本發明涉及醫藥領域，尤其涉及一種組合物及其在制備改善黃褐斑的產品中的應用。
背景技術：
：黃褐斑也稱肝斑，為面部的黃褐色色素沉著。多對稱蝶形分布于頰部。多見于女性，血中雌激素水平高是主要原因，其發病與妊娠、長期口服避孕藥、月經紊亂有關。黃褐斑一般為黃褐或深褐色斑片，常對稱分布于顴頰部，也可累及眶周、前額、上唇和鼻部，邊緣一般較明顯。無主觀癥狀和全身不適。色斑深淺與季節，日曬，內分泌因素有關。精神緊張，熬夜，勞累可加重皮損。對于黃褐斑的療法主要分為局部治療和全身治療2種，全身治療大多為給予維生素C以促進色素減退，局部治療是更加常用的方式。局部治療分為以下3種方式：1、外用藥物：這是最簡單、最常用的治療方法。外用酪氨酸酶抑制劑軟膏，如5％氫醌霜、2％～4％曲酸霜及3％熊果苷等。涂搽后都有不同程度的療效。該類藥物為抗氧化劑，易在空氣和日光中氧化，應封閉、避光保存。近年有人報道使用0.1％維A酸軟膏治療黃褐斑，外用糖皮質激素等也有一定療效。2、剝脫療法：三氯醋酸溶液局部涂搽可使表皮剝脫，而除去色素斑。液氮冷凍治療可使表皮冷凍壞死后剝離，以除去色素，磨削手術是用磨頭將表皮磨去一層，而達到除去色素的目的。術后待創面愈合后搽用防曬霜等，否則日曬后易于復發。3、面膜療法：面膜療法包括單純面膜劑、面膜膏按摩法和倒模面膜法。其中倒模面膜法已廣泛應用于黃褐斑的治療。面膜倒模療法集藥物、按摩、理療于一體，從而具有多種治療作用。其治療程序為：陽離子蒸氣潤面－面膜膏按摩－成形倒模劑倒模。面膜膏的藥物成分對黃褐斑的治療起著關鍵影響。目前有去色素的面膜膏、增白面膜膏和專治黃褐斑的中草藥物面膜等。4、激光或強脈沖光治療：近來有報道應用光子嫩膚術及應用Q開關激光治療黃褐斑部分患者有效。然而，以上這些療法對黃褐斑的改善效果皆非常有限，很難令人滿意。因此，進一步開發用于改善黃褐斑的產品具有十分重要的意義。技術實現要素：有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供一種組合物及其在制備改善黃褐斑的產品中的應用，本發明提供的組合物能夠抑制酪氨酸酶活性、降低細胞黑色素含量，從而有效改善黃褐斑。本發明提供的組合物中包括當歸提取物、干細胞提取物A和干細胞提取物B；當歸提取物由當歸粉碎后水煎提取制得；干細胞提取物A由干細胞的培養上清液過濾、濃縮后凍干制得；干細胞提取物B由干細胞裂解后經過濾制得。每100mL本發明提供的組合物中包括干細胞提取物A10mg～50mg；干細胞提取物B5mL～20mL；余量為當歸提取物。每100mL本發明提供的組合物中包括干細胞提取物A20mg～40mg；干細胞提取物B5mL～20mL；余量為當歸提取物。一些實施例中，每100mL本發明提供的組合物中包括干細胞提取物A20mg；干細胞提取物B5mL；余量為當歸提取物。一些實施例中，每100mL本發明提供的組合物中包括干細胞提取物A40mg；干細胞提取物B20mL；余量為當歸提取物。本發明提供的組合物中，干細胞為臍帶間充質干細胞。具體的，干細胞為人臍帶間充質干細胞。臍帶間充質干細胞的獲得方法為市場購得或自行制備本發明對此不做限定，其實施皆在本發明的保護范圍之內。干細胞的制備方法包括：步驟1：臍帶以含有200U/m雙抗的PBS溶液沖洗3遍后，剪成2cm長小段，剝去動、靜脈管和外膜后，剪碎成1-2mm2小塊，均勻貼附于10cm培養皿，37℃5％CO2培養箱內倒放1-2h；培養基為X-VIVO15無血清培養基；步驟2：加入含有10ng/mL的EGF的X-VIVO15無血清培養基，37℃5％CO2培養2～3天后半量換液，繼續培養6～8天，待細胞從組織塊中爬出，棄去組織塊繼續培養；步驟3：待生長至80％融合，倒去培養液，PBS清洗一遍，加0.25％胰酶消化1～2min，加FBS終止消化，400g離心5min收集臍帶間充質細胞。本發明中，干細胞的培養的采用含有EGF的X-VIVO15無血清培養基；其中EGF的濃度為10ng/mL。干細胞的培養方法為，將細胞接種至含有EGF的X-VIVO15無血清培養基37℃，5％CO2培養箱培養至80％融合后繼續傳代。干細胞提取物A的制備方法包括：將干細胞培養上清液以0.45μm濾膜過濾后，濾液再經0.22μm濾膜過濾，所得濾液以切向流過濾器循環過濾3h后，經冷凍干燥制得干細胞提取物A。干細胞培養上清液為P2或P3代的臍帶間充質干細胞的培養上清液。