蘇云金芽胞桿菌ybt1520中的殺線蟲蛋白nel的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物應用技術領域。具體設及一種蘇云金芽胞桿菌度acillus thu;ringiensis)YBT1520的殺線蟲蛋白基因的克隆、異源表達及對根結線蟲的生物測定，本 發明的蛋白可用于微生物農藥的制備和開發W及轉基因植物的應用。
【背景技術】
[0002] 蘇云金芽胞桿菌度acillus thuringiensis)是一類廣泛存在于±壤中的革蘭氏 陽性細菌，它的一個顯著特點就是能夠在芽胞期產生對昆蟲具有特異毒殺作用的晶體蛋白 (Insecticidal C巧Stal Proteins, ICPs)。近年來，蘇云金芽胞桿菌毒殺線蟲的能力被人 們廣泛關注。目前，化巧，化y6,化yl3,化yl4,化y21和化y55類晶體蛋白被報道對線蟲具 有活性，芽胞桿菌中的幾下質酶，金屬蛋白酶也被報道有線蟲毒殺活性。
[0003] 植物寄生線蟲病是一種世界范圍內普遍發生的由植物寄生線蟲所引起的植物病 害。據估計，植物寄生線蟲造成全球主要農作物的年損失率約為12. 3%，每年直接經濟損 失超過1000億美元，在整個農業害蟲造成的損失里幾乎占到了一半，是排在全球氣候變化 和生態環境惡化之后的第=大農業影響因素（段玉蜜，吳剛.植物線蟲病害防治.北京： 中國農業科技出版社.2002.)。根結線蟲是植物寄生線蟲中的一種，是植物根系定居性內 寄生生物，是我國經濟作物的重要病原線蟲，其寄主植物超過3000種，分屬于114科，其 中W茄科、葫蘆科、十字花科等植物受害尤為嚴重（汪來發等.根結線蟲生物防治研究進 展.南京林業大學學報（自然科學版），2002, 26(1) :64-68.)。目前用于防治根基線蟲的方 法有：植物檢疫、農業防治、化學防治、生物防治。植物檢疫是一種可W根治線蟲的好方法， 但其成本高，不適宜大規模推廣；農業防治技術在理論上來說非常有效，但是在實際生產中 存在嚴重的弊端；化學殺蟲劑對環境污染嚴重，使用過程中對人畜不安全，許多殺蟲劑已被 禁用（劉維志，植物病原線蟲學，北京：中國農業出版社，2000)。而與W上方法相比， 生物防治由于具有穩定、經濟、長效和相對安全的特點，同時還能除害增產、減輕污染、保護 生態環境，逐漸受到廣泛關注。上世紀80年代Bone等人通過研究首次證實了蘇云金芽胞 桿菌晶體蛋白對線蟲有殺蟲活性度oneLW,BottjerKP，GillSS.Trichostrongylus colubriformis:EggIeth曰IityduetoBscillusthuringiensiscryst曰Itoxin.Exp. Parasitol.，1985, 60:314-322.)。之后，美國Mycogen公司的大量研究工作也進一步證 實了蘇云金芽胞桿菌伴胞晶體蛋白對線蟲的作用度ra壯ishGA(1992).P;rocess化r controllingIepidopteranpests.EP.)。
[0004] 蘇云金芽胞桿菌YBT1520是由申請人所在的農業微生物學國家重點實驗室保存 的野生型菌株。肥L是在YBT-1520的基因忍片結果中發現的，存在于YBT-1520某質粒 上，具有NPPl和化CinB結構域的新型殺蟲蛋白。近年來，在植物病原菌中發現一類能引 起植物細胞死亡的蛋白家族，運類蛋白都含有一個保守結構域NPPl(necrosis-imlucing Phyto地thoraprotein)，它們被統稱為NLPs(化pl-l;Lkeproteins)。很多NLPs的一個 共同的功能特征是觸發很多雙子葉植物產生防御反應、壞痘、萎黨和細胞壞死，但是單子葉 植物對其不敏感（MarkGijzen,Thorsten伽rnber邑er.NEL-likeproteinsfromplant pathogens:RecruitmentanddiversificationoftheNPPldomainacrosstaxa.Phyt ochemistry，2006, 67:1800-1807.)。Ricin是一種分子量為65kd的由S條寡糖鏈糖構成的 蛋白，主要結構是由兩條膚鏈（A/B鏈）組成的異二聚體（戎隆富，王新建等.藍麻毒素研 究進展，安徽預防醫學雜志，1999,5(2).)。Ricin具非常強的毒力和細胞毒性作用。Ricin B鏈上的半乳糖結合位點與細胞表面含末端半乳糖殘基的受體結合；使整個毒素分子W內 吞方式進入細胞；形成囊泡；毒素通過囊泡進入細胞質；隨后蛋白鏈間二硫鍵被裂解；游離 出A鏈。A鏈是一種蛋白酶；作用于真核細胞核糖體60S大亞單位的28SrRNA;水解A4324 位點的腺嚷嶺N-糖巧鍵；使其脫去腺嚷嶺；喪失抗RNA酶的抗性而被降解；不能與延長因 子巧F-2)結合，從而抑制蛋白質合成；最終導致細胞死亡。

