檢測dm致病基因突變的方法，及其引物、試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬分子生物學技術領域，設及檢測DM致病基因突變的方法，及其引物、試 劑盒。
【背景技術】
[0002] DM(myotonicdystro地y)基因位于19號染色體長臂（19ql3. 3)，基因組跨度為 14化，含15個外顯子，編碼582個氨基酸殘基組成萎縮性肌強直蛋白激酶（dystrophia myotonicaproteinkinase,DMPK)。現有研究成果提示，DM基因發生突變時將導致一組W 肌無力、肌強直和肌萎縮為特點的多系統受累的常染色體顯性遺傳病，發病率為1/8000。
[0003] 現有的檢測DM的致病基因技術主要是基于單個突變位點的PCR和測序方法及單 基因忍片方法，顯著缺點主要在于僅僅能檢測單個突變位點，不能對多個突變位點進行同 時檢測，也不能對分布于多個外顯子的位點進行同時檢測。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的在于克服上述不足，提供一種檢測DM致病基因突變的方法，其解決 了現有技術中進行DM致病基因突變檢測程序繁瑣、費用昂貴、費時、易污染和靈敏度低等 問題。
[0005] 為了實現上述目的，本發明采用的技術方案為：一種檢測DM致病基因突變的方 法，不用于疾病的診斷和治療，其特征在于，其包括如下實現步驟：
[0006] 樣本處理：取外周血2ml于邸TA抗凝管中，輕柔地顛倒混勻，4°C保存；
[0007]DNA提取，取220μ1抗凝血用試劑盒提取DNA，包括：
[000引 1)加220μ1BufferBL，震蕩混合，于70°C解育10分鐘；
[000引。加220μ1無水乙醇震蕩混合約20秒；
[0010] 扣12000巧m離屯、1分鐘；
[0011] 4)取上清轉入收集柱中，1200化pm離屯、2分鐘；
[0012] 5)將收集柱置一個新的收集管上，加入500μ1皿solution,室溫放置5分鐘；
[0013] 6) 12000巧m離屯、2分鐘；
[0014] 7)加入 700μ1washBuffer, 12000巧m離屯、2 分鐘；
[0015] 8)將收集柱置一個新的收集管上，加入700μ1washBuffer, 12000巧m離屯、2分 鐘；
[0016] 9)棄收集管內液體，12000巧m離屯、2min;
[0017] 10)將收集柱放入一個新的1. 5ml離屯、管內，加入50μ1 70°C預熱的洗脫液，室 溫放置l-2min，12000巧m離屯、2分鐘，濾液即為模板DNA;
[001引PCR擴增 [001引PCR反應體系：
[0020] 10XPCRBuffer2μ1 ；
[0021] HotStarTaqDMPolymerase按kit標準調整；
[0022] dNTPmix 2μ1 ;
[0023] 上游引物PrimerU1μ1 ；
[0024] 下游引物PrimerL1μ1 ;
[00巧]DM模板 Xμ1 ;
[0026] 滅菌蒸饋水 20μ1 上述總體積；
[0027] PCR產物電泳：1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果；
[0028] PCR產物純化
[0029] 每管內加入100μ1PCR-A液，混勻，轉入純化柱內，12000巧m離屯、2min;
[0030] 棄收集管內液體，加入 700μ 1 washingbuffer, 12000巧m 離屯、2min;
[0031] 棄收集管內液體，加入 400μ 1 washingbuffer, 12000巧m 離屯、2min;
[003引 棄收集管內液體，12000巧m離屯、2min;
[003引柱內加入30μ1 70°C預熱洗脫液，12000巧m離屯、3min;
[0034] 測序反應
[0035] 反應體系：0. 8μ1Bi曲ye+1.5ylBi曲yeSeqBuffer+3yl引物+1μ1PCR純 化產物+3. 5μ1 (1地2〇;
[0036] 測序PCR熱循環條件：
[0037] 1)變性的條件，96°ClOsec;
[0038] 5)退火的條件，（首先96°ClOsec，其次50°C5sec，然后60°C4min)X25個循環；
[0039] 6)延伸的條件，60°C4min;
[0040] 7)4°C保溫；
[0041] 每一步的時間應從反應混合液達到所要求的溫度后開始計算；
[0042] 測序產物純化
[0043] 10μ1反應體系，96孔板，酒精/EDTA/NaAc法；
[0044] 1)每管加入100μΙ100%酒精，或每管加入1μ1 125mM邸TA到管底，或每管加 入1μ1 3MNaAc到管底，然后震蕩混勻，室溫放置15min;
[0045] 2) 10°C，4000巧m離屯、30min，馬上倒置，1200巧m離屯、Imin;
[0046] 3)每管加入100μl70%酒精，離屯、15min;5°C，3600巧m離屯、30min，馬上倒置， 1200巧m離屯、Imin;
[0047] 4)室溫揮發凈酒精，加入10μ1Hi-Di化rmamide溶解DM;
[0048] 5) 95°C變性 5min，4°C保溫 4min，加樣上機；
[0049] 6)測序純化：ABIBigdyeXTerminatorpurificationkit;
[0050] PCR檢測，包括：
[0051] 1)對照孔的設立和檢測重復孔：樣本檢測同時設有對照實驗，包括陰性對照；對 照和樣本均采用復孔.
