混雜藻酸鹽-二氧化硅珠粒及其獲取方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及混雜藻酸鹽-二氧化硅珠粒，并且涉及制備這些混雜珠粒的一鍋工藝 法。
[0002] 本發明還涉及根據本發明的珠粒的用途。本發明的珠粒適用于范圍廣泛的領域， 例如，生物反應器，生物催化劑，生物傳感器，色譜柱等領域內包載（捕獲，截留包載，截獲， entrapment)生物活性體。具體而言，根據本發明的新珠粒適用于包載酶，細胞器如類囊體 (thylakoids)，液泡，葉綠體，囊泡或用于包載全細胞如微藻，細菌，酵母，動物或植物細胞。 這種包載旨在生產高價值的代謝產物，如類胡蘿卜素，激素，蛋白質，（經加工的）前藥或其 混合物。
【背景技術】
[0003] 藻酸鈣膠囊能夠通過將藻酸鈉溶液擠出到氯化鈣的水溶液溶液中很容易地合成 并能夠保持包載的活體微生物的生物活性。然而，已經證明這些藻酸鈣膠囊機械穩定性差。 人們已知的是，藻酸鹽是溶脹組分，隨時間推移而導致包載的組分，包括隨后能夠釋放并可 以在外部介質中增殖的活細胞泄漏。實際上，在整個珠粒體積上都觀察到裂縫而膠囊的強 度從表面到是核（芯，芯部，core)降低。因此，藻酸鹽膠囊似乎并非是囊封包括活細胞的 組分的合適宿主基質。
[0004] 表現出機械耐受性有限的混雜藻酸鹽-二氧化硅膠囊的合成已經有報道。最 常用的方法涉及多步工藝方法或層疊層（layer-by-layer)工藝方法。混雜藻酸鹽-二 氧化娃礦化珠粒通過兩步工藝方法的合成已由Dandoy等（P. Dandoy, C. F. Meunier, C. Michiels，B.-L. Su，Plos 0ne，2011，6，l-12)公開。所獲得的珠粒由兩層構成，一層藻酸 鹽-二氧化硅復合核和一層藻酸鈣層，其適用于包載活性哺乳動物細胞。然而，二氧化硅的 溶解是隨著時間的推移而發生的現象，并導致在外部介質中釋放珠粒內容物。
[0005] 專利申請FR 2842438 A1公開了一種制備含有交聯的礦物基質的珠粒的方法。所 述方法適合于通過溶膠-凝膠方法制備氧化鋁類或二氧化硅類毫米級珠粒。這些珠粒的生 產包括通過將包含無機基質的前體和藻酸鹽的懸浮液在pH小于3滴入多價陽離子鹽的溶 液中而制備凝膠化的珠粒的步驟。所述多價陽離子和所述介質的酸度變化的組合作用有助 于這種藻酸鹽凝膠化并有助于所述液滴凝結（congealing)成"軟"珠粒。因此，所述礦物 基質均勻地分布于整個珠粒中。然而，二氧化硅的溶解隨時間發生于這些制備的混雜藻酸 鹽-二氧化娃珠粒內，這已經被Dandoy等（Dandoy et al，2011)觀察到。
[0006] Chen 等（Chen et al.，Process biochemistry vol 42,No. 6,ρρ· 934-942,2007) 公開了用于偶氮染料（反應紅22)脫色的包含淺黃假單胞菌（Pseudomonus Puteola)細胞 的藻酸鹽-硅酸鹽珠粒。這些珠粒由致密硅酸鹽凝膠層涂層的大孔藻酸鹽-硅酸鹽核制成， 具有改善的機械穩定性。
[0007] Coradin 等（Coradin et al., Applied microbiology and biotechnology, Vol. 6 1，No. 5-6, pp. 429-434, 2003)公開了二氧化硅-藻酸鹽復合微囊表現出的膜性能的優化可 以增強其機械、熱和擴散性能。
[0008] US 4, 797, 358公開了一種采用藻酸鹽和二氧化硅溶膠的混合物的微生物或酶固 定化作用。這種混合物與水性溶液形式的膠凝劑接觸而獲得含有這種微生物或酶的凝膠。
[0009] Lu等（Lu et al，Catalysis today, Vol. 115, No. 1-4, ρρ· 263-268, 2006)公開了囊 封于藻酸鹽-二氧化硅混雜凝膠和藻酸鹽二氧化硅凝膠珠粒中的酶。

【發明內容】

[0010] 發明目的
[0011] 本發明的主要目的是提供新混雜藻酸鹽-二氧化硅珠粒和獲得它們的方法，這兩 者都不會呈現出現有技術的缺點。
