基于rna聚合酶ⅰ的rsv微型復制基因組及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學和生物醫學領域，更具體地，設及建立抗病毒藥物的篩選 方法。
【背景技術】
[0002] 呼吸道合胞病毒（HumanRespiratorySyn巧tialViru，RSV)是世界范圍內引起 嬰幼兒和兩歲W下兒童下呼吸道感染的最重要的病毒性病原，同時也在老年人和免疫缺陷 人群引起嚴重感染。目前，利己韋林和帕利珠單抗是僅有的用于RSV治療和預防的藥物，然 而利己韋林由于噴霧給藥途徑、藥效不佳及存在致崎作用，阻礙了其在臨床應用，帕利珠單 抗主要用于2歲W下高危兒童且且價格昂貴，也未得到廣泛使用。因而，開發新的抗RSV藥 物成為亟待解決的問題。而建立高通量的抗RSV藥物篩選系統是研發新的抗RSV藥物的核 屯、。
[0003] 快速、簡便、經濟的RSV定量方法是篩選抗RSV藥物的基礎，隨著生物技術的不斷 發展，愈來愈多的方法被用于RSV定量檢測，但都存在一定問題，難W用于高效篩選抗RSV 藥物。如：實時定量PCR因其高敏感和高特異性被用于定量RSV，但該方法不能區分活病毒 和死病毒，限制了其在抗RSV藥物篩選中的應用；酶聯免疫吸附法巧LISAs)需要大量特異 性抗體，導致該方法價格昂貴，難W用于大規模篩選抗RSV藥物；基于細胞病變效應（CP巧 的RSV定量方法存在耗時較長、工作量較大、容易受操作人員主觀因素影響等缺點，也不適 用于大規模樣品的檢測。
[0004] 隨著負鏈RNA病毒反向遺傳學技術的發展，利用N、P、M2-1、L四種蛋白和病毒編 碼蛋白被報告基因取代了的微型復制基因組（Minigenome)模擬RSV的復制和轉錄過程成 為了現實。W此為基礎，有研究者構建了T7聚合酶驅動的RSV微型復制基因組，并用于定 量RSV和篩選抗RSV藥物，獲得了不錯的效果。但是，T7聚合酶驅動的RSV復制系統需要 通過表達T7RNA聚合酶的重組痘苗病毒、瞬時轉染或建立穩定表達T7RNA聚合酶的細胞系 等方法提供T7RNA聚合酶，導致難W在宿主細胞內獲得高水平的T7RNA聚合酶，進而限制了 該系統的效率。另外，T7聚合酶驅動的RSV微型復制基因組轉錄后，會在的3'末端留有多 余的外源基因片段，為去除該多余的基因片段，需要在微型基因組3'末端添加下肝核酶， 通過下肝核酶將多余的基因片段切除掉，由于下肝核酶切割效率有限，因而限制了功能性 微型復制基因組的轉錄。
[000引真核RNA聚合酶包括立種，分別是RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶III，其 中RNA聚合酶I位于真核細胞細胞核內，負責轉錄核糖體RNA，RNA聚合酶II位于細胞質中， 負責合成信使RNA(mRNA)的前體，RNA聚合酶III位于細胞質中，負責合成轉運RNA(tRNAs)。 利用真核RNA聚合酶啟動子的真核表達載體，需要具有RNA聚合酶的啟動子，運樣的表達載 體能夠在真核細胞中瞬時或永久表達目標基因。用于真核表達的載體通常采用RNA聚合酶 II的啟動子，但RNA聚合酶II的啟動子并不能用于制備的RSV微型復制基因組。
[0006] 因而需要提供一種可在真核細胞表達的RSV微型復制基因組，及包含該RSV微型 復制基因組的載體。

【發明內容】

[0007] 本發明的要解決的第一個技術問題是提供了一種基于RNA聚合酶I的RSV微型復 制基因組。
[000引本發明要解決的第二個技術問題是提供一種包含基于RNA聚合酶I的RSV微型復 制基因組的真核表達載體。
[0009] 本發明要解決的第=個技術問題是包含基于RNA聚合酶I的RSV微型復制基因組 的真核表達載體在篩選抗RSV化合物中的應用。
[0010] 為解決上述技術問題，本發明采用如下述技術方案：
[0011] 一種基于RNA聚合酶I的RSV微型復制基因組，其包含RNA聚合酶I啟動子和 Gaussia巧光素酶（Glue)報告基因，所述微型復制基因組序列如seqIDNo:l所示。
[0012] 在基于RNA聚合酶I的RSV微型復制基因組中，我們保留了RSV前導序列化eader re邑ion/邑enomicpromoter)、牽專錄起女臺f言號（Genestartsignal，GS)、牽專錄終ihf言號（Gene endsi即al，GE)和尾隨序列（Trailerregion/antigenomicpromoter)等順式作用元件 (Cis-actingelements),用Glue(Gaussialuciferase)基因替代了RSV全部編碼基因，并 分別在基因組兩端添加了RNA聚合酶I啟動子和終止子，獲得了基于RNA聚合酶I驅動的 RSV微型復制基因組。
