致齲菌的定量檢測方法
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及臨床口腔醫學，具體涉及對致齲菌的定量檢測方法。
【背景技術】
[0002] 齲病是一種慢性感染性疾病，兒童是主要敏感人群之一。因其處于特殊年齡階段， 齲病的分布呈現不均衡狀態，可累及多顆乳牙，引起廣泛齲損，進而影響口腔衛生狀況和身 心健康。研究顯示，變形鏈球菌群(Streptococci mutants)中，以變形鏈球菌和遠緣鏈球菌 與齲病發生密切相關;乳桿菌在低齡兒童齲的發展中具有重要作用。近年來發現，內氏放線 菌與兒童齲病存在一定的相關性。現有技術中運用實時熒光定量PCR檢測不同齲敏感兒童 唾液樣本中內氏放線菌及齲齒放線菌的含量，發現唾液中內氏放線菌的水平與兒童齲病的 相關性很高，而齲齒放線菌則無明顯相關性。口腔菌斑是一個復雜的微生物群落，齲病的發 生是多種細菌相互影響，造成口腔生態平衡失調的結果。所以，定量研究齲病始動因素菌斑 中主要致齲菌的比例，從細菌水平對兒童齲病狀況進行動態監測，對其預防和治療具有重 要意義。

【發明內容】

[0003] 本發明意在提供一種定量研究菌斑中主要致齲菌的比例的方法。
[0004] 本發明中所提及的主要致齲菌是指變形鏈球菌、遠緣鏈球菌、嗜酸乳桿菌與內氏 放線菌；
[0005] 主要包括如下檢測方法：
[0006] A.將無菌干燥濾紙lcmX lcm置于無菌潤濕液中潤濕，潤濕液由以下質量百分數的 組分組成:蛋白胨0.1 %，表面活性劑0.1 %，氯化鈉0.85 %，余量為水；
[0007] B.用無菌鑷子將潤濕后的濾紙取出并平鋪覆蓋在受測者牙頰面菌斑，停留30s采 樣即可；
[0008] C.菌種計數
[0009] 1)用無菌鑷子將上述采樣后的濾紙或者棉簽取下并置于10mL PH7.2的PBS緩沖液 中，漩渦振蕩混勻30s，使濾紙上的微生物充分釋放洗脫至緩沖液中，得處理液備用；
[0010] 2)取少量處理液進行10倍稀釋，于TSA-0.6%YE平板上培養并計數再計算得到單 位檢測表面的微生物數量，計算公式如下：
[0011] a = Log( 100N/m)+n+l
[0012] 式中：a表示每100cm2面積接觸表面上致病菌對數值，單位為Log(CFU/100cm2);n 表示處理液10倍稀釋次數;m表示取液量，單位為mL ;N表示η次10倍稀釋液取樣量m時對應的 平板菌落數CFU以及lcmX lcm總菌數。
[0013] D.吸取lmL處理液，進行持續lmin的12000r/min的離心處理，棄上清，通過DNA試劑 盒提取樣本液中四種致齲菌的DNA;
[0014] E.將四種致齲菌的DNA分別投入到對應的單試管PCR反應體系中，進行PCR擴增，紀 錄對應的擴增曲線;將所得的擴增曲線與標準曲線比對，計算出樣本的模板數量。
[0015] F.計算四菌種的比例值及并推算lcmX lcm的各菌種數量。
[0016] 采用本發明上具如下技術效果：
[0017] 1、通過檢測四種致齲菌在牙斑中的比例，以及受試者實際齲齒情況的比對，進一 步完善當前齲齒風險評估的模型，使評估模型更為科學和準確化。
[0018] 2、采用單試管PCT反應體系可以避免PCR污染
【附圖說明】
[0019] 圖1為按接觸表面微生物檢測方法，濾紙與棉簽比對的示意圖。
[0020] 圖2為某一受測者的PCR定量檢測曲線。
[0021 ]圖中2、3、4、5分別表示變形鏈球菌、遠緣鏈球菌、嗜酸乳桿菌與內氏放線菌。
【具體實施方式】
[0022] 實施例一致齲菌的計數測量
[0023] 采用本齲患風險評估模式對目標人群(共計150人，其中男性72,女性78人，平均年 齡36.2歲），口腔檢查與菌斑采集由2名口腔專業醫師擔任檢查者，現場采集相關數據。
[0024] 將無菌干燥濾紙（1 cm X 1 cm)或者棉簽置于無菌潤濕液中潤濕，潤濕液由以下質量 百分數的組分組成:蛋白胨0.1%，表面活性劑0.1%，氯化鈉0.85%，余量為水；
[0025] 用無菌鑷子將潤濕后的濾紙取出并平鋪覆蓋在受測者牙頰面菌斑，停留30s采樣 即可。或者棉簽刮取牙頰面菌斑表面。
[0026] 接觸表面微生物檢測方法，步驟如下：
[0027] 1)用無菌鑷子將上述采樣后的濾紙或者棉簽取下并置于10mL pH7.2的PBS緩沖液 中，漩渦振蕩混勻30s，使濾紙上的微生物充分釋放洗脫至緩沖液中，得處理液備用；
[0028] 2)取少量處理液進行10倍稀釋，于TSA_0.6%YE平板上培養并計數（即稀釋平板計 數法），再計算得到單位檢測表面的微生物數量，計算公式如下：
[0029] a = Log( 100N/m)+n+l
[0030] 式中:a表示每100cm2面積接觸表面上致病菌對數值，單位為Log(CFU/100cm2) ;n表 示處理液10倍稀釋次數;m表示取液量，單位為mL;N表示η次10倍稀釋液取樣量m時對應的平 板菌落數CFU。記下總菌數。
[0031 ]吸取 lmL 上述處理液，12000r/min離心 lmin，棄上清，按照TIANampBacteriaDNAKit 試劑盒操作步驟在室溫下提取DNA，GeneQuantpro紫外/可見光分光光度儀檢測DNA濃度和 純度。
[0032] 如圖1所示，在采用接觸表面微生物檢測方法的前提下，使用已知菌種數來比對濾 紙與棉簽兩種采樣方式，濾紙采樣更接近真實值。
[0033] 實施例二
[0034] 為每個菌種設計PCR反應體系，每個PCR反應管中內設有與相應菌種對應的探針。
[0035]
[0036]先合成與檢測菌種的基因型對應的模板序列，將引物與模板序列連接，然后使用 帶有地高辛標記的RNAntpmix對合成的序列進行標記，從而作完成探針。
[0037] 將按照TIANampBacteriaDNAKit試劑盒提取的四種致齲菌的DNA分別投入到對應 的PCR反應體系中，每個菌種的反應體系均建立在單個PCR反應管中；進行PCR擴增，紀錄對 應的擴增曲線;將所得的擴增曲線與標準曲線比對，計算出樣本的模板數量。同時記錄此次 四種菌種的比例值，與實施例一中求得的總菌數結合，推算出相應菌種數量，更有利于準確 牙斑表面的菌群狀況。
[0038]采用SPSS17.0軟件包對實驗數據進行X2檢驗、配對t檢驗，P<0.05為差異具有顯 著性。
[0039] 實施例三結合致齲菌的比例，繪制相應的齲齒風險評估表(LogC均以10為底數）
[0040] 表1風險評估表
[0041]

