檢測肝糖原累積癥Ⅰa型GP6C基因突變的試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種檢測肝糖原累積癥I a型GP6C基因突變的試劑盒，以及利用該試 劑盒檢測肝糖原累積癥I a型GP6C基因突變的方法。 (二）
【背景技術】
[0002] 糖原累積癥I型又稱VonGierke病，簡稱GSD I，是遺傳性肝內葡萄糖-6-磷酸酶 (G6Pase)先天性缺乏而導致糖原分解或合成障礙的常染色體隱性遺傳性疾病。G6Pase體 系主要由4個組分組成：葡萄糖-6-磷酸酶-a (G6PC)、葡萄糖-6-磷酸轉運體（G6PT1)、無 機磷酸鹽轉運體（Τ2)、葡萄糖轉運體（Τ3)，分別行使葡萄糖-6-磷酸的水解，G6p的轉位， 磷酸的運輸和葡萄糖運輸的功能。根據缺陷的酶的不同將GSD I分為4個亞型：G6PC缺陷 引起GSD I a ;G6PTI缺陷引起GSD I b;磷酸鹽轉運體缺陷引起GSD I c和葡萄糖轉運體 缺陷引起GSD I d。
[0003] 研宄表明，其中GSD I型約占整個糖原累積癥的25%，而I型中I a型約占80%， 故GSD I a型是一種相對較為常見的糖原代謝障礙疾病，其活產兒發病率約為十萬分之 一。臨床表現主要為低血糖、肝臟腫大、高脂血癥、高尿酸血癥、高乳酸血癥等，主要累及肝 臟、腎臟和小腸，在臨床上主要問題表現為診斷率低和診斷手段有限。控制GSD I a型的基 因為G6PC，該基因定位于G6Pase基因位于人類的17號染色體長臂2區1帶，全長12. 5kb， 包含5個外顯子。G6PC蛋白為細胞內質網膜蛋白，包含357個氨基酸，為高度疏水性蛋白， 有9個跨膜單位，其N端位于內質網腔內，C端位于質膜上。目前國內外學者對GSD I a 型的基因型研宄已確定了多種突變，包括錯義突變、剪接突變、移碼突變、缺失、基因與假基 因融合與基因轉化等，具有種族差異性，常見的突變位點為R83C、Q347、R83H、R83C、V338F、 D38V、G68R、IVS3-58T>A、IVS4+10G>A。中國人GP6C基因突變等位基因中以R83H及R83C為 最常見。
[0004] 基因測序是指分析特定DNA片段的堿基序列，也就是腺嘌呤（A)、胸腺嘧啶（T)、胞 喃啶（C)與鳥嗓呤的（G)排列方式。目前常用的Sanger測序法是Frederick Sanger于 1975年發明的，測序過程需要先做一個聚合酶連鎖反應（PCR)。PCR過程中，雙脫氧核糖核 苷酸可能隨機的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于雙脫氧核糖核苷酸又少了一個氧 原子，一旦它被加入到DNA鏈上，這個DNA鏈就不能繼續增加長度。最終的結果是獲得所有 可能獲得的、不同長度的DNA片段。作為一種新型基因檢測技術，基因測序能夠從血液或唾 液中分析測定目的基因序列，助力相關遺傳病診斷，可以對那些即使沒有臨床癥狀的患者， 也可以得到盡早的診斷和治療，為臨床診治提供科學依據。與患者擁有相同基因型的家族 成員，盡管沒有臨床癥狀也應該盡早治療，而臨床癥狀或生化檢查都模棱兩可的家族成員， 有可能是雜合子攜帯者需加以關注，具有高度特異且精確，低成本，操作簡便，快速，高通量 等優點，是國際上公認的檢測基因突變的"金標準"。
[0005] 在G6PC基因克隆之前，GSD I a的診斷主要靠臨床表現和生化檢查，確診則需要 肝穿刺檢測肝標本中G6Pase的活性，對攜帶者無法進行檢查，產前診斷如果對胎兒肝臟進 行活檢會給胎兒帶來危險。G6PC基因突變檢測使得以DNA為基礎的基因診斷成為可能，該 方法不僅顯著提高了不典型GSD I a型病例的診斷率，也是通過產前診斷從而有效降低該 病發病率的重要手段。同時對患者的同胞進行基因檢測將有可能將診斷提前至無癥狀的臨 床前期，因而對于GSD I a型的基因測序檢測，具有更準確、更經濟、更簡便，利于開展，避免 了以往該病的診斷有賴于肝穿刺及活檢的診斷方法，更易于被患者接受。 (三）
【發明內容】

[0006] 本發明目的是提供一種檢測肝糖原累積癥I a型GP6C基因突變的試劑盒及方法， 用于檢測G6PC基因突變位點，特異性好，靈敏度高。
[0007] 本發明采用的技術方案是：
[0008] 檢測肝糖原累積癥I a型GP6C基因突變的試劑盒，主要包括特異性引物和PCR反 應試劑；
[0009] 所述特異性引物序列如下：
[0010] 外顯子Exonl擴增引物：
[0011] 上游引物：5 ' -AGCAATCACCACCAAGC-3 '
[0012] 下游引物：5' -TCCAAAGTCAGAGAGAGGG-3' ；
[0013] 外顯子Exon2擴增引物：
[0014] 上游引物：5' -TTCTCAGGCTACACTCTTC-3'