[0052] 在DM基因突變位點兩端設計兩對特異性引物；
[0053] 所述引物是DMPK和ZNF-9 ;
[0054] 所述引物DMPK的sense為：
[00巧]5'TTGTAGCCGGGAATGCTG3'，
[0056]所述引物DMPK的antisense為：
[0057] 5' GCACTTTGCGAACCAACG 3',
[005引所述引物ZNF-9的sense為：
[0059]5' TCTCAGTCACCAGGCAAGTG 3'，
[0060]所述引物ZNF-9的antisense為：
[0061] 5'TGGAATTTACAGGGTTAGGGTCA3'；
[0062] 所述引物PCR擴增出目的片段模板；
[006引所述目的片段的獲取包括：W上述引物分別對人基因組DNA進行PCR擴增得到條 帶單一的目的基因片段；將目的片段稀釋至1萬-10萬倍，終濃度為10-2化g/μL作為檢 測陰性對照用；
[0064] 。25μL反應體系檢測：
[0065] PremixTaqPC民MaKerIVIIX 12.5μ1 DNA模板 I-lOng/μΙ Primer? 終濃度為400nM PrimerL 終濃度為400nM 滅菌蒸饋水 Upto25μ1
[0066] 混合均勻；所有樣本混合完后，將ΑΒΙ Veriti Dx PCR系統儀器中進行程序性檢 測；
[0067] 結果分析及判定：對PCR產物進行測序分析。
[0068] 本發明的另一目的在于提供一種檢測DM致病基因突變的引物，其特征在于，所述 引物序列包括：
[0069]沈Q ID N0:15'TTGTAGCCGGGAATGCTG 3'
[0070] SEQ ID NO:25'GCACTTTGCGAACCAACG 3'
[0071]沈Q ID NO:35'TCTCAGTCACCAGGCAAGTG 3'
[0072] SEQ ID N0:45'TGGAATTTACAGGGTTAGGGTCA3'。
[0073] 本發明的還一目的在于提供包含所述引物的試劑盒。
[0074] 本發明的有益效果為：
[0075] 能對多個突變位點進行同時檢測，也能對分布于多個外顯子的位點進行同時檢 巧。，簡單、快速、準確、有效的對強直性肌營養不良兩種突變類型進行檢測和臨床診斷，利用 多種特異性引物同時對患者可能存在的多個突變位點進行檢測，使用該方法能保證95% W 上的疾病檢出率。解決了現有技術中進行DM致病基因突變檢測程序繁瑣、費用昂貴、費時、 易污染和靈敏度低等問題，尤其是提供了病理組織之外的非創傷性如血清或血漿等檢測。
【具體實施方式】
[0076]W下結合具體實施例對上述方案做進一步說明。應理解，運些實施例是用于說明 本發明而不限于限制本發明的范圍。實施例中采用的實施條件可W根據具體廠家的條件做 進一步調整，未注明的實施條件通常為常規實驗中的條件。
[0077] 實施例1
[0078] 樣本處理：取外周血2ml于邸ΤΑ抗凝管中，輕柔地顛倒混勻，4°C保存；
[0079]DNA提取，取220μ1抗凝血用試劑盒提取DNA，包括：
[0080] 1)加 220μ1BufferBL，震蕩混合，于 70°C解育 10 分鐘；
[0081] 2)加220 μ 1無水乙醇震蕩混合約20秒；
[0082] 3) 12000巧m離屯、1 分鐘；
[008引4)取上清轉入收集柱中，12000巧m離屯、2分鐘；
[0084] 5)將收集柱置一個新的收集管上，加入500μ1皿solution,室溫放置5分鐘；
[0085] 6) 12000巧m離屯、2 分鐘；
[0086] 7)加入 700μ1washBuffer,12000巧m離屯、2 分鐘；
[0087] 8)將收集柱置一個新的收集管上，加入700μ1washBuffer,12000巧m離屯、2分 鐘；
[0088] 9)棄收集管內液體，12000;rpm離屯、2min;
[0089] 10)將收集柱放入一個新的1. 5ml離屯、管內，加入50μL70°C預熱的洗脫液，室 溫放置l-2min，12000巧m離屯、2分鐘，濾液即為模板DNA;
[0090]PCR擴增
[00川PCR反應體系：
[0092] 10XPCRBuffer 2μ1;
[0093]HotStarTaqDNAPolymerase按kit標準調整；
[0094]dNTPmix 2μ1 ;
[0095]上游引物PrimerU 1μ1