基于單分子靶向測序技術檢測egfr/kras/braf基因突變位點的探針、方法、試劑及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學領域，特別是涉及一種基于單分子靶向測序技術檢測 EGFR/KRAS/BRAF基因突變位點的探針、方法、試劑及其應用，以及一種無創檢測基因突變位 點的方法。
【背景技術】
[0002] 表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR)是位于7號染色 體短臂上的原癌基因 C-erbB-l(HER-l)的表達產物，是表皮生長因子受體家族(HER)中的4 個成員之一，HER家族在細胞生理過程中發揮重要的調節作用。EGFR酪氨酸激酶區域的突變 主要發生在18~21號外顯子，其中19和21號外顯子突變占總突變的90% AGFR信號傳導的 異常是導致多種腫瘤發生的原因。研究表明，EGFR在多種腫瘤中都有表達，如結直腸癌、乳 腺癌、胰腺癌、前列腺癌和非小細胞肺癌等。
[0003] K-ras基因是一種原癌基因，長約35kb，位于12號染色體短臂上，是ras基因家族成 員之一，編碼KRAS蛋白。K-ras基因常見的突變位點位于2號外顯子的12號密碼子和13號密 碼子上、3號外顯子的61號密碼子，其中有7個突變熱點:G12C、G12R、G12S、G12V、G12D、G12A、 G13V/D，占 K-ras基因總突變的98%以上。研究表明體細胞K-ras基因突變與多種人類惡性 腫瘤，如肺癌、白血病、黏蛋白腺癌、胰腺癌、結直腸癌有關，而生殖細胞K-ras基因突變與努 南綜合征和心臟-面部-皮膚(cardi〇-facio_cutaneous，CFC)綜合征相關。
[0004] BRAF基因是一種原癌基因，定位于7號染色體上，編碼絲/蘇氨酸特異性激酶。約 90%的BRAF基因突變發生在外顯子15的1799位核苷酸上，T突變為A，導致纈氨酸被谷氨酸 取代(V600E)』RAF基因突變在黑色素瘤、結直腸癌、神經膠質瘤、肉瘤、卵巢癌、乳腺癌以及 肺癌等腫瘤細胞系中的發生率依次為59%、18%、11%、9%、14%、2%、3%;此外，81^? V600E在甲狀腺乳頭狀癌中的發生率高達35.8% ARAF基因突變是晚期及復發性結直腸癌 最重要的預后指標之一，與患者較差的總體生存期密切相關。
[0005] 目前常見的檢測這三個基因突變的方法有Sanger測序法和熒光定量PCR法。 Sanger測序法中，單對引物可檢測多個突變，但對多個基因、或同一基因的不同外顯子上的 突變位點就需分別進行擴增測序，操作繁瑣，并且靈敏度較低約20%，假陰性率較高。熒光 定量PCR法雖然靈敏度高，但每對引物只能檢測一種突變，且每種突變需單獨建立一個PCR 反應體系，同時檢測多個樣本多個突變位點操作繁瑣。這兩種方法對樣本的需要量都較大， 不適合同時檢測多個基因突變位點。
[0006] 高通量測序法(NGS)雖然靈敏度高，同時可檢測多個突變位點，但其建庫流程復 雜，操作繁瑣，時間長，成本高。

【發明內容】

[0007] 鑒于此，本發明提供了一種基于單分子靶向測序技術檢測EGFR/KRAS/BRAF基因突 變位點的探針、方法和應用。本發明還提供了一種用于單分子靶向測序的樣品的制備方法。
[0008] 第一方面，本發明提供了 一種基于單分子靶向測序技術檢測EGFR/KRAS/BRAF基因 突變位點的探針，包括檢測EGFR、KRAS和BRAF基因中一個或多個基因的突變位點的一條或 多條探針，所述探針的核苷酸序列為SEQ ID NO: 1~SEQ ID N0:16所示序列中的一條或多 條。
[0009] 具體地，如SEQ ID NO: 1~SEQ ID N0:16所示探針如下表1所示。
[0010]表1·SEQIDN0:1~SEQIDN0:16所示探針
[0011]
[0012] 具體地，具有SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2所示序列的探針用于檢測EGFR基因的外 顯子18區域的突變位點；具體地，具有SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4所示序列的探針用于檢測 EGFR基因的外顯子19區域的突變位點；具體地，具有SEQ ID N0:5~SEQ ID N0:8所示序列 的探針用于檢測EGFR基因的外顯子20區域的突變位點；具體地，具有SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10所示序列的探針用于檢測EGFR基因的外顯子21區域的突變位點；具體地，具有SEQ ID N0:11、SEQ ID NO: 12所示序列的探針用于檢測KRAS基因的外顯子2區域的突變位點；具體 地，具有SEQ ID NO: 13、SEQ ID N0:14所示序列的探針用于檢測KRAS基因的外顯子3區域的 突變位點；具體地，具有SEQ ID N0:15、SEQ ID勵：16所示序列的探針用于檢測81^?基因的 外顯子15區域的突變位點。