[0015] 下游引物：5' -CGTGCCTCTCTGGAC-3' ；
[0016] 外顯子Exon3擴增引物：
[0017] 上游引物：5' -GTGGCTGGGTAGATGATGC-3'
[0018] 下游引物：5' -ACATTCCCTGACTCTGAGGTTTA-3' ；
[0019] 外顯子Exon4擴增引物：
[0020] 上游引物：5 ' -CCTGTGTTCTGTTATGGTT-3 '
[0021] 下游引物：5' -AGGATGTGGCTGGAA-3' ；
[0022] 外顯子Exon5擴增引物：
[0023] 上游引物：5 ' -CCATCTGCCATCTGTG-3 '
[0024] 下游引物：5 ' -AATAGTAGTCCTCCTCAATCC-3 '。
[0025] 所述PCR反應試劑為本領域常規試劑，主要包括：dNTP、10*PCR緩沖液、雙蒸水、 Tag酶等。
[0026] 所述試劑盒還可包括GP6C基因外顯子序列標準品，所述標準品序列如下：
[0027] 外顯子 Exonl:
[0028] 5 ' -ATGGAGGAAGGAATGAATGTTCTCCATGACTTTGGGATCCAGTCAACACATTACCTCCAGGTGAAT TACCAAGACTCCCAGGACTGGTTCATCTTGGTGTCCGTGATCGCAGACCTCAGGAATGCCTTCTACGTCCTCTTCCC CATCTGGTTCCATCTTCAGGAAGCTGTGGGCATTAAACTCCTTTGGGTAGCTGTGATTGGAGACTGGCTCAACCTCG TCTTTAAGTG-3 ,；
[0029] 外顯子 Exon2:
[0030] 5 ' -GATTCTCTTTGGACAGCGTCCATACTGGTGGGTTTTGGATACTGACTACTACAGCAACACTTCCGT GCCCCTGATAAAGCAGTTCCCTGTAACCTGTGAGACTGGACCAG-3 ' ；
[0031] 外顯子 Exon3:
[0032] 5，-GGAGCCCCTCTGGCCATGCCATGGGCACAGCAGGTGTATACTACGTGATGGTCACATCTACTCTTT CCATCTTTCAGGGAAAGATAAAGCCGACCTACAGATTTCG-3 ' ；
[0033] 外顯子 Exon4:
[0034] 5? -GTGCTTGAATGTCATTTTGTGGTTGGGATTCTGGGCTGTGCAGCTGAATGTCTGTCTGTCACGAAT CTACCTTGCTGCTCATTTTCCTCATCAAGTTGTTGCTGGAGTCCTGTCAG-3 ' ；
[0035] 外顯子 Exon5:
[0036] 5 ' -GCATTGCTGTTGCAGAAACTTTCAGCCACATCCACAGCATCTATAATGCCAGCCTCAAGAAATATT TTCTCATTACCTTCTTCCTGTTCAGCTTCGCCATCGGATTTTATCTGCTGCTCAAGGGACTGGGTGTAGACCTCCTG TGGACTCTGGAGAAAGCCCAGAGGTGGTGCGAGCAGCCAGAATGGGTCCACATTGACACCACACCCTTTGCCAGCCT CCTCAAGAACCTGGGCACGCTCTTTGGCCTGGGGCTGGCTCTCAACTCCAGCATGTACAGGGAGAGCTGCAAGGGGA AACTCAGCAAGTGGCTCCCATTCCGCCTCAGCTCTATTGTAGCCTCCCTCGTCCTCCTGCACGTCTTTGACTCCTTG AAACCCCCATCCCAAGTCGAGCTGGTCTTCTACGTCTTGTCCTTCTGCAAGAGTGCGGTAGTGCCCCTGGCATCCGT CAGTGTCATCCCCTACTGCCTCGCCCAGGTCCTGGGCCAGCCGCACAAGAAGTCGTTGTAA-3'。
[0037] PCR及測序所需野生型標準品的制備以Genebank中發布G6PC的基因序列為標準， 以健康體檢人的外周血基因組為模板，用上述5對引物擴增出5個特異性的PCR片段，合成 與表1引物一致的野生型質粒，并與G6PC的標準基因序列比對，確認質粒的正確性，作為檢 測分析中的標準品。
[0038] 所述的試劑盒在檢測肝糖原累積癥I a型GP6C基因突變中的應用。
[0039] 具體的，所述應用方法如下：
[0040] (1)采集待測血液樣本，提取DNA ;
[0041] ⑵以樣品DNA為模板，加入所述特異性引物和PCR反應試劑，組成PCR反應體系， 進行PCR擴增；
[0042] (3)步驟（2)得到的PCR反應產物進行進一步的測序，依據單基因遺傳病基因突變 數據庫或者對照標準品序列進行分析，確定是否肝糖原累積癥I a型致病突變