一種蚜蟲共生菌多重pcr檢測的引物組和檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物檢測領域，具體涉及一種蚜蟲共生菌多重PCR檢測的引物組和 檢測方法。
【背景技術】
[0002] 姐蟲，屬于半翅目，胸卩彖亞目（Sternorrhyncha)，是一類重要的經濟害蟲。姐蟲和 細菌的關系密切，共生菌在蚜蟲中發揮著多樣化的功能，如補充營養、增強蚜蟲對高溫的忍 耐，增強蚜蟲對寄生蜂寄生和真菌感染的抵抗能力，擴大蚜蟲的寄主范圍等。但是蚜蟲共生 菌對生存環境要求苛刻，基本上都不能在蚜蟲體外進行純培養，因此蚜蟲共生菌的感染檢 測都是通過分子手段進行鑒定的。蚜蟲共生菌作為除了蚜蟲核糖體和線粒體DNA外第三種 可遺傳的物質，以其為對象開展的蚜蟲種群遺傳結構分析、真核和原核生物互作，以及利用 共生菌作為介體開展對蚜蟲的生物防治都是目前國內外研究的熱點。如何對蚜蟲中共生菌 的物種多樣性進行準確的分析，是開展上述研究工作的前體前提，但是目前對蚜蟲共生菌 的檢測工作基本上都是單個物種進行的，需要耗費大量的人力物力。多重PCR是在環境微 生物物種多樣性檢測中一種高效的分子檢測方法，已經廣泛的應用在土壤微生物、植物病 原微生物多樣性的檢測中，并取得了很好的結果。
[0003] 沃爾巴克氏菌（Wolbachia pipientis)、殺雄菌屬（Arsenophonus)和!lj牙蟲 U 型共生菌（Regiella insecticola)是姐蟲中常見的三種共生菌，本發明中成功建立了 一套快速、準確、直觀并兼有高靈敏度的多重PCR反應體系，力圖一次性闡明待測蚜蟲 總DNA中三種共生菌的感染情況。本發明中以三種蚜蟲共生菌相關的蛋白質基因作為 靶標基因，相較于目前細菌鑒定中常用的16S rRNA基因具有更強的靈敏度和特異性。 wsp基因編碼的是細菌外膜蛋白，是國際上對沃爾巴克氏菌進行檢測和分型的通用基因 (Zhou ff, Rousset F, O'Neill S. 1998. Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences. Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological sciences，265:509-515) ;yaeT 基因編碼的是外膜 蛋白組裝因子，已經廣泛的應用于蟲牙蟲殺雄菌屬的多基因分型中（Jousselin E，Coeur d'Acier A,Vanlerberghe-Masutti F,Duron 0.2012.Evolution and diversity of Arsenophonus endosymbionts in aphids. Molecular Ecology, 22:260-270) ;gltA 基因 編碼細菌中的檸檬酸合成酶，已經成功的用于蚜蟲U型共生菌的檢測（Li T，Xiao JH，Wu YQ, Huang Dff. 2014.Diversity of bacterial symbionts in populations of Sitobion miscanthi (Hemiptera:Aphididae) in China. Environmental Entomology, 43:605-611) 〇 本發明中使用的引物組合分別擴增wsp基因435bp片段、yaeT基因294bp片段、gltA基因 174bp片段，擴增片段間長度差異都超過100bp，普通的1%的瓊脂糖凝膠電泳就可以完全 清楚分辨不同的擴增產物，從而直觀的反應出待測的蚜蟲樣品中共生菌的感染情況。本發 明所使用的引物序列均為獨立設計出來的。

【發明內容】

[0004] 針對現有技術中存在的問題，本發明體提供一種蚜蟲共生菌多重PCR檢測的引物 組和檢測方法，該多重PCR檢測方法可同時快速、準確鑒定蚜蟲樣品是否感染三種常見共 生菌，克服了現有技術中對蚜蟲共生菌檢測耗時耗力的缺點，為下游的相關研究節省一定 的人力物力。
[0005] 本發明采用的技術方案為：
