微生物檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物檢測方法，更詳細而言，涉及可降低被測試樣中所含的抗菌性 物質的影響、高精度地檢測對象微生物的微生物檢測方法。
【背景技術】
[0002] 在食品、醫藥品等領域中，為了確保質量、安全性，進行產品、原料的微生物檢查。 對于其試驗方法，各領域中規定了官方方法，對于醫藥品，日本藥典中收載了各種微生物試 驗方法。其中，對于非無菌制劑及其原料，規定了微生物限度試驗法，其中包括測量活菌數 的活菌數試驗和與特定的病原性微生物等相關的特定微生物試驗。進而，對于生藥，一般試 驗法5. 02中的生藥試驗法中規定了生藥的微生物限度試驗法。但是，在將微生物限度試驗 法應用到中藥提取物制劑及作為其原料的生藥的情況下，因它們中所含的抗菌性物質（包 含抗真菌性物質，以下同樣）的影響而對象微生物的生長繁殖受到抑制，因此存在無法準 確地檢測對象微生物的問題。
[0003] 為了除去被測試樣的抗菌活性，通常想到的是將抗菌活性滅活（抑制物質的中 和）、提高試樣液的稀釋率或者增加培養基的量、膜過濾等。但是，由于中藥提取物制劑及作 為其原料的生藥等中含有多種抗菌性物質，因此利用特定的滅活劑將所述抗菌性物質有效 地滅活是極其困難的。例如，已知有為了滅活抗菌性物質而在培養基中添加卵磷脂和聚山 梨醇酯的方法，然而雖然相對于對羥基苯甲酸酯類、汞等防腐劑的滅活可獲得高的效果，但 對于中藥提取物制劑的滅活，大多無法獲得充分的效果。實際上，在作為中藥原料的生藥中 含有從低分子到高分子的多種化合物，并且，這些化合物大多從分子結構方面看是特征性 的成分（萜類化合物、生物堿、黃酮類化合物、醌類、氨基酸、脂肪酸、糖類等），且含有許多 抗菌性物質（萜類化合物、生物堿、黃酮類化合物、鞣酸類等）。由于中藥提取物制劑包含多 種生藥，因此含有廣范圍的很多抗菌性物質。進而，中藥提取物制劑由于其制法而含有許多 不溶性微粒，無法使用用于除去抗菌性物質的通用的膜過濾。另一方面，若提高稀釋率或增 加培養基的量，則靈敏度降低，因此不能說是應當優先選擇的方法。
[0004] 針對這樣的問題，本申請人已經提出了通過在培養基中添加活性炭和酸性白土或 活性白土來除去被測試樣中的抗菌性物質的方法（專利文獻1)。該方法雖然在特定微生物 試驗中有用，但在利用使用瓊脂培養基的瓊脂平板混釋法（plate-count method)的活菌數 試驗中，培養基因活性炭而著色，并且培養基的透明度因酸性白土或活性白土而下降，因此 難以識別菌落。進而，由于不易將這些物質分離除去，因此存在難以準確地識別菌落而進行 測量的問題。
[0005] 現有技術文獻
[0006] 專利文獻
[0007] 專利文獻1 :國際公開第2008/038625小冊子

【發明內容】

[0008] 發明要解決的問題
[0009] 因此，期望開發出一種對含有多種抗菌性物質的中藥提取物制劑、生藥，在同一試 驗條件下可適用于特定微生物試驗和活菌數試驗這兩者而通用性高、能夠有效地降低被測 試樣中的抗菌性物質的影響、可高精度地檢測對象微生物的微生物檢測方法，本發明的課 題是提供這樣的微生物檢測方法。
