及制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于油菜分子育種技術領域。更具體涉及一種甘藍型油菜核不育基 因 Bnms4b，同時還涉及一種甘藍型油菜核不育基因 Bnms4b的制備方法，還涉及一種甘 藍型油菜核不育基因 Bnms4b的應用。本發明涉及的一個和雄性不育相關的復等位位 點：Bnms4a為恢復基因，Bnms4 b為不育基因，Bnms4 e為空等位基因，其顯隱性關系為： Bnms4a>Bnms4b>Bnms4e。不育基因 Bnms4b的克隆、驗證和應用不僅可以加快甘藍型油菜的隱 性細胞核雄性不育系和臨保系的選育，而且以此為基礎可以創建其他十字花科植物的核不 育系統，例如，將不育基因 Bnms4b轉化到擬南芥中可以獲得穩定的不育材料，并且這種不育 材料可以被BnMs3穩定的恢復。
【背景技術】
[0002] 油菜雜種優勢利用關鍵在于優良的授粉控制系統和雙親之間是否可以獲得具有 一定生產潛力的雜交種。優良的授粉控制系統主要有雄性不育，自交不親和，化學殺雄等。 在甘藍型油菜中以雄性不育應用得最為廣泛。油菜雄性不育主要有細胞質雄性不育（CMS) 和細胞核雄性不育（GMS)。目前，世界上用于油菜雜種優勢利用的CMS系統有ogu、kos、tour 和波里馬。其中，波里馬CMS是目前國際上公認的最有實用價值的CMS系統（傅廷棟，雜交 油菜的育種與利用，湖北科學技術出版社，2000)，雖然波里馬在目前的油菜育種應用中占 有重要的地位，但是細胞質雄性不育的自身缺點并沒有被完全克服，主要表型為育性受溫 度影響較大，不穩定，恢復系來源較為狹窄，容易產生不良的胞質負效應，制種風險較大，其 應用受到了一定程度的限制。
[0003] 相對于油菜細胞質雄性不育系統，隱性細胞核雄性不育系統有諸多天生的優點， 主要表現為敗育徹底，育性穩定，恢復源廣，無不良胞質負效應，且有的核不育類型能獲得 全不育制種群體而具有良好的應用前景。S45A(潘濤等，1988)和117A(侯國佐等，1990) 是兩對隱性基因控制的核不育系的典型代表，由其選育而來的雜交種中已審定的有"蜀雜 6號"、"蜀雜7號"、"油研7號"、"油研8號"和"油研9號"等，該系統主要缺點是不育系 中存在50 %的可育株，在制種時需要在初花期拔掉50 %的可育株，由此不僅增加了制種的 成本，而且往往由于可育株清除不徹底，影響制種純度，增加了生產的風險。本課題組克隆 了 S45AB系統的恢復基因 BnCYP704Bl，并將該基因及其育種應用申請了專利保護（涂金 星等，2009)，提出了利用花粉發育特異時期的啟動子與致死基因 Bax相連，再連恢復基因 BnCYP704Bl的智能核不育系統的創建思路：花藥發育的時期，致死基因表達，將含有恢復 基因 BnCYP704Bl的花粉粒殺死，存活的只有隱性不育的花粉粒，用來大面積繁殖不育系， 獲得100%的不育群體，為隱性核不育的育種應用提供了新的思路。另外，美國和加拿大利 用煙草的TA29基因的啟動子和核糖核酸水解酶（barnase)基因構建成融合基因轉化甘藍 型油菜，人工創造了新的核不育材料，并通過向該材料中導入抗除草劑基因后達到了機械 化作業。但是該系統的不足之處是必須對不育系和恢復系都進行轉基因，該系統目前也受 到專利的保護。這些創新性的育種系統的構建，說明了隱性核不育在油菜育種中具有廣闊 的前景，也說明了隱性核不育是未來油菜育種的主導系統。
[0004] 另一種類型的隱性核不育系統主要有9012A(陳鳳祥等，1998)和7365A(Huang et al.，2007)，它們均屬于隱性上位互作核不育類型，Zu等（2010)通過定性的遺傳分析 和基因定位將它們的遺傳模式修正為兩個位點控制的復等位遺傳模式，一個位點是BnMs3/ Bnms3,另一個位點是復等位位點Bnms4a>Bnms4b>Bnms4 e Xia et al.，2012)。本課題組克隆 了 BnMs3基因 （Dun et al.，2011)，根據其擬南芥的同源基因將其命名為BnaC.Tic40,并申 請了該基因以及其育種應用專利保護（涂金星等，2011)。由于該系統特殊的遺傳模式，育 種家可以直接將臨保系與不育系雜交獲得100%的全不育系群體，而不需要拔出50%可育 株，大大節省了制種成本。用該系統選育的品種中，已審定的雜交種有"皖油14號"、"皖油 18號"（陳鳳祥等，2002 ;2003)和"滬油雜1號"（孫超才等，2004)等等，臨保系的成功選 育是油菜隱性核不育系統在育種研究領域取得的重大進展。但是這個系統遺傳基礎復雜、 臨保系選育困難，不利于選育強優勢組合。