耐高溫甘藍型油菜乙二醛酶基因和蛋白及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及突變和遺傳工程技術領域；尤其涉及一種耐高溫甘藍型油菜乙二醛 酶基因和蛋白及其應用；具體涉及一種耐高溫甘藍型油菜乙二醛酶基因（Glyoxalase I， BnGLYI)的核苷酸序列，涉及耐高溫BnGLH的蛋白質的氨基酸序列，BnGLYI基因在畢赤酵 母中表達的重組菌株，涉及使用該基因構建表達酵母表達載體，還涉及利用上述基因序列 進行酵母轉化的方法。
【背景技術】
[0002] 種子為我們供應大多數食物和重要來源的動物以及工業原料，高質量的種子對社 會經濟具有重要的意義[1]。很多生物和非生物因素影響種子活力萌發和耐貯性，例如環境 溫度較高或者種子在儲藏過程中因自身氧化產生的高溫可能降低種子活力、減緩或完全抑 制發芽[2]。然而，雖然目前已經有部分研宄探討了植物耐高溫性分子方面、生理和遺傳學研 宄[2]，但是對種子耐熱性的研宄還比較稀少。
[0003] 甲基乙二醛（Methylglyoxal，MG)是一種細胞毒素的代謝物，MG產生于糖酵解、氨 基酸分解代謝、丙酮的正常代謝和環境逆境脅迫，在微生物、酵母、動物以及高等植物中都 存在 [3]。生物體內對MG的代謝主要是在乙二醛酶（glyoxalase，GLY)途徑完成的，該途徑 包括兩個酶，即乙二醛酶I(GLYI)和乙二醛酶II(GLYII)，是一種胞內酶，普遍存在于各種 細胞器中。首先在GLH作用下將MG和谷胱甘肽（glutathione，GSH)縮合成生成S-D-乳 酸谷胱甘肽，降低MG的生理活性濃度，接著在GLH的作用下將S-D-乳酸谷胱甘肽水解成 無毒的GSH和D-乳酸[4]。近年來，研宄發現GLH基因是一個含多基因的基因家族[5]，不僅 參與植物生長發育過程，還在植物應對生物脅迫，及重金屬、高鹽、干旱等非生物脅迫產生 的應答反應和緩解其造成的損傷等方面起重要作用 [5] [6] [7]，但在高等植物中，有關GLH基 因是否具有耐熱性功能還鮮為報道。2002年，分離獲得騰沖噬熱厭氧菌中的耐高溫甲基乙 二醛合酶基因 [8]。2010年，研宄發現轉化香蕉乙二醛酶基因的釀酒酵母細胞抵抗極端溫度 的能力大幅度提高[9]。
[0004] 參考文獻
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[0012] [8]李蔚，于軍，鐘蘭，王俊，孫建東，杭州華大基因研發中心，耐高溫甲基乙二醛合 酶基因序列及編碼的多肽和制備方法。申請號01132107. 5,公開號CN1364907。
[0013] [9]鄧成菊，張建斌，賈彩紅，金志強，徐碧玉。香蕉乙二醛酶基因增強釀酒酵母對 非生物脅迫抵抗能力的研究。中國生物工程雜志，2010,30(8) :22-26。

【發明內容】

[0014] 本發明的目的就在于克服現有技術存在的問題和不足，提供一種耐高溫甘藍型油 菜乙二醛酶基因和蛋白及其應用。
[0015] 本發明的目的是這樣實現的：
[0016] 我們在甘藍型油菜耐熱種質資源中分離得到甘藍型油菜的乙二醛酶基因BnGLYI， 并通過酵母細胞的外源表達證明該基因具有耐熱性和耐冷性，并且該基因與騰沖噬熱厭氧 菌的耐熱GLH基因有很大的差異，兩者氨基酸的同源性僅為26%。因此，本發現不僅發現 了甘藍型油菜BnGLH基因的新功能，并且為轉基因工程菌和植物提供新的耐熱、耐冷基因 來源，進而提高工程菌和植物轉基因產品的耐熱效果，具有重要的經濟、社會和生態效益。
