多分析物試驗的制作方法
【專利說明】多分析物試驗
[0001] 相關申請的交叉參考
[0002] 本申請要求2013年3月4日提交的美國臨時專利申請No. 61/772, 518和 61/772,521的益處。將那些申請的每一篇的公開內容全部按引用并入本文中。 發明領域
[0003] 本發明涉及利用固定于顆粒上的多價結合劑的結合試驗，尤其是免疫試驗。本發 明還涉及增大顆粒的大小提高了篩選的敏感性這一令人驚訝的發現。
[0004] 發明背景
[0005] 測試液體樣品的細菌污染是各種領域中的重要組成部分，如醫學（例如，測試用 于輸血的血樣）、環境安全（例如，測試用于人使用的水樣）和食品安全（例如，測試用于食 用的食品和飲料樣品）。細菌測試的重要性需要快速、靈敏和特異性足夠寬泛以檢測多種細 菌種和屬的測試。試驗中的實際限制，如檢測劑（例如，細菌抗原結合抗體）的量或"陽性" 結果的可視性可以控制目前的細菌測試方法來滿足這些需求的能力。因此，需要用于快速、 寬泛和靈敏地檢測細菌的改良試劑、裝置和方法。
[0006] 發明簡述
[0007] 在第一個方面中，本發明提供了用于檢測樣品中的細菌的側向流動裝置，該裝 置包括用于樣品的流動通道，并且進一步包括對于一種或多種細菌抗原特異性的全類屬 (pan-generic)結合劑，其中所述全類屬結合劑通過銜接物固定于一群特定大小的可檢測 顆粒上；和捕獲結合細菌抗原的顆粒群的捕獲結合劑，其中捕獲結合劑固定于流動通道上， 并且其中可檢測顆粒群沿著流動通道排列，使得樣品在與捕獲結合劑接觸之前與可檢測顆 粒群接觸。在一些實施方案中，可檢測顆粒是化學發光、發光、熒光、磁或有色顆粒。為了方 便，將使用術語"有色顆粒"，但本發明考慮了使用其他形式的可檢測顆粒的實施方案。在利 用有色顆粒的實施方案中，顆粒可以是金、銀或鉑顆粒。在一些實施方案中，顆粒直徑為約 60至約120nm。在一些實施方案中，顆粒直徑為約80nm。
[0008] 在一些實施方案中，全類屬結合劑特異性地結合革蘭氏陽性細菌抗原。在一些這 樣的實施方案中，全類屬多克隆抗體結合脂磷壁質酸（LTA)。在一些實施方案中，全類屬結 合劑特異性地結合革蘭氏陰性細菌抗原。在一些這樣的實施方案中，全類屬多克隆抗體結 合細菌脂多糖結構（LPS)。在一些實施方案中，至少一種全類屬結合劑特異性地結合革蘭 氏陽性細菌抗原而至少一種全類屬結合劑特異性地結合革蘭氏陰性細菌抗原。在一些實施 方案中，全類屬結合劑能夠結合三個或更多個屬的細菌。在一些實施方案中，銜接物是蛋白 A、蛋白G或蛋白L。
[0009] 在一些實施方案中，全類屬結合劑是抗體。在一些實施方案中，全類屬結合劑包括 兩種或更多種全類屬抗體，其中每種全類屬抗體特異性地結合一種或多種細菌抗原。在各 種實施方案中，每種全類屬抗體固定于有色顆粒的分開亞群上或相同的亞群上。在一些實 施方案中，可以將全類屬結合劑與一種或多種非全類屬的結合劑組合。例如，不是全類屬的 結合劑可以結合一個或多個種或菌株的細菌，但不是結合到多個屬上。
[0010] 在一些實施方案中，一個或多個顆粒群包括第一個顆粒群和第二個顆粒群。在一 些實施方案中，第一個顆粒群具有一種或多種對一種或多種第一個抗原群具有特異性的結 合劑，而第二個顆粒群具有一種或多種對一種或多種第二個抗原群具有特異性的結合劑， 其中第一個一種或多種抗原群和第二個一種或多種抗原群彼此不同。
[0011] 在一些實施方案中，全類屬抗體選自多克隆抗體、單克隆抗體以及多克隆和單克 隆抗體的組合。在一些實施方案中，全類屬抗體是多克隆的，并且結合多種細菌抗原。在一 些實施方案中，全類屬抗體是多克隆的并且結合多種革蘭氏陽性細菌抗原。在一些實施方 案中，全類屬抗體是多克隆的并且結合多種革蘭氏陰性細菌抗原。在一些實施方案中，全類 屬抗體是多克隆的，并且結合多種革蘭氏陰性細菌抗原和革蘭氏陽性細菌抗原。在一些實 施方案中，至少一種全類屬抗體是單克隆全類屬抗體和至少一種全類屬抗體是多克隆全類 屬抗體。
