一種腸膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種腸膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖及其 制備方法。
【背景技術】
[0002] 水不溶性葡聚糖（Insoluble glucan，IG)是一類不溶于水溶液、以葡萄糖為單一 組分聚合而成的一種糖類多聚物，這類理化性質特殊的碳水化合物不但來源廣泛，在植物、 真菌以及細菌的代謝產物中均有報道，而且種類繁多。目前報道較多的IG有dextran、 curdlan和cellulose三種，從結構特點來看，已報道的這些IG的分支僅由α-(1，2)、α-(1，3) 或α_(1，4)糖苷鍵中的一種將支鏈與主鏈連接起來，極少涉及2種或以上糖苷鍵的分支結 構。因此，新構型IG的篩選與發現不僅為IG家族增添了新的成員，而且極大地推動了IG結構 有關研究的前沿領域。

【發明內容】

[0003] 本發明所要解決的技術問題是當前水不溶性多糖來源狹隘，支鏈與主鏈的連接結 構糖苷鍵類型單一，制備方法繁瑣，用于制備的菌種為有害菌等問題，本發明提供了一種腸 膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖及其制備方法。
[0004] 本發明人發現保藏號為CGMCC No. 10064的腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)BD3749在合成培養基中培養后得到的發酵液制備可得具有特殊結構的水 不溶性胞外多糖，由此發明人完成了本發明。
[0005] 為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之一為:一種腸膜明串珠菌的水不 溶性胞外多糖，所述的水不溶性胞外多糖為一種主鏈由α_(1，6)糖苷鍵連接而成，支鏈由α-(1，3)和€ 1-(1，4)糖苷鍵連接而成的葡聚糖，其中，糖苷鍵€[-(1，6):€[-(1，3):€ [-(1，4)的摩爾 比例為 1:0.2~0.3:0.3~0.4。
[0006] 所述水不溶性胞外多糖為一種同時擁有α-(1，3)和α-(1，4)糖苷鍵的水不溶性葡 聚糖，較佳地呈白色粉末狀。
[0007] 所述的水不溶性胞外多糖較佳地由保藏編號為CGMCC No. 10064的腸膜明串珠菌 (Leuconostoc mesenteroides)BD3749產生。
[0008] 如前所述腸膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖可以由下述制備方法制備而得。
[0009] 為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之二為:一種腸膜明串珠菌的水不 溶性胞外多糖的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：
[0010] 1)將腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesentero ides) BD3749接種于培養基中，發酵 培養獲得發酵液；
[0011] 2)將步驟1)所得發酵液冷凍干燥后，取凍干粉末用堿液浸提，取上清，調節pH至7， 取沉淀，冷凍干燥即得。
[0012] 本發明步驟1)為：將腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)BD3749接種于 培養基中，發酵培養獲得發酵液。
[0013] 本發明制備方法中所述的腸膜明串珠菌BD3749已于2014年11月26日保藏在中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址:北京市朝陽區北辰西路1 號院3號，郵編：100101。該菌株的建議的分類命名為 ：腸膜明串珠菌1^11(：〇11〇^〇(3 mesenteroides，該菌株的保藏編號為:CGMCC如.10064，所保藏的培養物名稱為403749。 [0014]本發明所述腸膜明串珠菌BD3749的制備方法為常規的，較佳地還包括該腸膜明串 珠菌BD3749活化獲得腸膜明串珠菌種子的步驟。所述腸膜明串珠菌種子為常規方法獲得， 較佳地為包括以下步驟的方法:將腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)BD374^9 凍干粉用少量無菌蒸餾水溶解，用接種環取一環劃線于含5%蔗糖的M17固體培養基(購買 自0X0ID，英國），30°C好氧培養48h取出，用接種環挑取單菌落放入10mL含5%蔗糖的M17液 體培養基（購買自0X0ID，英國），運用渦旋振蕩器將菌落均勻分散于液體培養基內，30°C， 180rpm振蕩培養24h取出，以2%(v/v)接種量接種于含5%蔗糖的M17液體培養基(購買自 0X0ID，英國），30°C，180rpm振蕩培養24h后，將培養物15，OOOrpm離心10分鐘，棄去上清，菌 體用無菌蒸餾水洗滌2次后，用原培養體積的無菌蒸餾水懸浮，得到發酵用的種子(亦稱腸 膜明串珠菌種子液）。所述腸膜明串珠菌BD3749的凍干粉由以下方法制備:挑取2個菌落，接 種于300mL的10 % (w/w)的脫脂乳溶液里30°C培養4h，-80°C預凍過夜，_20°C冷凍干燥。
