1。
[0029]—種功能化納米配合物基因導入材料的制備方法，它包括以下步驟:
步驟一，硫酸亞鐵水溶液通氮氣:往硫酸亞鐵水溶液中通入氮氣;本實施例中，硫酸亞鐵水溶液的質量體積濃度為lg/L;
步驟二，