[0010] 用于解決問題的方案
[0011] 本發明人等為解決上述課題而認真研究，結果發現：（甲基）丙烯酸酯系合成吸附 劑能夠將被測試樣中所含的各種抗菌性物質吸附除去，由于對微生物發育所需的營養成分 的吸附作用弱，因此可在不抑制對象微生物的發育的情況下提高檢測精度，進而即使添加 該吸附劑，培養基也不著色，吸附劑在作用之后也能夠容易地被清除，因此利用瓊脂平板混 釋法等也能進行準確的測量，從而完成了本發明。
[0012] 即，本發明為具有抗菌活性的被測試樣中的微生物檢測方法，其特征在于，包括： 制備含有具有抗菌活性的被測試樣的試樣液的工序和用培養基培養對象微生物的工序，在 所述微生物檢測方法中，使（甲基）丙烯酸酯系合成吸附劑作用于試樣液和/或培養基。
[0013] 發明的效果
[0014] 本發明的微生物檢測方法由于有效地將被測試樣中所含的抗菌性物質吸附除去， 因此可在培養時不抑制對象微生物的發育的情況下準確而精度良好地檢測對象微生物。另 外，由于能夠降低各種抗菌性物質的影響，因此作為檢測對象的微生物的范圍廣，而且可適 用于很多中藥提取物制劑或生藥等，適用對象廣泛、通用性高。進而，即使在培養基中添加 本發明所使用的（甲基）丙烯酸酯系合成吸附劑，培養基也不著色或不透明化，吸附劑在作 用之后也能夠容易地被分離除去，因此利用瓊脂平板混釋法等也能夠準確地識別菌落，可 迅速、準確地測量。
【附圖說明】
[0015] 圖1是在實施例6中，以大黃甘草湯為被測試樣，將枯草桿菌(Bacillus subtilis)的添加回收率對稀釋倍數作圖而成的圖表。
[0016] 圖2是在實施例6中，以大承氣湯為被測試樣，將枯草桿菌的添加回收率對稀釋倍 數作圖而成的圖表。
【具體實施方式】
[0017] 本發明方法是用于檢測具有抗菌活性的被測試樣中的微生物的方法，其特征在 于，該方法包括制備含有被測試樣的試樣液的工序和用培養基培養對象微生物的工序，在 所述方法中，使（甲基）丙烯酸酯系合成吸附劑作用于試樣液制備工序中的試樣液和培養 工序中的培養基中的任意一者或兩者。
[0018] 作為具有抗菌活性的被測試樣（以下，有時簡稱為"被測試樣"），可以舉出中藥 提取物制劑、生藥等。中藥提取物制劑是對用水、乙醇等水溶性溶劑提取中藥處方而成的 提取物成分進行制劑化而成的制劑，對其劑型沒有特別限定，為粉末、顆粒劑、片劑、液體制 劑、丸劑、膠囊劑等均可。另外，中藥是古代中國所著的醫學書中所記載的生藥的配混比、 使用的標準（癥狀）傳到日本并獨自地發展而成的，中藥處方是根據處方來決定生藥的種 類和配混比例。作為中藥處方的具體例，可以例示葛根湯、葛根湯加川芎辛夷、乙字湯、安 中散、十味敗毒湯、八味地黃丸、大柴胡湯、小柴胡湯、柴胡桂枝湯、柴胡桂枝干姜湯、柴胡加 龍骨牡蠣湯、半夏瀉心湯、黃連解毒湯、半夏厚樸湯、五苓散、桂枝加術附湯、小青龍湯、防已 黃芪湯、小半夏加茯苓湯、消風散、當歸芍藥散、加味逍遙散、桂枝茯苓丸、桂枝加龍骨牡蠣 湯、麻黃湯、越婢加術湯、麥門冬湯、真武湯、吳茱萸湯、人參湯、大黃牡丹皮湯、白虎加人參 湯、四逆散、木防已湯、半夏白術天麻湯、當歸四逆加吳茱萸生姜湯、苓桂術甘湯、豬苓湯、補 中益氣湯、六君子湯、桂枝湯、七物降下湯、釣藤散、十全大補湯、荊芥連翹湯、潤腸湯、薏苡 