[0015] 其中，所述的培養基為本領域常規的培養基，只要能培養腸膜明串珠菌即可，較佳 地為合成培養基，所述合成培養基包括以下組分：蛋白胨1 %、酵母提取物0.5%、 K2HP〇4〇 · 5%、CaCl20 · 034%和蔗糖5~30%，蔗糖的含量較佳地為10~20%，更佳地為10%， 余量為水，所述百分比為質量百分比。所述合成培養基的制備方法為本領域常規的制備方 法。所述培養基的pH較佳地為5~8，更佳地為7。
[0016] 其中，所述的發酵培養為本領域常規培養方法，所述腸膜明串珠菌的接種量較佳 地為1~5%，更佳地為2~4%，最佳地為3%，所述百分比為體積百分比。所述的發酵培養較 佳地為振蕩培養，所述振蕩培養為常規的，振蕩速度較佳地為100~300rpm，更佳地為150~ 250rpm，最佳地為200rpm。所述的發酵培養的發酵溫度較佳地為15~37°C，更佳地為25°C~ 33°C，最佳地為30°C，發酵時間較佳地為24~96小時，更佳地為48~84小時，最佳地為72小 時。
[0017] 本發明步驟2)為:將步驟1)所得發酵液冷凍干燥后，取凍干粉末用堿液浸提，取上 清，調節pH至7,取沉淀，冷凍干燥即得。其中，所述冷凍干燥為本領域常規的凍干（即冷凍干 燥)技術，只要達到去除水分，獲得固形物的目的即可。所述堿液為常規的，較佳地為NaOH溶 液，所述NaOH溶液的濃度為1~5M，較佳地為2~4M，更佳地為3M。所述浸提為常規的，所述浸 提時凍干粉末與堿液的比例為1 g: lmL~1 g: 5mL，較佳地為1 g: 2mL~1 g: 4mL，更佳地為1 g: 3mL。所述上清為常規方法取得，較佳地為離心，所述離心為常規的，離心的速度較佳地為8， 000~15,000g，更佳地為10,000~12,00(^，離心的時間較佳地為5~15分鐘，更佳地為8~ 12分鐘。所述pH使用常規方法調節，較佳地為用酸液調節，所述酸液為常規的，較佳地為HC1 溶液，所述HC1溶液濃度為1~3M，較佳地為1.5~2.5M，更佳地為2M。
[0018] 在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實 例。
[0019] 本發明所用試劑和原料均市售可得。
[0020] 本發明的積極進步效果在于：
[0021] 1、本發明解決了當前水不溶性多糖(尤其是水不溶性葡聚糖)來源狹隘的現狀，為 水不溶性多糖的來源提供了另一種的選擇。
[0022] 2、采用本發明制備的水不溶性胞外多糖具有罕見的兩種支鏈糖苷鍵并存的形態， 是一種結構新穎的多糖，根據結構越復雜的多糖功能也相對較多的理論，因此，具有一定的 開發意義。
[0023] 3、常規多糖的制備步驟中往往涉及了去蛋白的步驟(如SAVAGE法去蛋白），但本發 明制備方法中發酵液不調節pH直接冷凍干燥，酸性發酵液被逐步凍干失水時，pH不斷下降， 造成局部過酸，導致發酵液中的游離蛋白迅速變性，這部分蛋白在堿液浸提時被離心除去， 從而達到了去蛋白的目的。
[0024] 4、腸膜明串珠菌屬于乳酸菌范疇，所以與其他來源菌株(如芽孢菌、產氣菌、霉菌 等)產生的不溶性多糖相比，來自腸膜明串珠菌的胞外多糖具有更高的食品安全性。本發明 制備所得的胞外多糖提取物可以作為功能性添加劑替代其他來源的水不溶性多糖應用于 食品、制藥和相關領域中，其應用前景十分廣闊。
[0025] 生物材料保藏信息
[0026]本發明的腸膜明串珠菌BD3749，已于2014年11月26日保藏在中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學 院微生物研究所，郵編：100101，保藏編號為:CGMCC No. 10064,培養物名稱是BD3749,分類 命名是腸膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides〇
【附圖說明】
[0027]圖1顯示腸膜明串珠菌BD3749水不溶性胞外多糖的單糖組成測定結果。
[0028]圖2顯示腸膜明串珠菌BD3749水不溶性胞外多糖