通過與環己烷羧酸合成相關的碳鏈延伸生產7碳化學物的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及使用一種或多種分離的酶例如P-酬硫解酶、脫氨酶、還原酶、硫醋 酶、脫簇酶、水合酶、合酶、硫醋酶、CoA-連接酶、CoA-轉移酶、脫乙酷基酶，或轉氨酶，或使 用表達一種或多種運些酶的重組宿主細胞，生物合成W下一種或多種物質的方法：庚二酸、 7-徑基庚酸、7-氨基庚酸、庚二胺和1,7-庚二醇（下文稱為"C7結構單元"）。 陽00引發明背景
[0003] 尼龍是聚酷胺，其一般通過二胺與二簇酸的縮聚合成。類似地，尼龍可通過內 酷胺的縮聚生成。一種無處不在的尼龍是尼龍6,6,其通過六亞甲基二胺（HMD)和己 二酸的反應生成。尼龍6可通過己內酷胺的開環聚合生成（Anton&Baird,Polyamides Fibers,EncyclopediaofPolymerScienceandTechnology, 2001)。
[0004] 尼龍7和尼龍7, 7代表與尼龍6和尼龍6, 6相比具有增值特征的新型聚酷胺。尼 龍7是通過7-氨基庚酸聚合生成的，而尼龍7, 7是通過庚二酸和庚二胺的縮聚生成的。不 存在生成用于尼龍7和尼龍7, 7的單體的經濟上可行的石油化學路徑。 陽0化]鑒于沒有經濟上可行的石油化學單體給料；生物技術提供了一種經由生物催化的 備選方法。生物催化是使用生物催化劑（諸如酶）來實施有機化合物的生物化學轉化。
[0006] 生物衍生給料和石油化學給料兩者是用于生物催化過程的可行起始材料。
[0007] 因而，針對此背景，清楚的是需要用于生成庚二酸、7-徑基庚酸、7-氨基庚酸、庚 二胺和1，7-庚二醇化巧tanediol)(下文為"C7結構單元"）中一種或多種的可持續方法， 其中所述方法是基于生物催化劑的。
[0008] 然而，無野生型原核生物或真核生物天然過度生成運類C7結構單元或將其排出 至胞外環境。不過，已經報告了庚二酸的代謝。
[0009] 二簇酸庚二酸作為碳源經由P-氧化被眾多細菌和真菌有效轉化成中屯、代謝 物。輔酶A(CoA)活化的庚二酸到CoA活化的3-氧代庚二酸的P-氧化經由例如與芳香 族底物降解有關的途徑促進進一步代謝。已經廣泛表征了 3-氧代庚二酷基-CoA被幾種 細菌分解代謝成乙酷基-CoA和戊二酷基-CoA(HarwoodandParales,AnnualReviewof Microbiology, 1996, 50:553 - 590)。
[0010] 最優性原理陳述微生物調節其生物化學網絡W支持最大生物量生長。超出宿主 生物體中表達異源路徑的需要，將碳流量引向充當碳源而非充當生物量生長成分的C7結 構單元與最優性原理矛盾。例如，與天然生產者的產量性能相比，將1-下醇途徑從梭菌 (Clostridium)物種轉移入其它生產菌株中經常下降一個數量級（化en等，Appl.Environ. Microbiol.，2011，77巧）：2905 - 2915)。
[0011] 在C7脂肪族主鏈上形成末端官能團（諸如簇基、胺或徑基基團）前，7碳脂肪族主 鏈前體的有效合成是合成一種或多種C7結構單元中的重要考慮因素。 陽〇1引發明概述
[0013] 本申請至少部分地基于W下發現：可構建用于生產屯碳鏈式脂族主鏈前體的生 物化學途徑，在所述屯碳鏈式脂族主鏈前體中可形成一個或兩個官能團，例如簇基、胺或 者徑基，導致W下一種或者多種物質的合成：庚二酸、7-氨基庚酸、7-徑基庚酸、庚二胺和 1，7-庚二醇（下文稱為"C7結構單元")。庚二酸和庚二酸鹽（醋），7-徑基庚酸和7-徑基庚 酸鹽（醋），7-氨基庚酸和7-氨基庚酸鹽（醋）本文中可替換使用，指代W其任意中性或離 子化形式的化合物，包括其任意的鹽形式。本領域的技術人員應當理解具體的形式將依賴 于pH。本文描述的運些途徑、代謝工程和培養策略依賴于與Synt虹ophusaciditrophicus 中環己燒簇酸生物合成或2-氨基己二酸賴氨酸生物合成相關的碳鏈延伸的酶或同源物。
