微透析采樣?流動注射化學發光聯用法在小分子半抗原與單克隆抗體間親和力測定中的應用
【專利摘要】本發明公開了在線微透析采樣?流動注射化學發光聯用分析法在針對小分子半抗原的單克隆抗體的親和力測定中的應用及其具體測定方法，該聯用分析法是在非標記的條件下于均相體系中研究小分子半抗原與單克隆抗體間的親和力，方法簡單、便捷、穩定、靈敏。與現有的測定抗體親和力的方法相比，其無需用酶等信號分子對抗體進行標記，也無需將小分子半抗原與載體蛋白偶聯后用于包被，可以省去標記、偶聯等繁瑣工作，更重要的是可以更加客觀的反映抗原與抗體間的真實結合情況，且不需要昂貴的儀器，成本較低。本發明不僅為抗體的性能評價提供了一種簡單、快速、客觀的分析技術手段，同時也是對微透析采樣技術應用領域的新拓展。
【專利說明】
微透析采樣-流動注射化學發光聯用法在小分子半抗原與單克隆抗體間親和力測定中的應用
技術領域
[0001]本發明屬于免疫分析領域，涉及在線微透析采樣-流動注射化學發光聯用分析法在針對小分子半抗原的單克隆抗體的親和力測定中的應用。
【背景技術】
[0002]單克隆抗體技術是一種免疫學技術，它將產生抗體的單個B淋巴細胞同腫瘤細胞雜交，獲得既能產生抗體、又能無限增殖的雜交瘤細胞，并以此生產抗體。該技術為抗體的分子學研究提供了一個全新的手段，極大地促進了免疫學的發展。近年來，單克隆抗體技術在免疫檢測、免疫治療、分離純化等領域得到了非常廣泛的應用。在單克隆抗體的制備和篩選過程中，最重要的工作之一是對不同細胞株分泌的單克隆抗體對特定抗原的結合親和力這一關鍵指標進行評價，其對于單克隆抗體的開發應用具有十分重要的指導意義。
[0003]目前，用于測定抗原-抗體間結合常數的方法主要包括競爭結合法、硫氰酸鹽洗脫法、非競爭酶免疫分析法等基于抗體標記的異相分析方法。近年來，也有一些非標記的方法用于測定抗體親和力，其原理與前述標記法類似，不同之處在于抗體無需以信號探針標記，而是在抗原和抗體結合后，以表面等離子體共振、石英晶體微天平等非標記方法測定傳感器界面上的生物結合反應，依此研究抗原和抗體的結合過程。標記法的弊端在于，所有抗體均需要以酶等信號分子進行標記，一來標記過程繁瑣，二來標記可能影響抗體的生物活性，所獲得的測定結果難以客觀反映抗原-抗體間真實的親和力。而無論是標記法還是非標記法，都需要將抗原固定于酶標板或傳感器表面。如果抗原是小分子半抗原，由于它們很難在酶標板或傳感器表面有效固定，通常需要與載體蛋白偶聯形成人工完全抗原后方可用于包被，而偶聯可能帶來以下問題:首先，偶聯過程較為麻煩;其次，偶聯可能破壞抗原分子結構中的抗原決定簇，或者，抗原決定簇與偶聯蛋白距離過近，對抗原-抗體間的結合反應產生空間位阻，均不能真實反映抗體的親和力。因此，有必要發展一種無需對小分子半抗原及抗體進行偶聯或標記即可直接進行針對小分子半抗原的單克隆抗體親和力測定的均相分析方法。
【發明內容】
[0004]有鑒于此，本發明的目的在于提供一種無需對小分子半抗原及抗體進行偶聯或標記即可直接進行針對小分子半抗原的單克隆抗體親和力測定的均相分析方法。
[0005]為達到上述目的，本發明提供如下技術方案:
1.在線微透析采樣-流動注射化學發光聯用法在小分子半抗原與單克隆抗體間親和力測定中的應用。
[0006]2.在線微透析采樣-流動注射化學發光聯用法測定小分子半抗原與單克隆抗體間親和力的方法，包括以下步驟:在小分子半抗原與單克隆抗體的均相免疫反應體系中，采用在線微透析采樣方法獲得含有部分游離小分子半抗原的透析液，再采用流動注射化學發光法測定透析液中游離小分子半抗原的濃度，結合微透析采樣方法的透過率求得均相免疫反應體系中游離小分子半抗原的濃度，進一步計算出均相免疫反應體系中與單克隆抗體結合的小分子半抗原的濃度，最后根據Scatchard分析或/和Klotz分析計算出單克隆抗體的親和力常數。
[0007]優選的，所述方法具體包括以下步驟:
(1)制備一系列已知不同濃度的小分子半抗原溶液，采用流動注射化學發光法分別測定其化學發光強度，以化學發光強度對小分子半抗原的濃度作圖得工作曲線；
