Btrc基因的過表達試劑及其制備和應用方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于腫瘤分子生物學領域，具體設及BTRC基因的過表達試劑及其制備和 應用方法。
【背景技術】
[0002] 鼻咽癌（化so地aryngealCarcinoma,NPC)是我國南方地區常見的頭頸部惡性腫 瘤，由鼻咽粘膜上皮發生惡性轉化而來，大多數為低分化鱗狀細胞癌，惡性程度高且發病部 位隱蔽，特別是發生在咽隱窩和鼻咽頂部的患者早期癥狀不明顯，因而難W早期發現，誤診 誤治率較高；另外鼻咽癌極易發生轉移，初診患者頸部淋己結轉移率高達80%。放射治療 是目前鼻咽癌臨床上最常用的治療手段，60~70 %的患者能取得較好的療效，但仍有20~ 30%的患者會出現復發和轉移。復發和轉移是臨床上導致鼻咽癌患者死亡的主要因素之 一，且放化療對治療鼻咽癌的復發、轉移效果不理想，因此，篩選新的鼻咽癌早期轉移及預 后判斷的分子標記物，對于鼻咽癌的臨床治療有著重要的指導意義，同時相比較傳統的放 化療手段，生物治療的方法更適合復發和轉移鼻咽癌的治療，其中基因療法對防治鼻咽癌 的復發、轉移具有更重要而廣闊的臨床應用前景，篩選鼻咽癌基因治療的祀點也同樣意義 重大。
[0003] 我們通過基因忍片技術，篩選到了BTRC基因（GenebankGeneID:8945 ;參考序列： NM033637. 3)在鼻咽癌中表達下調。迄今為止有關BTRC與鼻咽癌發生發展中的作用的關 系及其在鼻咽癌病人的早期篩查、輔助診斷或者療效預測等方面均沒有文獻報道。我們通 過研究表明，BTRC在鼻咽癌組織中的表達水平與鼻咽癌的侵襲轉移及預后密切相關，鼻咽 癌組織中BTRC基因表達水平較低的患者更容易復發和轉移，因而生存時間較BTRC基因表 達水平高的患者更短。表明BTRC基因可W作為鼻咽癌輔助診斷、療效預測及預后判斷等的 分子標記，針對BTRC設計專用巧光實時定量PCR引物、原位雜交探針及免疫組織化學檢測 試劑盒等，用于檢測鼻咽癌組織中BTRC的表達水平有望為臨床上對鼻咽癌進行復發和轉 移的預測提供參考。
[0004] 此外，我們在鼻咽癌細胞中轉染人工合成的BTRC基因干擾序列（siRNA)W抑制 BTRC基因的表達，證實在鼻咽癌細胞株中下調BTRC基因的表達可W促進鼻咽癌細胞的 侵襲轉移；通過設計并構建BTRC基因的過表達載體，成功地在鼻咽癌細胞中表達BTRC基 因，可W有效地抑制鼻咽癌細胞的侵襲與轉移能力；通過一系列研究，申請人進一步證實 了BTRC基因編碼一個名為P-TrCP化eta-transducinrepeatcontainingE3ubiquitin proteinligase)的E3 泛素蛋白連接酶巧3ubiquitinproteinligase)，P-TrCP是細 胞內蛋白經泛素化途徑降解過程中的關鍵酶之一，可較特異地調控它的底物P-catenin 和Snail經泛素化途徑降解，從而維持P-catenin和Snail運兩個蛋白在細胞中的含量。 P-catenin、Snail是細胞上皮-間質轉換（epithelial-mesenchymaltransition,EMT) 過程中的關鍵調控因子，而上皮-間質轉換又是腫瘤細胞發生侵襲轉移的最為關鍵的第一 步。因此，申請人通過研究證實了鼻咽癌細胞中BTRC表達下調，導致其編碼的P-TrCP蛋 白量減少，P-TrCP的底物P-catenin和Snail的降解減慢，造成P-catenin和Snail在 細胞內聚集，推動了鼻咽癌細胞的上皮-間質轉換，使鼻咽癌細胞具備更強的侵襲與轉移 能力，從而表現為鼻咽癌患者的復發轉移，最終導致患者死亡。