外源基因轉化浮萍并進行表達的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，尤其是一種將外源基因快速高效轉化入浮萍并進行表 達的方法。
【背景技術】
[0002] 浮萍為單子葉水生漂浮植物，為最小的開花植物之一。因其結構簡單，增殖快，不 僅被廣泛應用于植物生理學、遺傳學、生態學和環境檢測等方面，而且被廣泛應用于水體污 染的治理。實驗室培養的浮萍葉狀體從分生細胞處以類似于酵母無性繁殖的營養出芽方式 快速增殖，因此遺傳非常穩定；浮萍生物量平均每2-3天繁殖1代，生物量增加快，生產周期 短；表達產物產量高且容易分離純化；浮萍可用來生產在細菌和酵母中不易表達的復雜蛋 白質，浮萍還可用來表達在哺乳表達系統受限或耗資太高的蛋白；嚴格的無菌培養使其不 易受病毒的感染，其表達的疫苗安全性高；浮萍相對于其他植物來說不需要田地來進行種 植生長，可通過采用野外有營養的廢水來低廉生產有價值的融合蛋白或肽，而且還能凈化 廢水供再利用；浮萍可在發酵罐或生物反應器中生長，使其更容易整合入現存的蛋白質生 產工業基礎建設中；因此采用浮萍作為植物生物反應器系統在生產重組蛋白方面具有良好 的應用前景。
[0003] 目前已經有兩種浮萍成功開發為商業化生物反應器，分別是美國BIOLEX公司的 LEX SystemTM表達系統和法國LemnaGene公司的LemnaGeneTM SA表達系統，二者價格都很 昂貴。國內以浮萍作為表達系統還未見報道。

【發明內容】

[0004] 為解決上述問題，本發明提供一種外源基因轉化浮萍并進行表達的方法，包括如 下步驟：
[0005] 步驟一：將外源基因轉化至農桿菌中，獲得重組農桿菌；然后配制農桿菌重懸液；
[0006] 步驟二：在所述浮萍葉狀體區域割劃若干處，然后將所述割劃后的浮萍葉狀體在 所述農桿菌重懸液中浸泡l〇-15min，通過所述重組農桿菌將所述外源基因生長到所述浮萍 葉狀體中；然后將所述浮萍葉狀體移植入鋪有無菌濾紙的共培養基中，室溫下避光培養3 天以上。
[0007] 優選地，所述農桿菌重懸液的配制步驟為：挑取重組農桿菌單菌落在YEB固體培 養基上活化；活化完成后的重組農桿菌單菌落再接種到YEB液體培養基中，26~30°C生長 過夜，獲得重組農桿菌菌液；然后按照體積比為1:50~100將所述重組農桿菌菌液接種于 含有50mg/L卡那霉素，10mg/L利福平和20mg/L乙酰丁香酮的YEB液體培養基中形成接種 液，于26~30°C振搖至使所述接種液在波長為600nm的吸光度值為I. 0 ;最后將所述接種 液重懸于含3%蔗糖，20mg/L乙酰丁香酮和0. 6M甘露醇的1/2MS固體培養基中，得到農桿 菌重懸液。
[0008] 優選地，所述步驟二還包括對浮萍的預處理：在SH培養基含1 %蔗糖和10 μ M吲 哚乙酸中于23°C，在光生物反應器中16h光照/8h黑暗，40 μ mol/m2 .sec預培養2周以上。
[0009] 優選地，還包括一正交試驗，即選用抗生素水溶液，濃度分別為0、5、10、20和 40mg/L ;每個濃度處理若干組浮萍葉狀體，重復若干次；植物激素水溶液，濃度分別各為0、 0. 5、1、2和5mg/L ;每個濃度處理若干組浮萍葉狀體，重復若干次，通過分析極差值找出未 經過轉化的浮萍在抗生素、植物激素影響下的最佳生長條件。
[0010] 優選地，所述農桿菌重懸液中所述重組農桿菌的濃度為lX108cfu/ml~ I X 109cfu/ml 〇
[0011] 優選地，所述外源基因為pcambia-1300-GFP雙元質粒；所述農桿菌為EHA105。
[0012] 有益效果：
[0013] 1、本發明選用pcambia-1300-GFP雙元質粒作為外源基因的載體重組農桿菌 EHA105,該載體具有插入片段長，轉化效率高的特點，能夠很方便地將復雜的外源基因整合 到載體上；
[0014] 2、本發明采用pcambia-1300-GFP雙元質粒作為外源基因的載體，該載體表達產 物為綠色熒光蛋白，在熒光顯微鏡下激發后發綠色熒光，可以方便觀察陽性轉化浮萍株。
[0015] 3、本發明采用浮萍葉狀體直接作為轉化受體，不必經過愈傷組織，該方法操作方 便，轉化效率高，大大簡化了將外源基因轉化到宿主植株浮萍的操作，轉化陽性率大大提 尚；
