一種提高植物抗鈉鹽同時增加鉀和氮利用能力的方法及基因的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及基因工程領域，特別設及一種提高植物抗鋼鹽同時增加鐘和氮利用能 力的方法及基因。
【背景技術】
[0002] ±壤鹽份是作物和植被得W正常生長必不可少的成分。植物生長除了穩定良好的 上壤特性外，支撐其生長的一個關鍵是平衡地供給營養元素。但是，上壤中過多的鹽分，特 別是氯化鋼的含量，對植物生長是有害，直接的危害是多余的鋼離子在細胞質中積累影響 胞漿中酶的活性，從而影響各種生化反應。由于地球上大多數植物為淡±植物 (邑17(30地八63)，他們無法忍受±壤的高鹽度，造成地球上大量的高鹽±壤不能為人類所利 用，成為影響±地資源利用的一個重要因素。同時，由于人類不良的農業耕作方式，±地的 侵蝕和鹽堿化程度越來越大，進一步影響了±地的供給和產出。因此，±壤高鹽為已成為降 低農業生產能力的主要環境壓力。
[0003] 在過去的1000年中，人們一直在利用傳統的育種方法努力提高農作物的產量，并 為人類提供足夠的食物作出了巨大的貢獻。聯合國糧農組織估計，隨著人類人口數量的不 斷增長和對食品品質的要求的提高，到2050年，通過傳統育種方法提高農作物的產量只能 滿足人口對糧食增長需求量的60%。
[0004] 地球上生長有大量的鹽生植物(海洋、海涂和高度鹽堿化的±壤上自然生長的植 物），但運些植物絕大多數不是人類的通用食物。人們也無法通過傳統的雜交育種的方法將 運些植物的抗鹽特性轉移到農作物上。然而，現代基因工程和分子育種可W為我們提供一 種提高植物抗鹽能力的方法，利用運種方法改良農作物性狀的前提是要發現并獲得有提高 植物抗鹽能力的功能基因，包括與鹽代謝(吸收、轉運、同化、儲存或排出等)直接相關的功 能基因和對直接相關基因有調控作用(伴侶分子、蛋白轉錄后調控等)的調控基因。
[000引與鹽代謝如吸收、轉運、同化、儲存或排出等相關的基因鑒定工作已取得了較多的 研究成果。S0S1是細胞膜結合的化vr逆向轉運體，可W將細胞質胞漿中多余的化+跨膜轉 出細胞膜到細胞間的空隙中，從而降低鹽害。NHX1是液泡膜結合的化VH+逆向轉運體，可W 將細胞質胞漿中多余的Na+跨膜轉入到液泡中儲存，從而降低對胞漿中酶的危害。AVP1是液 泡膜r累，通過將液泡內的r累出膜到細胞質改變液泡膜的電勢增加化+累入液泡內的能 力，W降低鹽害，提高植物的抗鹽能力。在獲得抗鹽基因并證明其功能后，科學家利用功能 禪合的2個基因共同過表達，可W進一步提高植物的抗鹽性能。如，一個液泡r累AVP1和液 泡的化vr雙向轉運體基因共同過量表達植物，其抗鹽效果好于單個逆向轉運NHX1和單個 液泡r累AVP1的效果。運種效果在模式植物擬南芥得到證明后應用與棉花等植物，效果同 樣抗鹽明顯。不僅如此，雙基因轉化植株還有較好的抗旱性，還能提高棉花纖維產量和質 量。盡管氯離子是植物必需的微量營養素，與鋼離子一樣，細胞漿高濃度的氯離子有毒害作 用。當±壤中增加化C1濃度，植物細胞面臨的化+毒性和氯離子的共同毒性。氯離子被運輸 到液泡中可W防止其在細胞質中積累而降低毒性。事實上，運種方法似乎被某些耐鹽相橘 和葡萄所證實。液泡膜結合氯離子通道基因化c蛋白可W將氯離子運輸入液泡內，同時換來 一個質子到細胞質，它的功能類似于在液泡膜上NHX逆向轉運蛋白。擬南芥化C基因突變體， atclcc-1，對化C1非常敏感，而atclcc同源基因過表達轉基因植物可W增加鹽的耐受性，證 明了化C的蛋白質確實扮演著重要的耐鹽角色。
[0006] 鐘離子(K+)和氮(νοΛμΤ4)都是植物生長所需要的3大營養元素之一，對植物的生 長和產量關系重大，然而，正常情況下高濃度的Na+會影響植物對r的利用，過多的鋼會影響 鐘的吸收和利用。

【發明內容】

[0007] 本發明的目的在于提供一種提高植物抗鋼鹽同時增加鐘和氮利用能力的方法，通 過將擬南芥PP2A-C5基因導入目的植物，提高植物抗鋼鹽同時增加鐘和氮利用能力。
[0008] 本發明還提供了一種提高植物抗鋼鹽能力的基因及方法，通過將化Cc-A基因導入 目的植物，提高植物抗鋼鹽能力。
[0009 ]本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：
[0010] -種提高植物抗鋼鹽同時增加鐘和氮利用能力的方法，通過將擬南芥PP2A-C5基 因導入目的植物，提高植物抗鋼鹽同時增加鐘和氮利用能力。