(2)將已知濃度的小分子半抗原溶液采用在線微透析采樣方法獲得含有部分小分子半抗原的透析液，采用流動注射化學發光法測定透析液的化學發光強度，根據步驟(I)所得工作曲線推算出透析液中小分子半抗原的濃度，進一步計算出微透析采樣方法的透過率；
(3)固定單克隆抗體的濃度，將其分別與一系列已知不同濃度的小分子半抗原進行結合反應，得到一系列均相免疫反應體系，采用在線微透析采樣方法分別獲得一系列含有部分游離小分子半抗原的透析液，采用流動注射化學發光法分別測定該系列透析液的化學發光強度，根據步驟(I)所得工作曲線分別推算出該系列透析液中游離小分子半抗原的濃度，結合步驟(2)所得微透析采樣方法的透過率求得該系列均相免疫反應體系中游離小分子半抗原的濃度，進一步計算出該系列均相免疫反應體系中與單克隆抗體結合的小分子半抗原的濃度，最后根據Sca t char d分析或/和KI o t z分析計算出單克隆抗體的親和力常數。
[0008]作為一個具體實例，所述單克隆抗體為特布他林單克隆抗體，小分子半抗原為特布他林。
[0009]作為上述實例的一個優選實施方式，在線微透析采樣-流動注射化學發光聯用法測定小分子半抗原與單克隆抗體間親和力的方法具體為:步驟(I)和(2)中所述小分子半抗原溶液和步驟(3)中所述均相免疫反應體系的溶劑均為0.010 M pH 7.4 PBS緩沖液;步驟(I)至(3)中所述流動注射化學發光法具體如下:發光劑為1.0X10—5 M魯米諾和1.0X10—4M鐵氰化鉀，所述濃度的魯米諾由1.0 X 10—2 M氫氧化鈉溶解制得;載流和發光劑的流速均為2.2 mL/min;步驟(2)和(3)中所述在線微透析采樣方法具體如下:采樣溫度為37 °C;灌流液為0.010 M pH 7.4 PBS緩沖液，灌流速度為4.0 yL/min。
[0010]本發明的有益效果在于:本發明提供了在線微透析采樣-流動注射化學發光聯用分析法在針對小分子半抗原的單克隆抗體的親和力測定中的應用及其具體測定方法，該聯用分析法是在非標記的條件下于均相體系中研究小分子半抗原與單克隆抗體間的親和力，方法簡單、便捷、穩定、靈敏。與傳統的標記型方法相比，其無需用酶等信號分子對抗體進行標記，可以省去標記這一繁瑣工作，可以更加客觀的反映抗原與抗體間的真實結合情況。與非標記方法相比，其無需將小分子半抗原與載體蛋白偶聯后用于包被，可以省去偶聯這一繁瑣工作，真實反映抗體的親和力，而且不需要昂貴的儀器，成本較低。本發明不僅為抗體的性能評價提供了一種簡單、快速、客觀的分析技術手段，同時也是對微透析采樣技術應用領域的新拓展。
【附圖說明】
[0011]圖1為在線微透析采樣-流動注射化學發光聯用分析裝置(MP:微量注射栗;M:微透析探針;Pl:載流傳輸裝置;P2:發光劑傳輸裝置;V:進樣閥;F:流通池;D:化學發光檢測器；W:廢液;a:載流;b:發光劑I; C:發光劑2; Ant1-TEB:特布他林單克隆抗體;Terbutal ine:特布他林;PBS: PBS緩沖液)。
[0012]圖2為流動注射化學發光法檢測硫酸特布他林的工作曲線。
[0013]圖3為特布他林與其單克隆抗體相互作用的Scatchard曲線。
[0014]圖4為特布他林與其單克隆抗體相互作用的Klotz曲線。
【具體實施方式】
[0015]為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明的優選實施例進行詳細的描述。
[0016]圖1為在線微透析采樣-流動注射化學發光聯用分析裝置。如圖所示，該分析裝置包括微透析采樣系統和流動注射化學發光系統;所述微透析采樣系統包括微量注射栗和微透析探針;所述流動注射化學發光系統包括載流傳輸裝置、發光劑傳輸裝置、進樣閥、流通池和化學發光檢測器;所述微透析探針的液體出口與流動注射化學發光系統中的進樣閥連通。該分析裝置由計算機進行程序自動化控制。