【發明內容】
陽0化]本發明的目的在于從野生型蘇云金芽胞桿菌YBT1520中克隆并表達了一個新型 的殺線蟲晶體蛋白基因nel，生物測定實驗表明該蛋白對線蟲具有高毒力，預示著該基因在 防治根結線蟲殺蟲制劑及轉基因抗蟲作物等研究領域有著良好的應用前景。
[0006] 具體地本發明設及一種蘇云金芽胞桿菌度acillus thuringiensis) YBT1520的殺 線蟲蛋白基因的克隆、異源表達及對根結線蟲的生物測定，本發明的蛋白可用于微生物農 藥的制備和開發W及轉基因植物的應用。
[0007] 實現本發明的技術方案如下所述：
[0008] 申請人從野生型蘇云金芽胞桿菌YBT1520的基因組信息中分析并克隆到一個新 的殺蟲晶體蛋白基因nel(詳細信息請參見《【具體實施方式】》）。經過進一步測序發現本發 明的nel其編碼區由1554個堿基組成，其核巧酸序列如SEQIDN0:1所示。經序列分析發 現，nel編碼的蛋白肥L由518個氨基酸組成，其蛋白質的序列如SEQIDN0:2所示，預測 分子大小為52kDa。通過構建大腸桿菌重組菌純化肥L蛋白及生物測定實驗證明肥L蛋白 對根結線蟲具有毒殺作用。 W09] 申請人將獲得的包含有殺蟲晶體蛋白基因nel重組的大腸桿菌命名為EscherichiacoliBL(祀T28a-nel)，于2014年7月7日送交中國.武漢.武漢大學中國 典型培養物保藏中屯、保藏，保藏號為CCTCCNO:M2014326。
[0010] 本發明提供的上述基因序列是一種新的殺線蟲蛋白基因，該基因在防治根結線蟲 殺蟲制劑及轉基因抗蟲作物等研究領域具有廣泛的應用價值。
[0011] 更詳細的實施方案參見實施例中的描述。
【附圖說明】
[0012] 序列表SEQIDNO: 1是本發明分離克隆的蘇云金芽胞桿菌殺線蟲蛋白基因的核巧 酸序列及其編碼的蛋白質的序列。
[0013] 序列表SEQIDN0:2是本發明分離克隆的蘇云金芽胞桿菌殺線蟲蛋白的蛋白質的 序列。
[0014] 圖1:是本發明實施例中殺蟲蛋白基因nel的技術流程。
[0015] 圖2:是本發明實施例中克隆載體祀T28a-nel的構建圖及其物理圖譜。
[0016] 圖3 :是本發明實施例中克隆載體祀T28a-nel的DNA凝膠電泳圖。
[0017] 圖4:是本發明實施例中殺線蟲蛋白肥L在重組菌中表達純化的SDS-PAGE電泳分 析結果，圖中：箭頭1所指是純化后的肥L蛋白，箭頭2所指是純化前的肥L。
[0018] 圖5:是本發明實施例中殺線蟲蛋白肥L針對根結線蟲的生物測定結果圖。
【具體實施方式】
[0019]W下敘述是根據本發明實施方案的實施例。應該說明的是，本發明的實施例對于 本發明只有說明作用，沒有限制作用。有關實施例中所提到的DNA的標準操作方法和所 使用的試劑均可參見《分子克隆實驗指南》中所描述的方法（參見薩姆布魯克和拉塞爾， 2001，分子克隆實驗指南，第=版，金冬雁等（譯），科學出版社，北京）。本發明中所設及的 其他各項實驗操作，均為本領域的常規技術，文中沒有特別說明的部分，本領域的普通技術 人員可W參照本發明申請日前的各種常用工具書、科技文獻或相關說明書、手冊等加W實 施。
[0020] 實施例1蘇云金芽胞桿菌YBT1520中殺蟲晶體蛋白基因nel的克隆
[0021] 本發明W野生型蘇云金芽胞桿菌YBT1520(該野生型蘇云金芽胞桿菌度acillus thuringiensis) 1520的專利號為化95106749. 4)作為殺線蟲蛋白基因nel的來源菌株。
[0022] (1)蘇云金芽胞桿菌YBT1520總DNA的抽提
[0023] 采用常用的堿裂解法小量提取。其步驟如下：
[0024] 將野生型蘇云金芽胞桿菌YBT1520于28°C搖床中進行過夜活化，按l/100(v/v)的 接種量轉接至7mL新鮮的LB液體培養基中，于28°CW1200化/min震蕩培養至對數生長中 期；將培養好的YBT1520菌液分裝至1. 5mL離屯、管內，收集菌體（120(K)r/min，Imin)，并用 STE溶液（IOmMTris?肥1 [抑8. 0]，ImMEDTA[抑8. 0]，IOOmMNaCl)洗涂 1 次；將上述菌體 懸于100^1溶液