仁湯、疏經活血湯、抑肝散、麻杏甘石湯、五淋散、溫清飲、清上防風湯、治頭瘡一方、桂枝加 茍藥湯、桃核承氣湯、防風通圣散、五積散、炙甘草湯、歸脾湯、參蘇飲、女神散、茍藥甘草湯、 茯苓飲、香蘇散、四物湯、甘麥大棗湯、柴陷湯、調胃承氣湯、四君子湯、龍膽瀉肝湯、芎歸膠 艾湯、麻杏薏甘湯、平胃散、柴胡清肝湯、二陳湯、桂枝人參湯、抑肝散加陳皮半夏、大黃甘草 湯、神秘湯、當歸飲子、六味丸、二術湯、治打撲一方、清肺湯、竹茹溫膽湯、滋陰至寶湯、滋陰 降火湯、五虎湯、柴樸湯、大防風湯、黃芪建中湯、小建中湯、大建中湯、升麻葛根湯、當歸湯、 酸棗仁湯、辛夷清肺湯、通導散、溫經湯、牛車腎氣丸、人參養榮湯、小柴胡湯加桔梗石膏、立 效散、清心蓮子飲、豬苓湯合四物湯、三黃瀉心湯、柴苓湯、胃苓湯、茯苓飲合半夏厚樸湯、茵 陳五苳散、苳姜術甘湯、苳甘姜味辛夏仁湯、黃連湯、三物黃苳湯、排膿散及湯、當歸建中湯、 川考茶調散、桂枝茯苳丸加薏該仁、麻子仁丸、麻黃附子細辛湯、啟脾湯、大承氣湯、桂枝加 芍藥大黃湯、茵陳蒿湯、清暑益氣湯、加味歸脾湯、桔梗湯等，這些中藥處方的生藥的組合、 配混比率被記載于"漢方醫薬品集"（財団法人日本醫薬情報七y夕一編，平成23年出版）、 "改訂一般用漢方処方ω手引g "（財団法人日本公定書協會監修，日本漢方生薬製剤協會 編，平成21年出版）等。
[0019] 另外，生藥是對動植物的藥用部分、細胞內容物、分泌物、提取物或礦物進行清洗、 去皮、切斷、干燥、篩選等加工后而得到的物質。作為具體例，可以例示阿膠、棕兒茶、大茴 香籽、威靈仙、茵陳蒿、淫羊藿、茴香、烏藥、延胡索、黃芪、黃芩、黃柏、櫻皮、黃連、遠志、艾 葉、訶子、何首烏、葛根、滑石、兒茶、洋甘菊、瓜蔞根、瓜蔞仁、干姜、甘草、桔梗、枳實、菊花、 纈草根、羌活、杏仁、金銀花、枸杞子、苦參、荊芥、桂皮、決明子、老鶴草、膠飴、紅花、香附子、 粳米、厚樸、牛黃、牛膝、吳茱萸、牛蒡子、胡麻、五味子、柴胡、細辛、山楂、山梔子、山茱萸、山 椒、酸棗仁、山藥、地黃、地骨皮、紫根、蒺藜子、炙甘草、芍藥、車前子、車前草、庶蟲、十藥、縮 砂、生姜、松藤、小麥、菖蒲根、升麻、辛夷、神曲、石決明、石膏、川芎、石楠葉、美遠志、前胡、 川骨（nuphar rhizome)、蝴銳、番瀉葉、蒼術、阜角刺、桑白皮、桑根皮、蘇木、蘇葉、大黃、 大率、澤瀉、竹節、竹節人參、知母、茶葉、丁香、釣藤鉤、豬苳、陳皮、天南星、天麻、天門冬、 橙花、冬瓜子、當歸、橙皮、桃仁、當藥、獨活、杜仲、動物膽、人參、忍冬、貝母、麥芽、麥門冬、 巴豆、薄荷、北沙參、半夏、百合、白芷、白術、枇杷葉、檳榔、茯苓、附子、制附子（Specific Processed Aconite Root)、加工附子（Powdered Processed Aconite Root)、防已、茅根、芒 硝、防風、樸嗽、牡丹皮、蛇麻草、牡、麻黃、麻子仁、蜜蜂花葉、木通、木防已、木香、益智、益 母草、熊膽、薏該仁、薰衣草花、龍眼肉、龍骨、龍膽、良姜、連翹、蓮子和羌活等，大黃、甘草和 黃連特別有用。
[0020] 制備含有上述被測試樣的試樣液。在被測試樣為液體的情況下，可以將其直接作 為試樣液。在被測試樣為固態物質的