[0017]采用上述分析裝置進行小分子半抗原與單克隆抗體間親和力測定時，先將小分子半抗原和單克隆抗體的均相免疫反應體系進行一定時間的溫育，使免疫反應達到平衡，再將微透析探針置于達到平衡的免疫反應體系中，利用微量注射栗將灌流液推送至微透析探針處，使灌流液經微透析探針與免疫反應體系進行透析交換，交換后的透析液(含游離小分子半抗原)進入進樣閥的采樣環中，被載流帶入與發光劑混合后發生化學發光反應，化學發光信號由化學發光檢測器中的光電倍增管采集。
[0018]實施例1在線微透析采樣-流動注射化學發光聯用法測定特布他林單克隆抗體的親和力
1、流動注射化學發光法檢測硫酸特布他林的工作曲線的繪制制備一系列已知濃度的硫酸特布他林溶液(溶劑為0.010 M pH 7.4 PBS緩沖液)。將微量注射栗與流動注射化學發光系統中的進樣閥直接相連(不通過微透析探針)，分別將上述系列硫酸特布他林溶液吸入至微量注射栗中，由微量注射栗控制以4.0 yL/min的速度直接推送至采樣環中，采用流動注射化學發光法進行測定，記錄化學發光信號。流動注射化學發光法具體如下:發光劑為1.0 X 10—5 M魯米諾(由1.0 X 10—2 M氫氧化鈉溶解制得)和1.0 X10—4 M鐵氰化鉀;載流和發光劑的流速均為2.2 mL/min;光電倍增管的工作電壓為-700V;每8分鐘測定一次(7分30秒采樣，進樣量為30 yL)。每個濃度重復測定4次。以化學發光強度對硫酸特布他林濃度作圖得工作曲線，如圖2所示。
[0019]2、微透析探針透過率(R)的測定
采用如圖1所示的在線微透析采樣-流動注射化學發光聯用分析裝置。將微透析探針放入已知濃度的硫酸特布他林溶液(溶劑為0.010 M pH 7.4 PBS緩沖液)中，37 °C水浴恒溫。將灌流液由微量注射栗控制進行低速灌流，灌流液經微透析探針與硫酸特布他林溶液進行透析交換，透析液(含有部分硫酸特布他林)進入進樣閥的采樣環中，被載流帶入流動注射化學發光系統，與發光劑反應，測定化學發光信號。在線微透析采樣-流動注射化學發光聯用法具體如下:微透析探針為美國BASi公司的MD-2310探針;灌流液為0.010 M pH 7.4 PBS緩沖液，灌流速度為4.0 4171^11;發光劑為1.0\10—5 M魯米諾(由1.0 X 10—2 M氫氧化鈉溶解制得)和1.0 X 10—4 M鐵氰化鉀;載流和發光劑的流速均為2.2 mL/min;光電倍增管的工作電壓為-700 V;每8分鐘測定一次(7分30秒采樣，進樣量為30此)。根據圖2推算出透析液中硫酸特布他林的濃度，再根據微透析探針透過率計算公式:R = Cd /Cm {Cd為透析液中硫酸特布他林的濃度，C?為探針周圍硫酸特布他林的總濃度)，計算得出微透析探針的透過率R為26.2%。
[0020 ] 3、特布他林單克隆抗體的親和力測定
采用如圖1所示的在線微透析采樣-流動注射化學發光聯用分析裝置。固定均相免疫反應體系中特布他林單克隆抗體的濃度為7.0 X 10—7 M，硫酸特布他林的濃度分別為1.0X 10—7 Μ、3.0Χ10—7 Μ、5.0Χ10—7 Μ、7.0Χ10—7 M 和 9.0X10—7 Μ，總體積為 1.0 mL，溶劑為
0.010 M pH 7.4 PBS緩沖液。將該均相免疫反應體系置37 °C水浴中不斷攪拌混勻，平衡30分鐘后，將微透析探針置免疫反應體系中，將灌流液由微量注射栗控制進行低速灌流，灌流液經微透析探針與免疫反應體系進行透析交換，透析液(含有部分游離硫酸特布他林)進入進樣閥的采樣環中，被載流帶入流動注射化學發光系統，與發光劑反應，測定化學發光信號。在線微透析采樣-流動注射化學發光聯用法具體同前。每個濃度重復測定4次。根據圖2推算出透析液中游離硫酸特布他林的濃度，結合微透析探針的透過率求得探針周圍游離硫酸特布他林的濃度，進一步計算出與特布他林單克隆抗體結合的硫酸特布他林的濃度。然后通過Scatchard分析(r /Cu =nK ~rK ,r代表體系中結合的硫酸特布他林與特布他林單克隆抗體摩爾濃度的比值，Cu代表未結合的硫酸特布他林的濃度，/3表示單抗分子的結合位點數，尤表示單抗的親和力常數；以r /Cu對r作圖可得一直線，由直線的斜率及截距可求得J和/3 )(圖3)和Klotz分析(1/r = I/η + (I/nK)(l/Cu),r代表體系中結合的硫酸特布他林與特布他林單克隆抗體摩爾濃度的比值，Cu代表未結合的硫酸特布他林的濃度，/3表示單抗分子的結合位點數，表示單抗的親和力常數；以Ι/r對1/C?作圖可得一直線，由直線的斜率及截距可求得I和/2 )(圖4)，求得特布他林單克隆抗體的親和力常數分別為4.9 X 16 M—1 和4.9 X 16 M^10