在鼻咽癌細胞中通過基因工 程的手段重新表達BTCR，則可W明顯地抑制鼻咽癌細胞的侵襲與轉移能力。因此，BTRC基 因W及其下游包括P-catenin和Snail在內的細胞上皮-間質轉換相關信號通路又可W 成為鼻咽癌基因治療的潛在祀點，特別是BTRC過表達載體在鼻咽癌的基因治療中具有重 要的應用前景。將BTRC基因過表達載體負載到多聚賴氨酸修飾的娃納米顆粒上制成納米 基因轉運體，多聚賴氨酸修飾的娃納米顆粒可保護BTRC基因過表達載體免受核酸酶降解， 延長作用時間，且有更高的轉染效率。進而為制備防治鼻咽癌的復發和轉移的制劑提供新 的途徑。

【發明內容】
陽0化]本發明的目的之一是提供BTRC基因的過表達試劑。
[0006] 本發明的目的之二是提供BTRC基因的過表達試劑的制備方法。
[0007] 本發明的目的之S是提供BTRC基因的過表達試劑的應用方法。 陽00引 BTRC基因的過表達試劑的制備方法，制備能夠表達BTRC基因的表達載體。選擇 PCDNA3. 1空白載體構建BTRC的過表達載體，酶切PCDNA3. 1載體并將BTRC序列插入，得到 用于真核表達BTRC的載體質粒。
[0009] 構建PCDNA3. 1 - BTRC真核載體步驟如下：
[0010] 1)W鼻咽癌細胞H肥2的cDNA為模板，利用TaKaRaLATaq愈酶進行PCR擴增 SEQN0 :1所示的全長BTRC編碼區序列，BTRC編碼區序列擴增引物如下：
[0011] 上游引物：5 ' -ATGGACCCGGCCGAGGCGGT-3 '
[0012] 下游引物：5, -TTATCTGGAGATGTAGGTGTATGTT-3'
[001引在上、下游引物的5'端分別加上限制性內切酶化eI和EcoRI識別位點及保護 堿基后，引物序列如下：
[0014] 上游：5'-AGGAGCTAGCATGGACCCGGCCGAGGCGGT-3' ' 下劃線部分為Mie I識別位點，
[0015]下游：5' -ATGCGAATTCTTATCTGGAGATGTAGGTGTATGTT-3'，下劃線部分為EcoRI識 別位點；
[0016] 2)PCR擴增，BTRC編碼區序列，PCR反應條件如下：
[0017] TaKaRaLAT'aq及轉 lj4 說P放上鑛弓I物 0.4軸 lOjim下游引物 0.4叫 cDNA巧板 2.0ul dHaO 巧.2抖1 5x PC民反應緩沖液 4.14 Total 雜jil
[0018] PCR反應步驟
[0019] :斜巧 5min % '.C 10 sec 62'C 撕洗c 72巧彿s斌
[0020] 返回到第2步，共進行39次反應循環； 陽02U 如將PCR產物電泳、膠回收目的片段后經化eI和EcoRI雙酶切后電泳，再次膠 回收； 陽02引 4) PCDNA3. 1質粒經化e I和EcoR I雙酶切后電泳膠回收目的片段；
[0023] 5) W T4DNA連接酶連接4)和5)步膠回收產物，即可得到可用于真核表達BTRC的 載體質粒。
[0024] 將上述方法制備得到的包含BTRC編碼區序列的PCDNA3. 1真核表達質粒轉化感受 態大腸桿菌，W擴增質粒。
[00巧]還能將表達載體負載到多聚賴氨酸修飾的娃納米顆粒上制成納米球。
[00%] 多聚賴氨酸修飾的娃納米顆粒是運用0P-10、環己燒、氨水的微乳液自組裝技術進 行娃納米顆粒的合成，并利用娃納米顆粒的表面能和離子靜電作用進行多聚賴氨酸表面修 飾，制備得到。
[0027] BTRC基因的過表達試劑，是由上述的方法制備得到的。
