化5] 8)為了增加組織陽性雜交強度，對切片進行乙酷處理。切片入0.25%乙酸酢 BufferI(0. 1MS乙醇胺），室溫lOmin。
[0186] 9) 1MPBS洗涂 2X5min。 陽187] 預雜交和雜交
[0188] 預雜交：-20°C保存的預雜交液，先置于37°C解育60min，預雜交液的用量為 50iil，石蠟膜履蓋切片，37°C濕盒中預雜交2小時。（預雜交液成份包括：2XSSC，10% Dextransulphate，IXDenhardt'ssolution，50mMPhosphateBuffer(PH7.0)，50mM DTT, 250y1,100yg/mlpolyA,5jig/mlpolydA, 250yg/mlyeastt-RNA, 500yg/ml ssDNA，47%Deionizedformamide)。
[0189] 1)移去石蠟膜，甩掉預雜交液，切片置于2XSSC中5min。
[0190] 2)雜交反應：37°C雜交過夜（18-20h)。每一切片加入250y1雜交液并用石蠟膜 履蓋。預雜交液中加入相應的探針就成為雜交液。雜交液在預雜交時配制，放置37°C解育， 使探針充分溶解于雜交液中，本實驗按5(K)ng/ml探針濃度配制成雜交液。 陽191] 3)雜交后洗涂，切片浸入2XSSC，lOmin，掲去石蠟膜。依次于搖床上搖動洗涂， 2XSSC(0. 5%SD巧，2X15min一 0. 25XSSC(0. 5%SD巧，2X15min。 陽192] 雜交后顯色檢測反應
[0193] 1)采用Anti-Digoxigenin-POD檢測地高辛探針與mRNA結合復合物；TSA放大系 統增強原位雜交反應顯色反應的陽性信號，DAB顯色。
[0194] 2)切片轉至TNT緩沖液中，3X5min。 陽1巧]3)滴加TNB阻斷緩沖液，300y1/TMAs，室溫，30min。
[0196] 4)吸去多余阻斷劑，1:100 稀釋的Anti-Digoxigenin-POD(TBS+0. 1 %Triton X-100+1 %阻斷劑），室溫4小時。 陽 197] 5)TNTBuffeHO. 1MTris-CL，pH7. 5,0. 15M化CL，0. 05 %Tween20)洗涂， 3x5min。 陽 198] 6)切片上滴加信號放大試劑Biotin}dTyamid，300y1/TMAs，度iotinylTyramid 膽存液：BiotinylTyramid溶解于 0. 2mlDMS0，Biotin}dTyramid工作液：1X稀釋液， 1:50稀釋Biotin}dTyramid膽存液），室溫10分鐘。 陽 199] 7)TNT洗，3X5min。
[0200] 8)切片滴加SA-HRP(鏈霉卵白素-辣根過氧化物酶），300y1/TMAs，室溫30min。 陽 201] 9)TNT洗，3X5min。 陽202] 10)蒸溜水洗涂，1XImin。 陽203] 11)DAB顯色，顯微鏡下巧制顯色反應。 陽204] 12)蘇木素復染， 陽205] 13)酒精梯級脫水，切片干燥。 陽206] 14)滴加封片膠，相應規格的蓋玻片蓋片，紫外燈下交聯切片Imin。
[0207] 1. 7結果判斷及標準 陽20引應用光學顯微鏡分別在低倍和高倍鏡下進行觀察，首先觀察目標RNA的陽性表達 信號在觀察目標細胞內的定位：位于細胞核、細胞漿或細胞膜。