[0012] 在一些實施方案中，全類屬抗體特異性地結合革蘭氏陽性細菌抗原。在一些實施 方案中，全類屬抗體特異性地結合革蘭氏陰性細菌抗原。在一些實施方案中，至少一種全類 屬抗體特異性地結合革蘭氏陽性細菌抗原和至少一種全類屬抗體特異性地結合革蘭氏陰 性細菌抗原。在一些實施方案中，全類屬抗體能夠結合三個或多個屬的細菌。
[0013] 在一些實施方案中，裝置包括至少三種特異性地結合革蘭氏陽性細菌抗原的全類 屬結合劑，每種全類屬結合劑固定于有色顆粒的分開亞群上；和至少三種特異性地結合革 蘭氏陰性細菌抗原的全類屬結合劑，每種全類屬結合劑固定于有色顆粒的分開亞群上。在 一些實施方案中，至少一種全類屬結合劑是抗體。在一些實施方案中，至少一種全類屬抗體 是單克隆抗體。在一些實施方案中，顆粒的亞群是不同大小的。在一些實施方案中，顆粒是 金、銀或鉑。在一些實施方案中，至少一些顆粒的直徑為約20nm至約120nm。在一些實施方 案中，至少一些顆粒是直徑約20nm至約120nm的金顆粒。在一些實施方案中，至少一個顆 粒群（例如，金顆粒群）包括80nm顆粒。在一些實施方案中，至少一個顆粒群（例如，金顆 粒群）包括40nm顆粒。
[0014] 在一些實施方案中，捕獲結合劑是特異性地結合細菌抗原的全類屬抗體。在一些 實施方案中，捕獲結合劑與全類屬結合劑相同。在一些實施方案中，捕獲抗體固定于樣品流 動通道上的一個或多個位置中。在一些實施方案中，樣品流動通道是吸收膜。在一些實施 方案中，吸收膜是硝基纖維素。
[0015] 在一些實施方案中，將有色顆粒在安置在吸收膜上并且與膜的上表面接觸的固體 支持物表面內干燥。
[0016] 在第二個方面中，本發明提供了檢測樣品中存在或不存在細菌的方法，包括使樣 品與細菌抗原特異性的全類屬結合劑接觸，其中全類屬結合劑通過銜接物固定于有色顆粒 上，并且其中使樣品在允許全類屬結合劑和細菌抗原之間結合形成結合劑-細菌抗原復合 物的條件下與全類屬結合劑接觸，并且進一步包括使固定的細菌抗原特異性的捕獲結合劑 在允許固定的捕獲結合劑和顆粒-全類屬結合劑-細菌抗原復合物之間結合的條件下與 有色顆粒接觸，其中通過捕獲結合劑捕獲帶有全類屬結合劑的有色顆粒表明樣品中存在細 菌。在一些實施方案中，在進行試驗前，將少量可溶性全類屬結合劑添加到樣品中。如此少 量是足以提高系統信號的量。
[0017] 在一些實施方案中，該方法包括使根據本發明第一個方面的裝置在允許捕獲抗體 結合帶有全類屬抗體的有色顆粒的條件下與全類屬抗體接觸，其中通過捕獲抗體捕獲顆粒 表明樣品中存在細菌。
[0018] 在一些實施方案中，樣品已經經過預處理。
[0019] 根據本發明，樣品可以是懷疑含有細菌的任何液體樣品。在一些實施方案中，樣品 是生物流體，包括尿液、痰液、脊髓液、腹水、血液和血液制品。在一些實施方案中，樣品是懷 疑含有細菌的任何樣品。在一些實施方案中，樣品是血液或血液制品。在一些實施方案中， 血液或血液制品選自：全血、白血球、造血干細胞、血小板、紅細胞、血漿、骨髓和血清。
[0020] 在一些實施方案中，血液或血液制品，如血小板，來自用于輸血給接受者的捐獻 者。在一些實施方案中，樣品是透析樣品。在一些實施方案中，透析樣品選自血液透析流體 和腹膜透析流體。在一些實施方案中，樣品是其中已經保存了組織（如來自用于輸血給接 受者的捐獻者的組織）的流體樣品。在一些實施方案中，組織選自：血細胞培養物、干細胞 培養物、皮膚和骨和軟骨移植物材料。在一些實施方案中，樣品是來自肺、支氣管肺泡、腹膜 或關節內窺鏡檢查灌洗的樣品。在一些實施方案中，樣品是環境樣品，如水和土壤。在一些 實施方案中，樣品是食物或飲料。本領域技術人員將認識到在其中樣品來源是固體形式的 情況中，如土壤或固體食物，樣品可以是從固體形式提取的液體或已經與固體形式接觸的 液體。在一些實施方案中，樣品是生物樣品，例如，尿液、淚液、痰液或腦脊髓液。