[0013] 在本發明一實施例中，所述SEQ ID NO: 1~SEQ ID N0:16任一所示序列的5'端連 接有-(CH2)n-p〇ly(T)m-、-p 〇ly(T)m-或 _(CH2)n_，其中，n、m為自然數。
[0014]優選地，η為6-10的自然數。
[0015] 優選地逆為10-30的自然數。
[0016] 優選地，n、m均為10。
[0017] 在本發明一實施例中，所述的多條探針檢測EGFR、KRAS和BRAF基因中任意兩個或 三個基因的突變位點；其中，所述EGFR基因的突變位點位于:EGFR基因的外顯子18~外顯子 21區域中的至少一個;所述KRAS基因的突變位點位于:KRAS基因的外顯子2~外顯子3區域 中的至少一個;所述BRAF基因的突變位點位于:BRAF基因的外顯子15區域。
[0018] 優選地，所述多條探針為SEQ ID NO: 1~SEQ ID N0:16所示的核苷酸序列組成的 探針組。
[0019] 本領域技術人員可以理解的，若摸索的檢測探針（比如，SEQ ID N0:1~SEQ ID NO: 16所示的核苷酸序列組成的探針組)獲得了較佳的雜交效果，一般情況下，設計探針的 時候，適當的將探針組中任一一條探針序列的長度延長或截短〇~3個堿基，也可以獲得不 錯的檢測效果，也應納入本發明保護范圍。
[0020]第二方面，本發明提供了一種用于單分子靶向測序的樣品的制備方法，包括:通過 封阻反應在待測DNA片段的3 '端修飾雙脫氧核糖核酸，獲得3 '端修飾有雙脫氧核糖核酸的 待測DNA片段;其中，封阻反應中，脫氧核糖核酸與待修飾的DNA片段的摩爾比為1: 25~1: 200 〇
[0021]在本發明一實施例中，所述的在待測DNA片段選自PCR產物、片段化的基因組DNA或 經純化的血液中的游離DNA。
[0022] 在本發明一實施例中，所述的PCR產物為采用多重PCR引物擴增待測樣品所得的多 重PCR產物，其中，所述的多重PCR引物為引物組，所述引物組中各引物的核苷酸序列為SEQ ID N0:17~SEQ ID N0:30所示。
[0023] 在本發明一實施例中，所述的雙脫氧核糖核酸修飾有光學檢測標記。
[0024]可以理解的是，本領域技術人員可以采用任一常規的方法在待測DNA片段的上修 飾雙脫氧核糖核酸；比如，可參照二代高通量測序文庫構建方法中加 A的方法進行DNA片段 的封阻;相比之下，本發明后續實施例中采用的封阻方法更佳，因為即便是對于對片段化的 基因組進行封阻，本發明后續實施例中采用的封阻方法也不需要進行末端補平即可直接進 行封阻反應，操作非常簡便。更優選地，可采用Terminal Transferase Kit(NEB，M0315L)或 等同的試劑體系進行封阻反應。更進一步地，本申請人對該商用試劑盒的封阻反應條件進 行多次優化，摸索出較佳的對DNA片段的3 '端修飾雙脫氧核糖核酸的封阻反應條件，當脫氧 核糖核酸與待修飾的DNA片段的摩爾比為1:100時，封阻效率可達到98%以上；而即使在該 摩爾比為1:25~1:200時，封阻效率仍然可達到70%~9%以上。
[0025]相比現有二代測序文庫的制備，本發明第二方面提供了的用于單分子靶向測序的 樣品的制備方法所獲得的3'端修飾有雙脫氧核糖核酸的待測DNA片段，可直接用于單分子 靶向測序，與5'端連接到基底表面的靶向引物進行雜交，進行測序反應;而不需要進行添加 測序接頭(adaptor)等步驟，極大簡化了測序樣品文庫的制備步驟。
[0026] 第三方面，本發明提供了 一種基于單分子靶向測序技術檢測EGFR/KRAS/BRAF基因 突變位點的方法，包括如下步驟：
[0027] (i)將靶向引物的5'端連接到基底表面;其中，所述的靶向引物為本發明第一方面 所述的探針；
[0028] (ii)提供或制備待測模板核酸，其中，所述的待測模板核酸的3'端修飾有帶光學 檢測標記的雙脫氧核糖核酸;將所述待測模板核酸與所述步驟(i )中連接到基底表面上的 靶向引物進行雜交，形成雜交的靶向引物/模板核酸復合物；
[0029] (i i i)對所述靶向引物/模板核酸復合物進行成像；
[0030] (iv)將所述靶向引物/模板核酸復合物、聚合酶以及一種或多種帶光學檢測標記 的核苷酸混合，通過聚合酶反應將一種或多種帶光學檢測標記的核苷酸添加至靶向引物鏈 的3'端;獲得延伸產物;其中，所述帶光學檢測標記的核苷酸還具有可斷裂的基團；
[0031] (V)對延伸后的靶向引物/模板核酸復合物進行成像，并結合步驟（iii)中靶向引 物/模板核酸復合物的定位結果，進行圖像比對和糾偏，以鑒定模板核酸上的待測核苷酸序 列；
[0032] (vi)除去延伸產物上帶光學檢測標記的核苷酸的可斷裂的基團：
[0033] (vi i)重復步驟(iii)至(vi)-次或多次以鑒定所述模板核酸中的1個或多個核苷 酸。
[0034] 本發明通過延伸反應、成像檢測和切除光學檢測標記分子的反復循環，實現單分 子靶向測序技術(SMTS)實時測序。
[0035]如本發明所述的，所述的"待測DNA片段"與"待測模板核酸"可以互換。
[0036]可以理解的是，可采用本領域常規的探針固定方法將本發明第一方面的探針序列 (即所述步驟(i)中的靶向引物)的5'端連接到基底表面。但申請人在研究過程中發現，不同