[0014] 面對最優性原理，令人驚訝地發現，可將適當的非天然途徑、原料、宿主微生物、對 宿主的生物化學網絡的弱化策略和培養策略組合起來，來高效地生產一種或多種C7結構 單元。
[0015] 在一些實施方案中，用于轉化為C7結構單元的C7脂族主鏈是3-酬庚二 酷-CoA(也可W稱為3-氧代庚二酷-CoA)或庚二酷-CoA，其可W使用與Synt虹ophus aciditro地i州S中環己燒簇酸合成或2-氨基己二酸賴氨酸生物合成相關的酶，從乙 酷-CoA形成。見圖1和圖2。
[0016] 在一些實施方案中，末端簇基可使用硫醋酶、醒脫氨酶、7-氧代庚酸脫氨酶、 CoA-轉移酶、或可逆CoA-連接酶酶促形成。見圖1、圖2和圖3。
[0017] 在一些實施方案中，末端胺基可W使用《-轉氨酶或者脫乙酷基酶酶促形成。見 圖4和圖5。
[0018] 在一些實施方案中，末端徑基可W使用醇脫氨酶酶促形成。見圖6和圖7。
[0019] 在一個方面，本申請的特征在于生物合成選自下組的產物的方法：庚二酸、7-氨 基庚酸、7-簇基庚酸、庚二胺和1,7-庚二醇。所述方法包括使用與環己燒簇酸生物合成或 2-氨基己二酸賴氨酸的生物合成途徑相關的酶，酶促合成屯碳鏈式脂族主鏈，并在所述主 鏈中酶促形成一個或兩個選自簇基、胺和徑基的末端官能團，從而形成所述產物。所述屯碳 鏈式脂族主鏈可W是庚二酷-CoA。可W通過3-酬庚二酷-CoA，從乙酷-CoA或2-氧代戊二 酸酶促合成庚二酷-CoA。P-酬硫解酶或P-酬脂酷[acp]合酶可W將戊二酷-CoA轉化 為3-酬庚二酷-CoA。可W使用戊締二酷-CoA脫簇酶或戊二酷-CoA脫氨酶，從己豆酷-CoA 生產戊二酷-CoA。可W使用3-徑基己二酷-CoA脫氨酶將3-酬庚二酷轉化為3-徑基庚二 酷-CoA;3-徑基庚二酷-CoA可W由6-氧代-環己-1-締-幾基-CoA水解酶轉化為6-酬 環己-1-締-1-幾基簇酷-CoA，或者3-徑基庚二酷-CoA可W由締酷-CoA水合酶轉化為 2, 3-脫氨庚二酷-CoA。
[0020] 所述兩個末端官能團可W是相同的（例如胺或徑基），或者可W是不同的（例如末 端胺和末端簇基；或末端徑基和末端簇基）。
[0021] 轉氨酶或者脫乙酷基酶可W酶促形成胺基。所述《-轉氨酶可W與列于SEQ IDNO. 8-13中的任一氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。
[0022] 6-徑基己酸脫氨酶、5-徑基戊酸脫氨酶、4-徑基下酸脫氨酶、或醇脫氨酶可W酶 促形成徑基基團。
[0023] 硫醋酶、醒脫氨酶、7-氧代庚酸脫氨酶、6-氧代己酸脫氨酶、CoA-轉移酶（例如戊 締二酸CoA轉移酶）、或可逆CoA-連接酶（例如可逆班巧酷-CoA連接酶）可W酶促形成末 端簇基。所述硫醋酶可W與列于SEQIDNO: 1中的氨基酸序列具有至少70%的序列同一 性。
[0024] 簇酸還原酶和憐酸泛酷琉基乙胺基轉移酶能夠形成末端醒基，作為形成所述產物 的中間物。所述簇酸還原酶可W與列于SEQIDNO. 2-7中的任一氨基酸序列具有至少70% 的序列同一性。
[00巧]任意所述方法可W通過發酵在重組宿主中進行。所述宿主可W經受厭氧、微氧或 混合的氧/反硝化培養條件下的培養策略。所述宿主可W在營養限制的條件下培養。所述 宿主可W使用陶瓷中空纖維膜保留，W維持發酵期間的高細胞密度。
[00%] 在任意所述方法中，所述宿主對高濃度C7結構單元的耐受可W通過在選擇環境 中連續培養來改善。