[0021] 在第三個方面中，本發明提供了用于結合試驗中的試劑，包括選自金顆粒、銀顆粒 和鉑顆粒的顆粒，其中顆粒大小為約20nm至約120nm，并且其中顆粒通過銜接物結合多特 異性全類屬結合劑。在一些實施方案中，顆粒大小約80nm。在一些實施方案中，銜接物選自 蛋白A、蛋白G和蛋白L。在一些實施方案中，銜接物是蛋白A。在一些實施方案中，顆粒是 金。
[0022] 在第四個方面中，本發明提供了檢測樣品中的物質的方法，包括將樣品與根據本 發明第三個方面的試劑混合，其中物質與試劑的結合形成可檢測的復合物；并且檢測復合 物。
[0023] 在第五個方面中，本發明提供了制備具有非常高的銜接物表面密度并且由此具有 非常高的結合劑表面密度的顆粒的方法。根據這個方面的方法包括用高濃度的銜接物孵育 有色顆粒。
[0024] 在第六個方面中，本發明提供了利用兩個或更多個可檢測顆粒群檢測多分析物樣 品中的分析物的基于結合可檢測顆粒的結合劑的裝置，其中第一個可檢測顆粒群是直徑為 約20nm至約60nm的顆粒而第二個可檢測顆粒群為直徑大于約60nm至約120nm的顆粒。在 某些實施方案中，第一個可檢測顆粒群結合到一種或多種對第一個分析物群具有特異性的 結合劑上而第二個可檢測顆粒群結合到一種或多種對第二個分析物群具有特異性的結合 劑上。
[0025] 在第七個方面中，本發明提供了用于檢測樣品中的細菌的測向流動裝置，該裝置 包括用于樣品的流動通道，并且進一步包括特異性地結合細菌抗原的結合劑，其中結合劑 固定于兩個或更多個可檢測顆粒群上。在某些實施方案中，第一個顆粒群包括直徑為約 20nm至約60nm的顆粒而第二個顆粒群包括直徑大于約60nm至約120nm的顆粒。在進一步 的實施方案中，第一個顆粒群結合到一種或多種對第一個分析物群具有特異性的結合劑上 而第二個顆粒群結合到一種或多種對第二個分析物群具有特異性的結合劑上。在再進一步 的實施方案中，固定于流動通道上的捕獲結合劑捕獲一個或多個顆粒群。在這些實施方案 中，可檢測顆粒群沿著流動通道排列，使得樣品在與捕獲結合劑接觸之前與可檢測顆粒群 接觸。
[0026] 在第八個方面中，本發明提供了檢測樣品中的分析物的方法，包括使樣品與一種 或多種對一種或多種分析物具有特異性的結合劑接觸。在這些實施方案中，將一種或多種 結合劑固定于兩個或更多個可檢測顆粒群上。在某些實施方案中，第一個可檢測顆粒群包 括直徑為約20nm至約60nm的顆粒而第二個可檢測顆粒群包括直徑大于約60nm至約120nm 的顆粒。在進一步的實施方案中，第一個可檢測顆粒群結合到一群對第一個分析物群具有 特異性的一種或多種結合劑上而第二個可檢測顆粒群結合到一群對第二個分析物群具有 特異性的一種或多種結合劑上。在再進一步的實施方案中，使樣品在允許結合劑和分析物 之間結合的條件下與一種或多種結合劑接觸，其中結合劑被分析物結合表明樣品中分析物 的存在。
[0027] 在第九個方面中，本發明提供了提高結合試驗中檢測多分析物樣品中的多種分析 物與結合顆粒的結合劑的結合的特異性和/或敏感性的方法，包括使樣品與一種或多種對 一種或多種分析物具有特異性的結合劑接觸。在這些實施方案中，一種或多種結合劑固定 于兩個或更多個可檢測顆粒群上，其中第一個可檢測顆粒群包括直徑為約20nm至約60nm 的顆粒而第二個可檢測顆粒群包括直徑大于約60nm至約120nm的顆粒。在某些實施方案 中，第一個可檢測顆粒群結合到對第一個分析物群具有特異性的一種或多種結合劑上而第 二個可檢測顆粒群結合到對第二個分析物群具有特異性的一種或多種結合劑上。在進一 步的實施方案中，使樣品在允許結合劑和分析物之間結合的條件下與一種或多種結合劑接 觸，并