[0021]最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通過參照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發明的精神和范圍。
【主權項】
1.在線微透析采樣-流動注射化學發光聯用法在小分子半抗原與單克隆抗體間親和力測定中的應用。2.在線微透析采樣-流動注射化學發光聯用法測定小分子半抗原與單克隆抗體間親和力的方法，其特征在于，包括以下步驟:在小分子半抗原與單克隆抗體的均相免疫反應體系中，采用在線微透析采樣方法獲得含有部分游離小分子半抗原的透析液，再采用流動注射化學發光法測定透析液中游離小分子半抗原的濃度，結合微透析采樣方法的透過率求得均相免疫反應體系中游離小分子半抗原的濃度，進一步計算出均相免疫反應體系中與單克隆抗體結合的小分子半抗原的濃度，最后根據Scatchard分析或/和Klotz分析計算出單克隆抗體的親和力常數。3.根據權利要求2所述的在線微透析采樣-流動注射化學發光聯用法測定小分子半抗原與單克隆抗體間親和力的方法，其特征在于，具體包括以下步驟: (1)制備一系列已知不同濃度的小分子半抗原溶液，采用流動注射化學發光法分別測定其化學發光強度，以化學發光強度對小分子半抗原的濃度作圖得工作曲線； (2)將已知濃度的小分子半抗原溶液采用在線微透析采樣方法獲得含有部分小分子半抗原的透析液，采用流動注射化學發光法測定透析液的化學發光強度，根據步驟(I)所得工作曲線推算出透析液中小分子半抗原的濃度，進一步計算出微透析采樣方法的透過率； (3)固定單克隆抗體的濃度，將其分別與一系列已知不同濃度的小分子半抗原進行結合反應，得到一系列均相免疫反應體系，采用在線微透析采樣方法分別獲得一系列含有部分游離小分子半抗原的透析液，采用流動注射化學發光法分別測定該系列透析液的化學發光強度，根據步驟(I)所得工作曲線分別推算出該系列透析液中游離小分子半抗原的濃度，結合步驟(2)所得微透析采樣方法的透過率求得該系列均相免疫反應體系中游離小分子半抗原的濃度，進一步計算出該系列均相免疫反應體系中與單克隆抗體結合的小分子半抗原的濃度，最后根據Sca t char d分析或/和KI o t z分析計算出單克隆抗體的親和力常數。4.根據權利要求2或3所述的在線微透析采樣-流動注射化學發光聯用法測定小分子半抗原與單克隆抗體間親和力的方法，其特征在于，所述單克隆抗體為特布他林單克隆抗體，小分子半抗原為特布他林。5.根據權利要求4所述的在線微透析采樣-流動注射化學發光聯用法測定小分子半抗原與單克隆抗體間親和力的方法，其特征在于，步驟(I)和(2)中所述小分子半抗原溶液和步驟(3)中所述均相免疫反應體系的溶劑均為0.0lO M pH 7.4 PBS緩沖液;步驟(I)至(3)中所述流動注射化學發光法具體如下:發光劑為1.0 X 10—5 M魯米諾和1.0 X 10—4 M鐵氰化鉀，所述濃度的魯米諾由1.0 X 10—2 M氫氧化鈉溶解制得;載流和發光劑的流速均為2.2mL/min;步驟(2)和(3)中所述在線微透析采樣方法具體如下:采樣溫度為37 °C;灌流液為.0.010 M pH 7.4 PBS緩沖液，灌流速度為4.0 yL/min。
【文檔編號】G01N33/577GK106053820SQ201610491652
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月29日
【發明人】付志鋒, 王平石, 周婭莉
【申請人】西南大學