[0006] -種蚜蟲共生菌多重PCR檢測的引物組，所述引物組是由檢測爾巴克氏菌 (Wolbachia pipientis)、殺雄菌屬（Arsenophonus)和！lj牙蟲 U 型共生菌（Regiella insecticola)的引物對組成；
[0007] 所述檢測沃爾巴克氏菌引物對（Wol-F/R)的上下游引物的核苷酸序列為：
[0008]上游引物 Wol-F :5' -ATAGCTGGTGGTGGTGCATT-3'（SEQ ID NO. 1)，
[0009]下游引物 Wol-R :5'-TGCACCAACAGTGCTGTAAAC-3'（SEQ ID NO. 2);
[0010] 所述檢測殺雄菌的引物對（Ars-F/R)的上下游引物的核苷酸序列為：
[0011] 上游引物 Ars-F :5' -AGCGCTATTTTCAACGGGTA-3'（SEQ ID N0. 3)，
[0012] 下游引物 Ars-R :5'-CGATTACTCGGTAGCGGTGT-3'（SEQ ID NO. 4);
[0013] 所述檢測蚜蟲U型共生菌的引物對（Reg-F/R)的上下游引物的核苷酸序列為：
[0014] 上游引物 Reg-F :5' -ACTGCTCCATCGTGGITITC-3'（SEQ ID N0. 5)，
[0015] 下游引物 Reg-R :5' -CCACGAAAAAGATGCCAAAT-3'（SEQ ID NO. 6)。
[0016] -種蚜蟲共生菌多重PCR檢測的方法，該方法是將上述的引物組與待測蚜蟲樣品 的總DNA進行多重PCR反應，反應結束后對PCR反應產物進行電泳分析，以確定蚜蟲樣品中 是否含有蚜蟲共生菌，具體包括以下步驟：
[0017](1)引物合成：合成權利要求1所述的引物組中的三種引物對；
[0018] (2)DNA |旲板提取：提取!lj牙蟲樣品的總DNA ;
[0019] (3)多重PCR擴增反應：以步驟⑵提取得到的總DNA為模板，以步驟⑴中合成 的引物組為引物，進行PCR擴增反應；
[0020] (4)多重PCR產物分析：將步驟（3)中得到的多重PCR擴增產物進行電泳分析。
[0021] 根據上述蚜蟲共生菌多重PCR檢測的方法，其中，PCR擴增反應的反應體系為 50yl :10XPCRBufTer(100mM/LTris-HCl，500mM/LKCl)5yl，2.5mM/I^9dNTPs4yl，5U/ y 1 的 Taq DNA 聚合酶 0? 5 y 1，10 y m/L 的 wsp-F 2. 0 y 1，10 y m/L 的 wsp-R 2. 0 y 1，10 y m/ L 的 Ars_F 2. 0 y 1，10 y m/L 的 Ars-R 2. 0 y 1，10 y m/L 的 Reg_F2. 0 y 1，10 y m/L 的 Reg-R 2. 0 y 1，DNA 模板 1 y 1，25mM/L 的 MgCl23 y 1，去離子水補至 50 y 1。
[0022] 根據上述蚜蟲共生菌多重PCR檢測的方法，PCR擴增反應的反應條件為：
[0023] a :94°C 預變性 4min;
[0024] b:94°C 變性 30s，
[0025] c:55°C退火 30s，
[0026] d :72°C延伸 30s，b-d 循環 35 個反應；
[0027] e :72°C 延伸 10min。
[0028] 上述引物組（其核苷酸序列為SEQ ID NO. 1-6)在檢測蚜蟲樣品共生菌感染情況 中的應用。
[0029] 本發明的積極有益效果：
[0030] (1)本發明建立了一種具有高靈敏度，能快速鑒定蚜蟲樣品中三種常見共生菌感 染情況的多重PCR檢測方法，檢測結果和單對引物擴增結果一致，證明本發明方法的可行 性。
[0031] (2)本發明所建立的檢測方法能夠在一個PCR反應中同時鑒定蚜蟲樣品中三種蚜 蟲共生菌的感染情況，大大降低了工作量，提升了工作效率，節省了一定程度的檢測費用。
[0032] (3)本發明具有快速、準確、靈敏度高的特點，可以為以蚜蟲和共生菌為模式開展 的蚜蟲種群遺傳結構分析、真核和原核生物互作，以及利用共生菌為生物工程菌對蚜蟲進 行遺傳改造等工作中，篩選可靠的實驗材料節省人力物力。
【附圖說明】
[0033]圖1為本發明實施例3中引物濃度梯度篩選和擴增靈敏度分析的瓊