克服這些缺點的可行性策略是建立不育恢復基 因和上位基因的分子標記體系，進一步克隆Bnms4 a>Bnms4b>Bnms4e這三個復等位基因，利用 分子標記實現不育系和臨保系的定向選擇。同時，對這三個復等位基因的克隆，有助于更清 楚地了解隱性核不育的機理，為更好地應用這一極具潛力的育種系統提供幫助。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是在于提供了一種甘藍型油菜核不育基因 Bnms4b，該基因來自于 甘藍型油菜，為一個顯性的細胞雄性核不育基因，可以使多種植物產生雄性不育的表型，該 雄性不育具有敗育徹底，無不良胞質負效應的特定，可以用于植物的雜種優勢利用，利用 Bnms4b基因使臨保系（基因型為Bnms3ms3ms4ems4e)變為不育，或作為核不育系，恢復系和 臨保系選育的分子標記，以加快甘藍型油菜核不育系和臨保系的選育，或使用這兩個基因 構建其他十字花科植物的核不育系統，用于雜交育種。
[0006] 本發明的另一個目的是在于提供了一種甘藍型油菜核不育基因 Bnms4l^制備方 法，方法易行，操作簡便，利用本發明保護的基因的序列可以直接設計克隆該基因的引物， 實現快速制備克隆該基因的目的，具有經濟，有效的特點。
[0007] 本發明再一個目的是在于提供了一種甘藍型油菜核不育基因 Bnms4b在甘藍型油 菜的細胞核雄性不育遺傳改良中的應用，將該基因克隆到各種載體中，并加以利用，同時還 可以利用該基因本身的序列設計特異引物，用于分子標記輔助選擇，具有快速，經濟，有效 和準確的特點。
[0008] 為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施：
[0009] -種甘藍型油菜核不育基因 Bnms4b的制備方法，其步驟是：
[0010] A、利用該基因的⑶S核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示，啟動子核苷酸序列 如SEQ ID N0. 2所示，或者編碼的蛋白質氨基酸序列如SEQ ID N0. 3設計開發出能擴增出 該基因的引物，并送引物合成公司合成，或者合成探針。
[0011] B、利用合成的引物，采用PCR(polymerase chain reaction)技術，從基因組、mRNA 和cDNA中擴增得到本發明的基因以及任何感興趣的一段多核苷酸或與其同源的一段多核 苷酸。也可以采用已經克隆的多核苷酸作探針，從cDNA和基因組文庫中篩選得到本發明的 基因或同源基因。
[0012] 通過以上技術克隆了該基因，將該基因克隆到表達載體中，轉化甘藍型油菜7365C 以及野生型Col-Ο型中均可以導致穩定徹底的雄性不育（圖7,圖8)，這種雄性不育可以被 BnMs3恢復。這樣的一個育性轉換系統可以用于植物的雜種優勢利用中。
[0013] 申請人通過分離和克隆技術，從甘藍型油菜中分離得到一種分離甘藍型油菜隱性 核不育基因 Bnms4b，其⑶S序列為SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。該基因的啟動子一種分 離甘藍型油菜隱性核不育基因 Bnms4b，其⑶S序列為SEQ ID N0. 2所示的核苷酸序列。該 基因編碼的蛋白質一種分離甘藍型油菜隱性核不育基因 Bnms4b，其序列為SEQ ID N0. 3所 示的氨基酸序。
[0014] 可以采用已經克隆的多核苷酸作探針，從cDNA和基因組文庫中篩選得到本發明 的基因或同源基因。同樣，采用PCR(polymerase chain reaction)技術，也可以從基因 組、mRNA和cDNA中擴增得到本發明的基因以及任何感興趣的一段多核苷酸或與其同源的 一段多核苷酸。通過上述技術方案獲得了二個核苷酸序列和一個氨基酸序列，將基因克隆 到載體中獲得含有該基因的遺傳轉化載體，利用農桿菌介導的遺傳轉化將其轉化到野生型 Col-Ο型擬南芥和油菜7365C中，都可以獲得雄性不育的表型（圖7和圖8)。該基因編碼 的蛋白質可能是通過引起絨氈層質體的功能異常，導致的雄性不育（圖9)。
[0015] -種甘藍型油菜核不育基因甘藍型油菜以及其他十字花科植物的細胞 核雄性不育遺傳改良中的應用，其步驟是：
[0016] A、本發明為甘藍型油菜細胞核雄性不育遺傳改良提供了新用途，利用該基因的 ⑶S核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示，啟動子核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示，或者 編碼的蛋白質氨基酸序列如SEQ ID N0. 3設計開發出能擴增出該基因的特異引物；
[0017] B、進