[0011] 憐酸化和去憐酸化化是生物體內包括直接與抗鹽相關基因轉錄后蛋白的最重要 的功能調控方式之一。蛋白憐酸酶2A(PP2A)是細胞中一個重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白憐酸 酶，在細胞生長、代謝和信號轉導的精細調控中發揮著重要的作用，通過與底物的絲氨酸/ 蘇氨酸結合，執行細胞蛋白轉錄后調控，是典型的生物細胞調控基因。蛋白憐酸酶2A由Ξ個 亞基組成:結合亞基甲A，調節亞基B和催化亞基C。沒有憐酸化和去憐酸化化的調控，一大批 基因在合成蛋白后成為無功能的蛋白，將直接影響植物的生長。發明人通過長期探索研究 發現:擬南芥PP2A催化亞基5(PP2A-C5)與植物的抗鹽功能直接相關，過量表達PP2A-C5的植 株明顯提高了植株的抗鹽能力，而PP2A-C5的敲除突變體，顯示出對鹽的敏感性。對PP2A-C5 和SOS基因單突變體和雙重突變體的遺傳分析表明，PP2A-巧與氯離子通道(CLC)蛋白有相 互作用的關系，并在酵母雙雜交系統中得到證明。由于化C蛋白在液泡膜擔任離子/質子逆 向轉運作用而與植物的耐鹽性直接相關，掲示了 PP2A-C5的耐鹽機制。
[0012] 本發明發現了一個與抗植物鹽害相關的調控基因-擬南芥PP2A-C5基因。在一個實 施方案中，克隆了該基因，證明了其不僅有抗鹽能力，還有提高植物利用鐘和氮的功能。作 為優選，將擬南芥PP2A-C5基因導入目的植物的具體步驟如下：
[0013] (1)植物表達載體的構建:根據擬南芥化ir生物信息庫中基因 cds序列設計DNA引 物，W擬南芥cDNA文庫為模板，用PCR的方法，擴增基因 PP2A-C5的cDNA，用質粒PFGC5941構 建植物表達載體，擴增的cDNA和質粒DNA用Ncol和Bam I進行酶切，T4連接酶連接，利用 PFGC5941上的35S啟動子啟動PP2A-C5基因，獲得的植物表達載體命名為PFGC5941-35S-PP2A-C5；
[0014] (2)轉基因植物的獲得:將步驟（1)獲得的植物表達載體PFGC5941-35S-PP2A-C5導 入農桿菌，采用農桿菌介導法將植物表達載體轉入目的植物，獲得轉基因植物。
[0015] 作為優選，步驟（1)中的DNA引物包括0C5-F1和0C5-R1，0C5-F1序列見沈Q ID N0.1 所示，0巧-31序列見沈9 10^.2所示。
[0016] -種擬南芥PP2A-C5基因的新用途，用于提高植物抗鋼鹽同時增加鐘和氮利用能 力的用途。
[0017] 一種提高植物抗鋼鹽能力的基因，該基因命名為化Cc-A，CLCc-A序列見SEQ ID NO. 3所示。
[0018] 發明人發現了一個對調節植物鹽脅迫能力有用的基因：擬南芥PP2A-C5基因，然后 證明其功能的分子機制是通過調控其底物，一個液泡膜離子運輸蛋白化Cc來實現的，液泡 膜離子運輸蛋白化Cc的編碼基因是化Cc基因，然后通過改造化Cc基因的核酸序列獲得 化Cc-A基因，發現可W進一步提高植物的抗鹽的能力。
[0019] 一種提高植物抗鋼鹽能力的方法，通過將化Cc-A基因導入目的植物，提高植物抗 鋼鹽能力。
[0020] 作為優選，將化Cc-A基因導入目的植物的具體步驟如下：
[0021] (1)植物表達載體的構建:根據擬南芥化ir生物信息庫中基因 cds序列設計DNA引 物，W擬南芥cDNA文庫為模板，用PCR的方法，擴增基因化Cc-A的cDNA，用質粒pFG巧941構建 植物表達載體，擴增的cDNA和質粒DNA用Ncol和Bam I進行酶切，T4連接酶連接，利用 PFGC5941上的35S啟動子啟動化Cc-A基因，獲得的植物表達載體命名為PFGC5941-35S-化Cc-A;
[0022] (2)轉基因植物的獲得:將步驟（1)獲得的植物表達載體PFGC5941-35S-化Cc-A導 入農桿菌，采用農桿菌介導法將植物表達載體轉入目的植物，獲得轉基因植物。作為優選， 步驟（1)中的DNA引物包括化Cc-A-Fl和化Cc-A-Rl，化Cc-A-Fl序列見SEQ ID NO. 4所示， 化抗-4-31序列見沈9 10備.5所示。
[0023] 一種含有化Cc-A基因的植物表達載體及含有該植物表達載體的農桿菌。
[0024] 本發明的有益效果是:本發明可極好地應用于植物品種的改良，提高植物對于± 壤高鋼鹽的抵抗力，并在高鋼鹽±壤中植株仍有很強鐘和氮的利用能力，植物可W通過對 鐘和氮的利用提高植物的生長量。本發明對在高鹽±壤(如海涂±)和鹽堿化±壤(高鋼鹽、 高鐘鹽及其他鹽)上種植農作物、擴大植物種植面積、提高植物產量有重要意義。
【附圖說明】
[00巧]圖1是PP2A-C5-1 (SALK_139822)突變體的分子驗證。
[0026] A.基因組結構。黑盒和線分別表明PP2A-C5的外顯子和內含子。T-DNA插入位點是 由含有T-DNA左邊界化B)序列的Ξ角形指示。Fl(pp2a-c5-1-Fl，序列見SEQ ID N0.32WPR1 (pp2a-c5-1-Rl，序列見SEQ ID ^.33)，用于擴增??24-巧片段的？0?引物驗證突變體。
[0027] B.PCR證明PP2A-C5-1突變為純合的T-DNA插入植株。Fl，Rl，and L