[0013] 通常在建立病毒微型復制子時，需要含有T7聚合酶的啟動子，但是T7聚合酶存在 技術背景中所述的兩大缺點。我們發現采用含有RNA聚合酶I啟動子的RSV微型復制基因 組能夠避免運兩缺點。
[0014] 一種基于RNA聚合酶I的RSV微型復制基因組的pHM-RSV-Gluc表達載體，所述 pHM-RSV-Gluc表達載體的序列如seqIDNo:2所示。該序列全長5638bp，其中228-1390bp 之間為基于RNA聚合酶I的RSV微型復制基因組，704-126化P之間為Glue報告基因， 234-470bp之間為RNA聚合酶1啟動子。所述pHM-RSV-Gluc表達載體的構建方法如下：構 建抑M質粒；構建基于RNA聚合酶I的RSV微型復制基因組；將所述RSV微型復制基因組裝 入pHM質粒，即獲得pHM-RSV-Gluc表達載體。
[0015] 其中抑M載體的構建方法包括但不限于：WPCDNA3. 1 (+)質粒為模板，PCR擴增 1253bp-2080bp之間的DNA片段，所用的PCR引物為的上游引物為MF，含有MluI酶切位點， 序列如seqIDNo:3所示，所用的PCR的下游引物為：MR，含有SmaI酶切位點，序列如seq IDNo:4所示。用MluI和SmaI雙酶切PCR擴增的DM片段，回收82化P的酶切后的PCR 擴增片段，即獲得抑M插入片段。同時用MluI和SmaI雙酶切所述PCDNA3. 1 (+)質粒，并 回收3579bp的DNA片段，獲得第一P歷載體片段，連接抑M插入片段和第一P歷載體片段， 即獲得pHM質粒，即刪除PCDNA3. 1 (+)質粒上233-1157bp之間片段，即獲得pHM質粒，其中 所述PCDNA3. 1 (+)質粒233-1157bp之間片段包含CMV啟動子、T7啟動子、MCS和BGH反向 引物序列。
[001引所述pcDNA3. 1 (+)質粒購買自Invitrogen公司。
[0017] 其中，含有Glue報告基因和RNA聚合酶1啟動子的RSV微型復制子的構建方法包 括但不限于全基因合成方法或PCR擴增法，優選為全基因合成方法，同時為保證穩定性，進 一步將合成的Glue報告基因連接在pUC57質粒體上，獲得pUC57 -RSV-Gluc質粒，其中所 述微型復制子的全基因合成和連接是由上海生工完成，其中所述的微型復制子也可W連接 在其他的質粒上。所述pHM-RSV-Gluc表達載體的組裝方法為：
[001引 利用MluI和EcoRV內切酶雙酶切所述PUC57 -RSV-Gluc載體和抑M載體，回收PUC57 -RSV-Gluc質粒的酶切產物中1163bp片段，獲得RSV-Gluc片段；回收抑M載體的酶 切產物中4475bp的片段，獲得第二pHM載體片段，用T4DNA連接酶連接RSV-Gluc片段和第 二抑M載體片段，即獲得pHM-RSV-Gluc載體。
[0019] 其中DNA片段的PCR、酶切與回收、載體的酶切與回收化及插入片段與載體片段或 質粒片段間的連接可采用本領域技術人員所熟知的技術手段。
[0020] 采用相似或相同的制備原理，基于RNA聚合酶I的RSV微型復制基因組也可W連 接至其他的表達載體中或修改的表達載體中，表達載體的修改方式不限于本申請例舉的方 法。
[0021] 所述pHM-RSV-Gluc表達載體轉染到真核細胞后不能表達巧光素酶報告基因，僅 當RSV病毒同時感染轉染了pHM-RSV-Gluc表達載體的細胞時，才能表達巧光素酶。
[0022] 在一個實施例中，為確定pHM-RSV-Gluc轉染的肥P-2細胞中能夠正確表達報告基 因，我們將肥P-2細胞培養在96孔板，24h后，接種RSV病毒，接種病毒后2地，參照轉染試 劑說明書建議量轉染pHM-RSV-Gluc載體，與此同時我們設立2個陰性對照組，分別為轉染 pHM-RSV-Gluc載體但不接種RSV組和接種RSV但不轉染pHM-RSV-Gluc載體組，和1個空白 對照組，為不接種RSV也不轉染pHM-RSV-Gluc載體，轉染后4化檢測Gaussia巧光（RLU) 信號。僅當轉染pHM-RSV-Gluc載體并接種RSV病毒時檢測到了Gaussia巧光素酶（Glue) 的巧光信號（R