[0028] 所述的BTRC基因的過表達試劑的應用方法，用于制備防止鼻咽癌復發和轉移的 制劑。
[0029] 所述的BTRC基因的過表達試劑的應用方法，用于制備BTRC基因表達產物P-TrCP 的底物P-catenin和Snail的降解的制劑。具體是用于制備抑制上皮-間質轉換制劑。該 制劑促進BTRC基因的表達能使上皮細胞的標志物Z0-1、E-ca化erin和Claudin-1的表達 升高，而間質細胞的標志物ZEB1、N-ca化erin、Vimentin及Slug的表達降低。
[0030] 本發明證實在鼻咽癌細胞株中下調BTRC基因的表達可W促進鼻咽癌細胞的侵襲 轉移；通過設計并構建BTRC基因的過表達載體，成功地在鼻咽癌細胞中表達BTRC基因，可 W有效地抑制鼻咽癌細胞的侵襲與轉移能力。進而為制備防治鼻咽癌的復發和轉移的制劑 提供新的途徑。
【附圖說明】
[0031] 圖1為利用基因忍片技術從6例正常鼻咽上皮組織和10例鼻咽癌組織中篩選得 到的差異表達基因圖譜；
[0032] 共篩選得到差異表達基因2461個，其中在鼻咽癌中表達上調的基因與1677個，在 鼻咽癌中下調的基因有784個；N代表正常鼻咽上皮組織，T代表鼻咽癌組織。
[0033] 圖2為基因忍片數據中BTRC基因在正常鼻咽上皮組織和鼻咽癌組織中的表達情 況，BTRC基因在鼻咽癌組織中的表達明顯下調（P= 0. 001);
[0034] N代表正常鼻咽上皮組織，T代表鼻咽癌組織。
[0035] 圖3為利用巧光實時定量PCR技術驗證了BTRC基因在正常鼻咽上皮組織和鼻咽 癌組織中的表達情況，BTRC基因在鼻咽癌組織中的表達明顯下調（P<0. 05); W36] N代表正常鼻咽上皮組織（共9例），T代表鼻咽癌組織（共28例）。
[0037] 圖4為免疫組織化學方法檢測BTRC在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表達情況；
[0038]正常鼻咽上皮（Non-tumorNPE；)中BTRC表達水平較高（positive)，而在106例鼻 咽癌（NPC)中有48例檢測到BRTC的低表達化OW)，其余58例為高表達Oii曲）。
[0039] 圖5為原位雜交檢測BTRC在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表達情況；
[0040] 原位雜交的結果與免疫組織化學結果具有很高的一致性。
[0041] 圖6為鼻咽癌中BTRC的表達與鼻咽癌患者預后的關系；
[0042] 鼻咽癌中BTRC的表達與鼻咽癌患者的預后密切相關，BTRC高表達（化曲）的患 者不論無病生存時間值isease化eesurvival,DFS，左）還是總的生存時間（Overall survival,0S，右）都要明顯長于BTRC低表達(X〇w)的患者。
[0043] 圖7為在鼻咽癌細胞H肥2、5-8F和C666-1中導入BTRC過表達載體度TRC0巧和 RNA干擾序列（siBTRC)后，實時巧光定量PCR方法檢測了鼻咽癌細胞中BTRC的表達情況 (mRNA水平），導入BTRC過表達載體后，BTRC基因的表達顯著升高（左），而導入RNA干擾 序列后，BTRC基因的表達顯著降低（右），NC為陰性對照（negativecontrol)。
[0044] 圖8為在鼻咽癌細胞H肥2、5-8F和C666-1中導入BTRC過表達載體度TRC0巧和 RNA干擾序列（siBTRC)后，Westernbloting方法檢測了鼻咽癌細胞中BTRC的表達情況 (蛋白水平），導入BTRC過表達載體后BTRC基因的表達顯著升高（左）