[0027] 進料至發酵的主要碳源可W衍生自生物或非生物原料。在一些實施方案中，所述 生物原料是W下物質，包括W下物質，或衍生自W下物質：單糖、二糖、木質纖維素、半纖維 素、纖維素、木質素、乙酷丙酸和甲酸、甘油=醋、甘油、脂肪酸、農業廢物、濃縮的酒糟可溶 物或城市廢物。
[0028] 在一些實施方案中，所述非生物原料是W下物質，或衍生自W下物質：天然氣、合 成氣、CO2/H2、甲醇、乙醇、苯甲酸、來自環己燒氧化過程的非揮發性殘留物（NVR)或者堿洗 廢物流，或對苯二甲酸/異獻酸混合物廢物流。
[0029] 另一方面，本申請的特征在于重組宿主，其包括至少一種外源性核酸，其編碼（i) P-酬硫解酶或P-酬脂酷[acp]合酶，（ii) 6-氧代-環己-1-締-幾基-CoA水解酶或締 酷-CoA水合酶，和（iii)反式-2-締酷-CoA還原酶，締酷-[acp]還原酶，或2-酬環己燒 簇基-CoA水解酶，所述宿主生產庚二酷-CoA。所述宿主可W進一步包括戊締二酷-CoA脫 簇酶或戊二酷-CoA脫氨酶。
[0030] 生產庚二酷-CoA的重組宿主進一步可W包括至少一種編碼W下一種或多種物 質的外源性核酸：硫醋酶、醒脫氨酶、7-氧代庚酸脫氨酶、6-氧代己酸脫氨酶、戊締二酸 CoA-轉移酶，可逆班巧酷-CoA-連接酶、乙酷化醒脫氨酶、或簇酸還原酶，所述宿主生產庚 二酸或庚二酸半醒。
[0031] 生產庚二酸半醒的重組宿主進一步可W包括至少一種編碼轉氨酶的外源性 核酸，并生產7-氨基庚酸。
[0032] 生產庚二酸半醒的重組宿主進一步可W包括至少一種編碼編碼W下物質的外源 性核酸：4-徑基下酸脫氨酶、5-徑基戊酸脫氨酶、或6-徑基己酸脫氨酶，所述宿主生產 7-簇基庚酸。
[0033] 生產庚二酸半醒、7-氨基庚酸、或7-徑基庚酸的重組宿主進一步可W包括簇酸還 原酶、轉氨酶、脫乙酷基酶、N-乙酷轉移酶、或醇脫氨酶，所述宿主生產庚二胺。
[0034] 生產7-徑基庚酸的重組宿主進一步可W包括至少一種編碼簇酸還原酶或醇脫氨 酶的外源性核酸，所述宿主生產1，7-庚二醇。
[0035] 所述重組宿主可W是原核生物，例如來自埃希氏菌屬（Escherichia)如大 腸桿菌巧scherichiacoli);來自梭菌屬（Clostridia)如楊氏梭菌（Clostridium ljungd址lii)、自產乙醇梭菌（Clostridiumautoethanogenum)或者克魯佛梭 菌（Clostridiumkluyveri);來自棒狀桿菌屬（Corynebacteria)如谷氨酸棒狀桿 菌（Corynebacteriumglutami州m);來自貪銅菌屬（Qipriavidus)如鉤蟲貪銅菌 (Qipriavidusnecator)或者耐金屬貪銅菌（Qipriavidusmetallidurans);來自假單 胞菌屬（Pseudomonas)如巧光假單胞菌（Pseudomonasfluorescens)、惡臭假單胞菌 (Pseudomonasputida)或者食油假單胞菌（Pseudomonasoleavorans);來自代爾夫特菌 屬值elftia)如食酸代爾夫特菌值elftiaacidovorans);來自芽抱桿菌屬度acillus) 如枯草芽胞桿菌度acillussubtillis);來自乳桿菌屬（Lactobacillus)如德氏乳桿 菌（Xactobacillusde化rueckii);或者來自乳球菌屬（Xactococ州S)如乳酸乳球菌 (Xactococ州Slactis)或來自紅球菌屬巧hodococcus)如馬紅球菌巧hodococcusequi)。