[0043] 近期評價結果：
[0044] 采用本齲患風險評估模式對目標人群(共計150人，其中男性72,女性78人，平均年 齡36.2歲)進行齲患風險評估，評估為中低危人數101人，高危人數為49人，縱向研究分別在 6個月，12個月后進行回訪復查，評估目標人群在6個月，12個月實際新增齲情況，評估本齲 患風險評估表的有效性。結果如下：
[0045]
[0046]
[0047]以上所述的僅是本發明的實施例，方案中公知的具體結構及特性等常識在此未作 過多描述。應當指出，對于本領域的技術人員來說，在不脫離本發明結構的前提下，還可以 作出若干變形和改進，這些也應該視為本發明的保護范圍，這些都不會影響本發明實施的 效果和專利的實用性。本申請要求的保護范圍應當以其權利要求的內容為準，說明書中的 【具體實施方式】等記載可以用于解釋權利要求的內容。
【主權項】
1.致齲菌的定量檢測方法，齲菌是指變形鏈球菌、遠緣鏈球菌、嗜酸乳桿菌與內氏放線 菌;其特征在于： 包括如下檢測步驟： A. 將無菌干燥濾紙lcmXlcm置于無菌潤濕液中潤濕，潤濕液由以下質量百分數的組分 組成:蛋白胨0.1 %，表面活性劑0.1 %，氯化鈉0.85 %，余量為水； B. 用無菌鑷子將潤濕后的濾紙取出并平鋪覆蓋在受測者牙頰面菌斑，停留30s采樣即 可； C. 菌種計數 1) 用無菌鑷子將上述采樣后的濾紙或者棉簽取下并置于10mLPH7.2的PBS緩沖液 中，漩渦振蕩混勻30s，使濾紙上的微生物充分釋放洗脫至緩沖液中，得處理液備用； 2) 取少量處理液進行10倍稀釋，于TSA-0.6%YE平板上培養并計數再計算得到單位 檢測表面的微生物數量，計算公式如下： a=Log(100N/m)+n+l 式中：a表示每100cm2面積接觸表面上致病菌對數值，單位為L〇g(CFU/100cm2) ;n表 示處理液10倍稀釋次數;m表示取液量，單位為mL;N表示η次10倍稀釋液取樣量m時 對應的平板菌落數CFU以及1cmX1cm總菌數； D. 吸取1mL處理液，進行持續1min的12000r/min的離心處理，棄上清，通過DNA試劑 盒提取樣本液中四種致齲菌的DNA; E. 將四種致齲菌的DNA分別投入到對應的單試管PCR反應體系中，進行PCR擴增，紀錄對 應的擴增曲線;將所得的擴增曲線與標準曲線比對，計算出樣本的模板數量； F. 計算四菌種的比例值及并推算1cmX1cm的各菌種數量。
【專利摘要】本發明涉及臨床口腔醫學，具體涉及對致齲菌的定量檢測方法。致齲菌的定量檢測方法，包括如下檢測步驟：A.采樣并制取處理液；C.菌種計數；D.吸取1mL處理液，進行持續1min的12000r/min的離心處理，棄上清，通過DNA試劑盒提取樣本液中四種致齲菌的DNA；E.將四種致齲菌的DNA分別投入到對應的單試管PCR反應體系中，進行PCR擴增，紀錄對應的擴增曲線；將所得的擴增曲線與標準曲線比對，計算出樣本的模板數量；F.計算四菌種的比例值及并推算1cm×1cm的各菌種數量。本發明通過檢測四種致齲菌在牙斑中的比例，以及受試者實際齲齒情況的比對，進一步完善當前齲齒風險評估的模型，使評估模型更為科學和準確化。
【IPC分類】C12Q1/06, C12R1/46, C12Q1/68, C12R1/23, C12Q1/14
【公開號】CN105483215
【申請號】CN201510834186
【發明人】楊德琴, 羅凌飛, 竇磊, 劉鑫, 徐智云, 黃興, 薛慧, 高敬
【申請人】重慶醫科大學附屬口腔醫院
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2015年11月25日