[0209] 再分別m亥檢測RNA表達部位陽性信號的強度和陽性表達的細胞數兩種標準進 行綜合評分，判斷標準為：（1)依據陽性細胞染色強度判斷：a.細胞無染色，記0分；b.細 胞染成淺棟色為弱陽性，記1分；C.細胞染成棟色且無背景著色，或細胞染成深棟色并有淺 棟色背景為中等陽性，記2分；d.細胞染成深棟色且無背景著色為強陽性，記3分。（2)依 據陽性細胞表達數計分：a.無陽性細胞表達，記0分；b.陽性表達細胞數《25%，記1分； C.25 % <陽性細胞數< 50 %，記2分；d.陽性表達細胞數> 50 %，記3分。
[0210] 為了盡量降低評分結果的主觀因素，由兩位病理學專家分別按上述標準之一各自 進行判斷和評分，再將兩者評分相乘，結果為：①0分者最終計為0分，認為陰性表達；②1 分和2分者最終計為1分，認為弱陽性表達；③3分和4分者最終計為2分，認為中等陽性 表達；④6分到9分者最終計為3分，認為強陽性表達。 陽211] 1.8分析和統計軟件 陽212] 應用SPSS13.0統計軟件對實驗結果進行統計學分析，兩兩比較用x2test或 Fisherexacttest,相關性分析采用Spearmencorrelation方法；P< 0. 05即差異有統 計學意義。生存曲線分析采用Kaplan-Meiermethod及log-ranktest;多變量分析采用 Cox'Sproportionalhazardsmodel;P< 0. 05 即差異有統計學意義。 陽21引2結果
[0214] 2. 1BTRC基因在鼻咽癌中的表達比正常對照組織中的表達顯著下調
[0215] 正常鼻咽上皮（Non-tumorNP巧中BTRC編碼的PTrCP蛋白表達水平較高 (positive)，而在106例鼻咽癌（NPC)中有48例檢測到PTrCP的低表達化OW)，其余58例 為高表達化i曲）。PTrCP蛋白在正常鼻咽上皮和鼻咽癌中的表達有顯著差異（P<0. 05,圖 5)。原位雜交檢測的結果與免疫組織化學的結果一致。
[0216] 2. 2BTRC基因低表達的鼻咽癌患者預后較差 陽217] 我們對鼻咽癌組織中BTRC基因的表達與病人的生存時間和狀態進行的生存分 析，發現鼻咽癌中BTRC的表達與鼻咽癌患者的預后密切相關，即BTRC高表達（化曲）的 患者不論無病生存時間值isease化eesurvival,DF巧還是總的生存時間（Overall survival,0巧都要明顯長于BTRC低表達化OW)的患者（圖6)。 陽21引實施例5,在鼻咽癌細胞中過表達BTRC基因抑制鼻咽癌的侵襲與轉移，而干擾BTRC基因的表達促進鼻咽癌的侵襲與轉移，其機制是通過其底物P-catenin和Snail調控 細胞上皮-間質轉換
[0219] 1.材料方法
[0220] 1. 1試劑及試劑盒 陽22U 限制性內切酶化eI和EcoRI及T4DNA連接酶等購自化kaRa公司；TRIZ0L? Reagent(Invitrogen);質粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒（OMEGA);逆轉錄試劑盒 (Promega);蛋白酶K、歴aseI、RNAsin、RNaseA(GBIC0L公司）。 陽222] 1.化CDNA3. 1 -BTRC真核表達載體的構建 陽223] 我們選擇pcDNA3. 1空白載體（來源于Invitrogen公司）構建BTRC的過表達載 體。我們選擇化e I和EcoR I酶切位點用于酶切PCDNA3. 1載體并將BTRC序列插入該位 點。
[0224]構建PCDNA3. 1 - BTRC真核載體步驟如下： 陽扣引1)W鼻咽癌細胞H肥2的cDNA為模板，利用TaKaRaLAT巧黎酶進行PCR擴增全長 BTRC編碼區（CD巧序列（見序列表）。BTRC編碼區序列擴增引物如下：