干細胞提取物B的制備方法包括：收集干細胞以水重懸后，反復凍融3次后，0℃～4℃超聲震蕩3次，每次3min；所得細胞裂解液經0.22μm濾膜過濾后制得干細胞提取物B。本發明采用的干細胞為培養至P2或P3代的臍帶間充質干細胞。重懸至細胞密度為1×106cell/mL～5×106cell/mL。凍融過程中，冷凍采用液氮，融化的溫度為37℃。超聲的功率為300w，頻率為20Hz～40Hz。當歸的水煎提取中，當歸與水的質量-體積比為1g：(10mL～20mL)。水煎提取的溫度為80-100℃，時間為30-60min。水煎提取后，以100目篩網過濾，獲得當歸提取物。本發明提供的組合物在制備抑制酪氨酸酶活性、降低細胞黑色素含量的產品中的應用。所述細胞為小鼠B16黑色素細胞。實驗表明，相對于不經處理的空白對照，本發明提供的組合物能夠將酪氨酸酶的相對活性降低至89.8％，而細胞中黑色素的相對含量也被降低至82.8％。說明本發明提供的組合物能夠有效抑制酪氨酸酶活性、降低細胞黑色素含量。本發明提供的組合物在制備改善黃褐斑的產品中的應用。實驗表明，給予本發明提供的組合物能夠有效改善黃褐斑，有效率可達95％；緩解率可達70％。本發明還提供了一種改善黃褐斑的產品，包括本發明提供的組合物。本發明提供的組合物可單獨用于改善黃褐斑，也可添加其他輔料制成不同的劑型用于改善黃褐斑，本發明對此不做限定。本發明還提供了一種改善黃褐斑的方法，該方法為給予本發明提供的組合物。給予本發明提供的組合物的劑量為每10cm2面積涂抹1-2ml。給予的方式為涂敷于黃褐斑區域。給藥過程中，還可以輔助刮痧處理等方式。刮痧采用玉石刮痧，刮痧板的形狀為魚形或四方形。本發明提供了一種組合物，其中包括當歸提取物、干細胞提取物A和干細胞提取物B。實驗表明，本發明提供的組合物能夠將酪氨酸酶的相對活性降低至89.8％，而細胞中黑色素的相對含量也被降低至82.8％。說明本發明提供的組合物能夠有效抑制酪氨酸酶活性、降低細胞黑色素含量。該效果顯著優于單獨給予當歸提取物或單獨給予干細胞提取物的對照組。另外，將本發明提供的組合物用于改善黃褐斑，有效率可達95％；緩解率可達70％。具體實施方式本發明提供了一種組合物及其在制備改善黃褐斑的產品中的應用，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
發明內容、精神和范圍內對本文的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。下面結合實施例，進一步闡述本發明：實施例1制備臍帶間充質干細胞臍帶以含有200U/m雙抗的PBS溶液沖洗3遍后，剪成2cm長小段，剝去動、靜脈管和外膜后，剪碎成1-2mm2小塊，均勻貼附于10cm培養皿，37℃5％CO2培養箱內倒放1-2h；培養基為X-VIVO15無血清培養基；加入含有10ng/mL的EGF的X-VIVO15無血清培養基，37℃5％CO2培養2～3天后半量換液，繼續培養6～8天，待細胞從組織塊中爬出，棄去組織塊繼續培養；待生長至80％融合，倒去培養液，PBS清洗一遍，加0.25％胰酶消化1～2min，加FBS終止消化，400g離心5min收集臍帶間充質細胞。以含有10ng/mL的EGF的X-VIVO15無血清培養基重懸臍帶間充質細胞，根據計數結果接種2-3皿(接種密度為1-5×106cell/mL)。待細胞生長至80％融合后繼續傳代，至P2或P3代細胞進行細胞和培養上清液的收集。實施例2干細胞提取物A的制備收集實施例1中制得的P2和P3代干細胞培養上清液，采用Slice200切向流過濾器濃縮，循環過濾的時間為3h，該過程中，經0.45μm濾膜過濾除去大顆粒物質，再經0.22μm濾膜過濾，除去3kDa以下小顆粒物質；濃縮液用凍干機制成凍干粉，即為干細胞提取物A。實施例3干細胞提取物B的制備收集實施例1中制得的P2或P3代細胞，加入純水重懸至細胞密度為1×106cell/mL～5×106cell/mL，放入液氮速凍5min，取出后37℃解凍；解凍后又放入液氮速凍，反復3次；在0～4℃冰水浴中超聲振蕩3min(功率300W，頻率20Hz～40Hz)，超聲振蕩3次；合并所得混懸液，在無菌條件下經0.22μm濾膜過濾，制得干細胞提取物B。