[0016] 3、本發明選用浮萍作為表達宿主植株，其結構簡單，增殖快，遺傳穩定；可用來生 產在細菌和酵母中不易表達的復雜蛋白質；嚴格的無菌培養使其不易受病毒的感染，其表 達的疫苗安全性高；相對于其他植物來說不需要田地來進行種植生長，可通過采用野外有 營養的廢水來低廉生產有價值的融合蛋白或肽，而且還能凈化廢水供再利用；浮萍可在發 酵罐或生物反應器中生長，使其更容易整合入現存的蛋白質生產工業基礎建設中因此采用 浮萍作為植物生物反應器系統來生產重組蛋白優越性是十分顯著的。
【附圖說明】
[0017] 圖1為本發明雙元質粒基因轉化農桿菌感受態細胞過程的提取質粒電泳圖；
[0018] Ml--DL2000 DNA Marker ； 1--pcambia-1300-GFP 雙元質粒；M2--λ /Hind III DNA marker〇
[0019] 圖2為本發明雙元質粒基因轉化農桿菌感受態細胞陽性克隆鑒定圖。
[0020] Ml--DL2000 DNA Marker ；1--GFP forward-GFP reverse 引物擴增后 的 pcambia-1300-GFP 雙元質粒產物；2, 3--GFP forward-GFP reverse 引物擴增 pcambia-1300-GFP雙元質粒轉化農桿菌后的克隆產物。
[0021] 圖3為本發明浮萍葉狀體在含有不同濃度潮霉素，6-芐基嘌呤和萘乙酸培養基中 生長4周后再生情況。
[0022] 圖4A、4B為本發明含有pcambia-1300-GFP雙元質粒載體的浮萍植株中綠色熒光 蛋白的表達圖。
【具體實施方式】
[0023] 下面，將結合具體實施例對本發明作詳細說明。
[0024] 現有技術中引入外源基因的方法大多集中在選用愈傷組織作為轉化對象，增加了 實驗的難度和培養周期。本發明提供一種利用浮萍表達外源基因的方法。其中，本發明所 選用的外源基因載體為pcambia-1300-GFP雙元質粒；該雙元載體上已經整合有報告基因 GFP，并帶有多克隆位點，方便外源基因的插入。轉化的對象為農桿菌EHA105。該農桿菌 EHA105含有輔助Ti質粒，具有轉化效率高的特點。
[0025] 本發明中采用了多種培養基，具體組分如下：
[0026] (I)YEB液體培養基：是用作農桿菌培養基。本發明根據分子克隆加以修改，即將 下列組分溶解在0. 9L水中：胰蛋白胨5g，酵母提取物lg，營養肉湯5g，蔗糖5g，MgS04 ·7Η20 0. 5g，各組分溶解后用lmol/L NaOH調整pH至7. 2,再補足水至1L，高壓滅菌。
[0027] YEB固體培養基，是在YEB液體培養基的基礎上添加瓊脂粉15_20g/L。
[0028] (2) 1/2MS固體培養基：每升水中溶解有0. 825g/L的NH4N03、0. 95g/L的ΚΝ03、 0.085g/L 的 KH2P04、0.185g/L 的 MgS04.7H20、0.220g/L 的 CaCl2.2H20、0.83mg/L 的 KI、6.2mg/L 的 H3B03、22.3mg/L 的 MnS04.4H20、8.6mg/L 的 ZnS04,7H20、0.25mg/L 的 Na2MoO4 ·2Η20、0· 025mg/L 的 CuSO4 ·5Η20、0· 025π^/1 的 CoCl2 ·6Η20、27. 8mg/L 的 FeSO4 ·7Η20、 37. 3mg/L 的 EDTA-Na2 · 2Η20、2· Omg/L 甘氨酸、0· lmg/L 鹽酸硫胺素（VBl)、0· 5mg/L 鹽酸吡 哆醇（VB6)、0· 5mg/L煙酸、100mg/L肌醇、0· 4 %瓊脂，0· 2 %植物凝膠。
[0029] (3)共培養基：含3%蔗糖、20mg/L乙酰丁香酮、0· 5mg/L 6-芐基嘌呤的1/2MS固 體培養基。
[0030] 具體包括如下步驟：
[0031] 步驟一：將雙元載體質粒轉化至農桿菌中，得到重組農桿菌；然后配制形成農桿 菌懸液。
[0032] (1)將雙元載體質粒轉化至農桿菌中。根據分子克隆手冊，制作農桿菌感受態細 胞，然后將50~IOOng pcambia-1300-GFP雙元質粒加入100 μ 1所述農桿菌感受態中，混 勾成菌懸液，冰上放置30min ;放于液氮或-70°C預冷的工業酒精中速凍3~5min，再放于 28°C水浴5min。然后在所述菌懸液中進一步加入YEB液體培養基800 μ 1，在28°C下，150~ 180rpm振蕩培養3~5h ;4000rpm離心2~4min。最后，棄去800 μ 1上清液，剩余的懸浮 菌體涂于含l〇mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEB固體培養基上，26~30°C培養1-2天 直到形成單菌落，獲得重組農桿菌。