[0036] 所述重組宿主可W是真核生物，例如來自曲霉屬（Aspergillus)如黑曲霉 (Aspergillusniger);來自酵母屬（Saccharomyces)如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae);來自畢赤氏酵屬（Pichia)如己斯德畢赤酵母（Pichiapastoris);來自 耶羅維亞酵母屬（Yarrowia)如解脂耶羅維亞酵母（Yarrowialipolytica);來自伊薩 酵母屬（Issatchenkia)如東方伊薩酵母（Issathenkiaorientalis);來自德己利酵母 屬值ebaryomyces)如漢遜德己利酵母值ebaryomyceshansenii);來自Arxula屬如 Arxulaadenoinivorans;或者來自克魯維酵母菌屬化luyveromyces)如乳酸克魯維酵母 菌化luyveromyceslactis)的真核生物。
[0037] 本文所述的任意重組宿主進一步可W包括一種或多種W下弱化的酶：產生乙酸 的憐酸轉乙酷酶，乙酸激酶；乳酸脫氨酶；甲基糞釀（menaquinol)-延胡索酸氧化還原酶； 產生乙醇的乙醇脫氨酶；丙酬酸脫簇酶；產生異下醇的2-含氧酸脫簇酶；聚合物合酶； NADPH特異性心谷氨酸脫氨酶；NADPH/NADH心谷氨酸脫氨酶；NADPH-消耗型轉氨酶；庚二 酷-CoA脫氨酶；降解C7結構單元及其前體的酷基-CoA脫氨酶；戊二酷-CoA脫氨酶；或庚 二酷-CoA合成酶。
[0038] 本文所述的任意重組宿主進一步可W過表達編碼W下物質的一種或多種基因：乙 酷-CoA合成酶、甲酸脫氨酶、PEP簇激酶、PEP簇化酶、丙酬酸簇化酶、PEP合酶、k丙氨酸 脫氨酶；NADH-特異性心谷氨酸脫氨酶；二胺轉運體；二簇酸轉運體；和/或多藥物轉運體。
[0039] 本文所述途徑的反應可W在一種或多種細胞（例如宿主細胞）株中進行，所述細 胞株（a)天然表達一種或多種相關酶，化）經遺傳工程化而表達一種或多種相關酶，或（C) 天然表達一種或多種相關酶并經遺傳工程化而表達一種或多種相關酶。或者，可W從W上 任意類型的宿主細胞中提取相關酶，并W純化或半純化形式使用。提取的酶可選地固定在 固體基質上，例如適合的反應容器的底和/或壁。此外，運些提取物包括可W作為相關酶來 源使用的裂解物（如細胞裂解物）。在本申請提供的方法中，所有步驟可W在細胞（例如宿 主細胞）中進行，所有步驟可W使用提取的酶進行，或一些步驟可W在細胞中進行，而其它 步驟可W使用提取的酶進行。
[0040] 本文所述的多種酶催化可逆反應，并且感興趣的反應可W是所述反應的逆反應。 圖1-6所示的示意性途徑闡明了對于每種中間物感興趣的反應。
[0041] 在一些實施方案中，所述宿主微生物的內源性生物化學網絡被弱化或增強，來（1) 保證乙酷-CoA的細胞內可用性（2)創造NADP的不平衡，其僅可W通過C7結構單元的形成 來平衡，（3)阻止通向和包括C7結構單元的中屯、代謝物或中屯、前體的降解，和/或（4)保 證從細胞的高效流出。
[0042] 除非另外定義，本申請使用的所有技術和科學術語的定義與本發明所屬領域的普 通技術人員所通常理解的含義相同。雖然與本申請所述的方法和材料相似或者等同的方法 和材料也可用于實踐本發明，但在下文描述適合的方法和材料。本文提及的所有公開、專利 申請、專利和其它參考文獻通過提述完整并入本文。在沖突的情況下，W本說明書包括定義 為準。另外，材料、方法和實施例僅為示例性的而不意圖限制。
[0043] 本發明的一個或多個實施方案的細節列于下面的附圖和描述中。根據說明書和附 圖，并根據權利要求，本發明的其它特征、目的和優點將顯而易見。根據專利法的標準實踐， 詞語"包含"在權利要求中可被"基本上由…組成"或者"由…組成"替代。
[0044] 附圖簡述 W45] 圖1是從乙酷-CoA或2-氧代戊二酸作為中屯、代謝物通向庚二酷-CoA的示例性 生物化學途徑的示意圖。
[0046] 圖2是使用庚二酷-CoA作為中屯、前體通向庚二酸的示例性生物化學途徑的示意 圖。
[0047] 圖3是使用庚二酷-CoA或庚二酸作為中屯、前體通向7-氨基庚酸的示例性生物化 學途徑的示意圖。