實施例4當歸提取物的制備取當歸洗凈晾干，研磨成粉，水煎提取(1g當歸加水10mL～20mL；100℃，提取30min)，經100目篩網過濾得到濾液，制得100ml當歸提取物。實施例5組合物的制備混合實施例4制得的當歸提取物、實施例3制得的干細胞提取物B，加入實施例2制得的干細胞提取物A，制得組合物每100ml組合物中含有：干細胞提取物A20mg干細胞提取物B5mL其余為當歸提取物。實施例6組合物的制備混合實施例4制得的當歸提取物、實施例3制得的干細胞提取物B，加入實施例2制得的干細胞提取物A，制得組合物每100ml組合物中含有：干細胞提取物A40mg干細胞提取物B20mL其余為當歸提取物。實施例7組合物對小鼠B16黑色素細胞的作用黃褐斑與黑色素細胞酪氨酸酶活性和黑色素生成有直接的關系，所以對酪氨酸酶活性和黑色素生成能力的測定能直接反應制劑治療黃褐斑的效果。對比試驗流程如下：取小鼠B16黑色素細胞，以1×105個/ml的密度接種于2個6孔板，(培養液為5％胎牛血清的1640培養基)。3塊6孔板每孔分別添加：孔1：不添加任何成分孔2：實施例3提供的干細胞提取物B孔3：實施例5提供的組合物5％體積濃度孔4：實施例5提供的組合物10％體積濃度孔5：實施例6提供的組合物5％體積濃度孔6：實施例6提供的組合物10％體積濃度置于37℃、5％CO2濃度培養箱中培養3天。酪氨酸酶活力測定：第一塊6孔板培養3天后，用PBS清洗兩遍，消化細胞，加入96孔板，每孔1×104個細胞(設置5個復孔)，并同時分別設置空白組(培養基)和對照組(孔1，細胞加培養基)，加入加含1％的Triton-100(MERCK公司)的PBS100ul，冰浴超聲擊碎細胞，每孔添加再添加10ul的0.01mol/L的L-dopa(美國SIGMA公司)，37℃孵育1小時，于490nm處比色，測吸光度值。以A值表示酪氨酸酶活性大小：A＝(實驗組-空白組)/(對照組-空白組)×100％黑色素含量測定：第二塊6孔板培養3天后，用PBS清洗兩遍，消化細胞，加入96孔板，每孔1×104個細胞(設置5個復孔)，并同時分別設置空白組(無細胞)和對照組(孔1細胞)，每孔加入200ul含10％二甲基亞砜(DMSO)的NaOH(1mol/L)溶液，于65℃水浴完全溶解黑色素顆粒，酶聯免疫檢測490nm處吸光度值，。以B值表示酪氨酸酶活性大小：B＝(實驗組-空白組)/(對照組-空白組)×100％檢測結果如表1：表1檢測結果組別酪氨酸酶活性A值(％)黑色素含量測定B值(％)孔1100±2.58100±1.15孔297.3±2.2897.5±1.83孔390.6±1.7285.4±1.23孔489.9±1.6986.3±1.17孔589.8±2.0588.7±0.98孔690.2±1.8482.8±1.08結果分析：從酪氨酸酶活性和黑色素含量測定分析結果可知，實施例5和6提供的組合物對酪氨酸酶活性具有明顯的抑制作用，該效果顯著(p<0.05)優于單獨給予干細胞提取物B(干細胞裂解液)，并且，本發明提供的組合物對黑色素的形成的抑制效果更佳，該效果也顯著(p<0.05)優于單獨使用干細胞提取物B(干細胞裂解液)。實施例7組合物對黃褐斑的改善作用隨機選擇患者100例，診斷結果為典型性黃褐色皮疹(黃褐斑)。其中男性34例，女性66例，年齡18～40歲，平均年齡25歲，病程1～8年，平均2.7年。所有病人隨機分為5組進行實驗。對照組1：進行常規面部護理；對照組2：僅以實施例4當歸提取物涂敷對照組3：以實施例3干細胞提取物B涂敷實驗組1：涂敷實施例5組合物；實驗組2：涂敷實施例6組合物；所有病人持續治療跟蹤3年，療效評價參照黃褐斑的臨床診斷和療效判定標準。基本治愈：肉眼視色斑面積消退﹥90％，顏色基本消失，評分法計算和治療后總積分下降指數﹥0.8；顯效：肉眼視色斑面積消退﹥60％，顏色明顯變淡，評分法計算和治療后總積分下降指數﹥0.5；緩解率＝治愈數/病例數有效率＝(顯效數+治愈數)/病例數得到結果如表2：表2治療效果分組病例數治愈數顯效數緩解率有效率對照組1200000對照組22002010％對照組320185％40％實驗組12012660％90％實驗組22014570％95％結果表明，本發明提供的組合物對黃褐斑的改善效果優于單獨給予當歸提取物或干細胞提取物B，該效果具有顯著性。以上僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。當前第1頁1 2 3