[0012] 具體而言，本發明的目的是提供新的、優選透明的且優選球形的珠粒，以及獲得它 們的生態友好且有效的簡單一鍋方法（one-pot method)，這些珠粒顯示出良好的機械和化 學穩定性的特性，并且其中二氧化硅物質隨著時間推移的溶解速率降低或得以防止。
[0013] 本發明進一步的目的是提供這種能夠用于各種領域內，特別是適用于包載組分或 生物活性物質，如酶，細胞器，如類囊體、液泡、葉綠體、囊泡，以及整個細胞如微藻、細菌、酵 母、植物或動物細胞的珠粒。
[0014] 本發明的主要摶術特征
[0015] 本發明涉及具有毫米級尺寸適用于包載（并優選包含）組分或生物活性物質的 (混雜二氧化硅）珠粒，其中該珠粒包括多孔核和多孔殼，該多孔核包括混雜藻酸鹽-二氧 化娃而外層多孔殼包括二氧化娃和二氧化娃濃縮劑（concentrator)(如聚陽離子有機聚 合物）構成。
[0016] 優選地，毫米級尺寸的直徑范圍為（約）0. 5mm-(約）5_。多孔殼的厚度優選介于 (約）1 μ m和（約）10 μ m之間。殼包含具有尺寸范圍（約）lnm-(約）500nm的孔。
[0017] 在本發明中，藻酸鹽（藻酸）定義為一種廣泛分布于褐藻細胞壁內的陰離子多糖。 藻酸鹽是一種線性共聚物，具有（1-4)-連接的β-D-甘露糖醛酸（M)和其C-5差向異構體 a -L-葡糖醛酸（G)殘基的均聚嵌段，分別以不同的序列或嵌段共價連接一起。化學化合物 藻酸鈉是藻酸的鈉鹽。其經驗式是NaC6H706。藻酸鈉是一種樹膠，從褐藻的細胞壁中提取出 來。
[0018] 根據本發明的（混雜）珠粒有利地通過凝聚工藝方法進行制備，這種方法由于添 加二氧化硅濃縮劑（如聚陽離子有機聚合物），因而依賴于含有一種或多種二氧化硅前體 和藻酸鹽溶液的混雜溶膠的溶解度的降低。事實上，藻酸鹽起到模板（template)作用而二 氧化娃濃縮劑既起到娃酸鹽濃縮劑的作用又起到加速二氧化娃前體在珠粒外圍水解和縮 聚的催化劑的作用，從而產生多孔硬殼（殼）。珠粒的核由藻酸鈉-二氧化硅復合材料構 成，其中組分或生物活性物質，如酶，細胞器如類囊體、液泡、葉綠體、囊泡、或活細胞被囊封 (包載）。珠粒所獲得的外層（殼）由通過二氧化硅濃縮劑濃縮的二氧化硅多孔層形成。
[0019] 根據優選的實施方式，混雜二氧化硅珠粒進一步受限于一種或多種以下技術特 征：
[0020] -用于制備珠粒的二氧化硅前體選自由聚硅酸（H2Si03)n (優選偏硅酸H2Si03)，有 機改性硅酸鹽（ormosils)(有機改性二氧化硅），二氧化硅氫氧化物，二氧化硅烷氧化物 (如四甲基原硅酸鹽（TMOS)，四乙基原硅酸鹽（TEOS)，四丙基原硅酸鹽（TPOS)，四（2-羥基 乙基）原硅酸鹽（EGMS)，四（2-羥基丙基）原硅酸鹽（PGMS)和四（2, 3-二羥基丙基）原硅 酸鹽（GLMS))，硅酸鹽（如硅酸鈉（Na2Si03)或硅酸鉀），二氧化硅納米粒子，山梨糖基硅烷， 三甲氧基甲基硅烷，二甲氧基二甲基硅烷，TM0S(四甲氧基硅烷），DGS (二甘油基硅烷），或 其混合物組成的組；
[0021] -二氧化硅濃縮劑是聚陽離子有機聚合物，優選長鏈聚胺，優先選自由聚陽離子 聚氯化（二烯丙基二甲基銨）（PDADMAC);精胺；膽固醇精胺；亞精胺；亞精胺三鹽酸鹽 (tryhydrochloride);亞精胺磷酸鹽六水合物：L-精氨酰基-3, 4-亞精胺；1，4- 丁二胺 (3-氨基丙基）-單鹽酸鹽；腐胺（1,4-二氨基丁燒）；1,3-二氨基丙烷；1,7-二氨基庚 烷；1，8-二氨基辛烷；聚（烯丙基胺）鹽酸鹽；聚（乙撐亞胺）；聚（N-甲基乙撐亞胺）；聚 (N-乙烯基-2-吡咯烷酮）；聚（2-(二甲基氨基）乙基甲基丙烯酸酯；殼聚糖；聚（乙烯基 胺）鹽酸鹽；聚（丙撐亞胺）；聚（N-甲基丙撐亞胺）；聚氯化（丙烯酰胺-共-二烯丙基 二甲基銨）；聚-L-賴氨酸，聚-L-精氨酸和聚-L-組氨酸或其混合物組成的組；
[0022] -優選的長鏈聚胺是PDADMAC ;
[0023] -珠粒形成中使用的藻酸鹽可以是堿金屬的藻酸鹽，優選藻酸鈉；
[0024] _(外層）多孔殼包含具有尺寸范圍（約）1_(約）500nm的孔；
[0025] -(外層）多孔殼的厚度介于（約）1和（約）10 μ m之間；
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