[0048] 圖4是使用7-氨基庚酸、7-徑基庚酸或庚二酸半醒作為中屯、前體通向庚二胺的示 例性生物化學途徑的示意圖。
[0049] 圖5是使用庚二酷-CoA或庚二酸作為中屯、前體通向7-徑基庚酸的示例性生物化 學途徑的示意圖。
[0050] 圖6是使用7-徑基庚酸作為中屯、前體通向1，7-庚二醇的示例性生物化學途徑的 示意圖。
[0051] 圖7含有由tesB編碼的大腸桿菌硫醋酶（參見GenBank登錄號AAA24665. 1， 沈QIDNO: 1)、海分枝桿菌（Mycobacteriummarinum)簇酸還原酶（參見GenBank登錄號 ACC40567. 1，沈QIDN0:2)、恥垢分枝桿菌（Mycobacteriumsmegmatis)簇酸還原酶（參 見GenBank登錄號ABK71854. 1，SEQIDN0:3)、Se即iliparusrugosus簇酸還原酶（參見 GenBank登錄號EFV11917.1，SEQIDN0:4)、恥垢分枝桿菌簇酸還原酶（參見GenBank登錄 號ABK75684.1，沈QIDN0:5)、馬賽分枝桿菌（Mycobacteriummassiliense)簇酸還原酶 (參見GenBank登錄號EIV11143.1，SEQIDN0:6)、Se即iliparusrotundus簇酸還原酶（參 見GenBank登錄號ADG98140. 1，SEQIDN0:7)、紫色色桿菌（Qiromobacteriumviolaceum) w-轉氨酶（參見GenBank登錄號AAQ59697.1，SEQIDN0:8)、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa) ?-轉氨酶（參見GenBank登錄號AAG08191. 1，沈QIDN0:9)、下香假單胞菌 (Pseudomonassyringae)"-轉氨酶（參見GenBank登錄號AAY39893.1，沈QIDN0:10)、球 形紅桿菌巧hodobactersphaeroides) ?-轉氨酶（參見GenBank登錄號ABA81135. 1，沈Q 10^:11)、大腸桿菌《-轉氨酶（參見66址3證登錄號44457874.1，沈9 10^:12)、河流 弧菌（VibrioFluvialis) ?-轉氨酶（參見GenBank登錄號AEA39183. 1，沈QIDN0:13)、 枯草芽抱桿菌度acillussubtilis)憐酸泛酷琉基乙胺基轉移酶（參見GenBank登錄號 〔八八44858.1，沈910側：14)、或諾卡爾菌物種（齡〇曰'山3 3口.）服化5646憐酸泛酷琉基乙 胺基轉移酶（參見GenBank登錄號ABI83656. 1，SEQIDN0:15)的氨基酸序列。
[0052] 圖8是釋放的CoA在412皿處相對吸光度的柱狀圖，其作為相對于空載體對照，硫 醋酶將庚二酷-CoA轉化為庚二酸的活性的測量。
[0053] 圖9是總結20分鐘后在340nm處吸光度的改變的柱狀圖，其為相對于只有酶的對 照（沒有底物），NADPH的消耗和簇酸還原酶的活性的測量。
[0054] 圖10是20分鐘后在340nm處吸光度的改變的柱狀圖，其為相對于空載體對照， NADPH的消耗和簇酸還原酶將庚二酸轉化為庚二酸半醒的活性的測量。 陽化5] 圖11是20分鐘后在340nm處吸光度的改變的柱狀圖，其為相對于空載體對照， NADPH的消耗和簇酸還原酶將7-徑基庚酸轉化為7-徑基庚醒的活性的測量。
[0056] 圖12是20分鐘后在340nm處吸光度的改變的柱狀圖，其為相對于空載體對照，NADPH的消耗和簇酸還原酶將N7-乙酷-7-氨基庚酸轉化為N7-乙酷-氨基庚醒的活性的 測量。 陽057] 圖13是20分鐘后在340皿處吸光度的改變的柱狀圖，其為相對于空載體對照， NADPH的消耗和簇酸還原酶將庚二