[0226]上游引物：5 ' -ATGGACCCGGCCGAGGCGGT-3 '
[0227]下游引物：5，-TTATCTGGAGATGTAGGTGTATGTT-3 '
[02測在上、下游引物的5'端分別加上限制性內切酶化eI和EcoRI識別位點及保護 堿基后，引物序列如下： 陽229]上游:5 ' -AGGAGCTAGCATGGACCCGGCCGAGGCGGT-3'(下劃線部分為MieI識別位點）[0230]下游：5' -ATGCGAATTCTTATCTGGAGATGTAGGTGTATGTT-3'(下劃線部分為EcoRI識 別位點） 陽23U2)PCR擴增，BTRC編碼區序列，PCR反應條件如下： 陽2；32] TaKaRaLATaq?f海 Ipl 上游引物（l〇Mxn) 0.4iil 下游引物（1〇畔1) 0.4|il cDNA被板 2.0叫 肌:0 12.2川 PCR反應緩沖液口X) 4片1 Foul ;2〇ii 陽233] PCR反應步驟 陽234] 1 9的5mm 2 95'C 10 see 3 621： 30、cc 472C 60see 5返回到第2步，共迸行巧次反應循環 陽23引如將PCR產物電泳、膠回收目的片段后經化eI和EcoRI雙酶切后電泳，再次膠 回收。
[0236] 4)PCDNA3. 1質粒經化e I和EcoR I雙酶切后電泳膠回收目的片段。 陽237] 5)WT4DNA連接酶連接4)和5)步膠回收產物，即可得到可用于真核表達BTRC的 載體質粒。 陽23引 6)將第5)步得到的包含BTRC編碼區序列的PCDNA3. 1真核表達質粒轉化感受態 大腸桿菌，W擴增質粒。 陽239] 1. 3BTRC基因的RNA干擾序列（siBTRC)如下： 陽240] 5'-CCCAGGGACUGGCGCACUCdTdT-3' 陽241] 由Invitrogen公司通過化學合成法合成。 陽242] 1. 4制備多聚賴氨酸包被的娃納米顆粒 陽243] 多聚賴氨酸包被的娃納米顆粒是運用0P-10/環己燒/氨水微乳液自組裝技術進 行娃納米顆粒（silicananoparticle,SiNP)的合成，并利用娃納米顆粒的表面能和通過離 子靜電作用，制備多聚賴氨酸修飾的娃納米顆粒；所述的納米顆粒可W由W下方法制備得 到：
[0244] 1)將0P-10 (壬基酪聚氧乙締酸）、環己燒和氨水混合，室溫攬拌均勻后加入正娃 酸異醋（TE0S)，繼續攬拌至聚合完成，加入等體積丙酬，超聲分散，離屯、，雙蒸水洗涂=次， 離屯、收集沉淀于80°C干燥，研細得娃納米顆粒（SiNP,粒徑范圍10-50nm)。其中&0與0P-10 及&0與TE0S的摩爾比為2~10、氨水濃度為1. 6~28%、TE0S在環己燒中的摩爾濃度為 0. 1 ~3mol/L。
[0245] 2)將SiNP按0.1~lOmg/ml重懸于0.6M化C〇3溶液中，超聲分散，離屯、，棄上清， 再將沉淀物按0. 1~lOmg/ml重懸于PBS(抑7. 4)中，超聲分散，加多聚賴氨酸（終濃度為 4~15nmol/mL)，充分混勻，室溫混搖；離屯、，棄上清，沉淀按0. 1~lOmg/ml重懸于雙蒸水 中，得到多聚賴氨酸修飾的娃納米顆粒。 陽246] 3)將改性娃納米顆粒超聲分散，每毫升納米顆粒懸液加入10~50ug BTRC表達載 體或者BTRC的RNA干擾序列（siBTRC)，混合，室溫靜置使其結合。
[0247] 1. 5細胞培養與轉染 陽24引鼻咽癌細胞系HNE2、5-8F和C666-1購自中南大學細胞中屯、，細胞培養所用RPMI 1640培基和胎牛血清，及消化細胞所用的膜蛋白酶均為美國G化CO