[0017] -、耐高溫甘藍型油菜乙二醛酶BnGLYI基因和蛋白
[0018] 針對目前世界糧食作物和油料作物儲藏面臨的問題，以及對高溫及伴隨的干旱與 其它逆境對植物生產和生長的影響與損失，本發明從耐熱的甘藍型油菜種質資源中分離克 隆了新的基因BnGLYI，該基因表達產物使酵母細胞對高溫和低溫具有較高的抗性，而本發 明提供的該基因表達產物的氨基酸序列與已知的GLH蛋白存在一定差異，并且我們首次 揭示了GLH的耐熱和耐冷性。這種新的基因可以應用于轉化微生物和植物，使之表現對溫 度脅迫的耐性。
[0019] 本發明提供一種對甘藍型油菜種子耐熱和耐冷性有貢獻的BnGLH基因序列，以 應用于轉化微生物和植物，使之表現出對相關生物和非生物脅迫的抗逆性。
[0020] 甘藍型油菜種質資源3382,由國家自然科技資源e平臺（國家農作物種質資源平 臺）提供，其保藏號為00003382,可保證20年提供共享利用。
[0021] 甘藍型油菜耐熱性BnGLYI基因，其核苷酸序列如SEQIDN01所示；
[0022] 甘藍型油菜耐熱性BnGLYI蛋白，由上述BnGLYI基因所編碼，其氨基酸序列如SEQ IDN02所示。
[0023] 二、耐高溫甘藍型油菜乙二醛酶BnGLYI基因和蛋白的應用
[0024] ①BnGLYI基因在轉基因微生物中的應用
[0025]轉化BnGLYI基因的畢赤酵母菌株GSGLYI，獲得耐熱性和耐冷性；
[0026] ②BnGLYI基因在植物抗逆性中的應用。
[0027] 所述應用為將含有BnGLYI基因的表達載體轉化微生物或植物，使之產生耐熱和 耐冷性。
[0028] 三、具體技術方案由以下步驟實現：
[0029] ①通過耐熱性甘藍型油菜中的篩選，發現甘藍型油菜3382的耐熱性遠遠高于其 他油菜品種；對篩選得到的耐熱種質進行雙向電泳的分析，發現一個約21kD的小分子蛋白 在熱處理后是處理前表達量的2倍；該蛋白點進行質譜分析，發現該蛋白的氨基酸同源性 與芥菜型油菜BjGLYI的同源性高，score值達到了 117。
[0030] ②提取甘藍型油菜種子的RNA，并反轉錄成CDNA為模版，以引物對進行BnGLH編 碼區域的擴增與克隆：
[0031] BnGLYI F j'-ATGGCGTCGGAAGCGAAGG-S'，如SEQ ID N03所示；
[0032] BnGLYRj^TCAAGCTGCGTTTCCGGCTG-S'如SEQIDN04所示。
[0033] ③用KOD-PLUSDNA聚合酶，進行PCR擴增，顯示擴增出約558bp的條帶，擴增片段 末端加A后，連接到pEASY-T載體，轉化大腸桿菌DH5a，得到重組質粒GLY-T;對插入片斷 進行測序分析，分析表明其含有開放閱讀框，0RF1的位置是1-558,編碼185個氨基酸組成 的蛋白，同源分析表明該蛋白與其它的GLYI蛋白具有較高同源性；由于與已知的芥菜型油 菜GLH類蛋白氨基酸同源性最高達到99%，與已經報道的騰沖噬熱厭氧菌的基因有很大 的差異，兩者氨基酸的同源性僅為26%，通過Blast結果顯示，該基因的具有GLH蛋白的保 守功能結構域。
[0034] ④BnGLH轉畢赤酵母表達載體的構建，