專利名稱：生態環境勘察中的微生物采集方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物采集方法，具體涉及一種生態環境勘察中的微生物采集方法。
背景技術：
叢枝菌根真菌(AMF)是一種普遍存在的內共生真菌，它能夠與80%以上的陸生植物形成共生體。叢枝菌根真菌在維 持植物根際生態系統的穩定、促進植物的生長、提高宿主植物的抗逆性和提高退化土壤質量方面起著至關重要的作用。叢枝菌根真菌由菌根孢子(果)、叢枝體、泡囊、菌絲組成，它們都可以作為繁殖體。目前，菌根的分離純化主要采用孢子作為供體，土壤中小孢子果、孢子和土生輔助細胞通常利用濕篩法采集。利用單一孢子作為菌源有諸多不利因素，首先，孢子侵染速度中等，菌種繁殖體數量積累較慢；其次，濕篩過程中孢子量少的土壤中由于土粒和有機顆粒的干擾，不容易分離孢子；同時濕篩過程中體積較大或較小的顆粒可能丟失。雖然利用孢子作為繁殖體可得到純種，但是由單一菌源生產的菌劑在自然界中作用很難實現最大化，野外環境的改變、菌種之間的拮抗性和宿主植物對菌種的選擇性等都會對單一菌源造成影響，由此生產的菌劑野外難以推廣應用。叢枝菌根真菌是專性活體營養寄生菌，只有在活體植物根上形成菌根后才能繁殖成孢子和孢子果，實驗室內很難復制菌根和宿主植物之間根際微環境，加之菌根繁殖體在土壤中的數量、存活時間、活性大小、侵染速率等方面差異性大，室內難以篩選出適合野外生長菌根菌群。因此，在隨著菌根在礦區生態重建、土壤修復以及農業生物肥力等方面越來越廣的應用情況下，野外原位采集叢枝菌根菌群和利用復合菌群生產菌劑就變的至關重要。

發明內容
針對現有技術中叢枝菌根真菌采集方法的不足，本發明提供一種生態環境勘察中的微生物采集方法。本發明提供一種生態環境勘察中的微生物采集方法，所述微生物為叢枝菌根真菌，所述采集方法包括以下步驟(I)制作采集菌袋選取孔徑為30 μ m的布作為菌袋材料；用該菌袋材料制成菌袋；所述菌袋的一端設有開口 ；(2)制備供試基質供試基質為目標采集區的土壤，將所述土壤過孔徑為1_的篩子，然后將過篩后的土壤滅菌并干燥備用；(3)將步驟(2)中得到的供試基質裝入步驟(I)中制作的菌袋中，填裝完畢后，將所述菌袋的開口封閉；(4)將步驟(3)中得到的裝有供試基質的菌袋緊靠宿主植物根部放置，放置完成
后，覆蓋土壤。優選地，所述微生物采集方法具體包括以下步驟(I)制作采集菌袋選取孔徑為30 μ m的尼龍布作為菌袋材料；用該菌袋材料制成菌袋；所述菌袋的長度為5 15cm、寬度為4 12cm、厚度為2 5cm ;菌袋的一端設有開Π ；(2)制備供試基質供試基質為目標采集區的土壤，將所述土壤過孔徑為1_的篩子，然后將過篩后的土壤滅菌并干燥備用；(3)將步驟(2)中得到的供試基質裝入步驟(I)中制作的菌袋中，每個菌袋的填裝量為50 150g，填裝完畢后，將所述菌袋的開口封閉；(4)將步驟(3)中得到的裝有供試基質的菌袋緊靠宿主植物根部放置，所述菌袋的放置方式為垂直放置，放置完成后，覆蓋土壤。步驟(4)中，裝有供試基質的菌袋緊靠宿主植物根部放置包括將貼近所述宿主植物根部的土壤挖去，然后將所述裝有供試基質的菌袋緊靠宿主植物根部放置。步驟(I)中，所述菌袋具有防腐功能，即在宿主植物的一個生長季中，該菌袋在土壤中不會腐爛。 優選地，步驟(I)中，所述菌袋的長度為10cm、寬度為8cm、厚度為3cm ;且步驟(3)中，每個菌袋的填裝量為I00g。優選地，步驟⑴中，所述菌袋的一端具有牽引繩。采集時，所述牽引繩系在宿主植物的莖干部，便于回收所述菌袋。本領域技術人員可以理解，為了方便，所述牽引繩優選設置在所述菌袋具有開口
的一端。進一步地，為了使得所述菌袋能夠垂直放置，所述牽引繩更優選設置在開口的一端的中部。步驟(2)中，所述滅菌可以采用本領域技術人員已知的任何方式進行；優選地，所述滅菌采用高溫高壓蒸汽滅菌。步驟(3)中，所述開口的封閉可以采用本領域技術人員已知的任何方式進行，例如采用縫合的方式將開口封閉。本發明提供的生態環境勘察中的微生物采集方法，進一步包括以下步驟在所述宿主植物一個生長季后，除去所述菌袋上部的土壤，取出所述菌袋，然后對所述菌袋內的包括孢子密度、菌絲密度、菌絲長度的指標進行測定。這些測定方法可以采用本領域技術人員已知的任何方法進行，例如孢子密度采用濕篩傾注法、菌絲密度采用網格交叉法。本發明的生態環境勘察中的微生物采集方法，利用孔徑為30μπι的尼龍布制作菌袋采集菌絲體和孢子。菌絲體直徑為3 7μ ，這樣菌絲體可自由進入菌袋，而宿主植物根系等很難進入，此種情況下，宿主植物局部根系為獲得養分，就迫使其共生體菌根及其附屬物進入菌袋。菌袋中的供試基質經過過篩和滅菌，一定程度改善了供試基質的質地，同時排除了其它微生物的干擾，更有利于菌根及其附屬物的生長。現有技術中，叢枝菌根分離每樣需采集土樣I. 5 2kg，然后在從這些土樣中分離孢子，這樣工作量往往較大。利用本發明的生態環境勘察中的微生物采集方法采集叢枝菌根很大程度解決了野外叢枝菌根采集的難題，菌袋內的供試基質只有約100g，同時人為地改變了菌袋內供試基質的理化性狀及其質地，更有利于孢子和菌絲體的富集，這樣很大程度上縮小了篩選范圍并減少了工作量。利用本發明的生態環境勘察中的微生物采集方法，其中所述菌袋可以富集孢子和菌絲體，并將其作為菌劑生產的菌源，這就為野外生產叢枝菌根菌劑提供技術支持，也為菌劑在不同區域內推廣應用提供理論基礎。
具體實施例方式下面的實施例僅用于解釋本發明，而非限制本發明。尼龍布購自北京市崇文振興金屬絲網商店，孔徑為30μπι。孢子密度采用濕篩傾注法進行測定；菌絲密度采用網格交叉法進行測定。實施例I :(陜西榆林活雞兔礦塌陷區叢枝菌根真菌的原位采集)選取孔徑為30 μ m的尼龍布作為菌袋材料。該菌袋具有防腐功能，在宿主植物的一個生長季中，該菌袋在土壤中不會腐爛。菌袋的長度為10cm、寬度為8cm，菌袋的厚度為3cm;菌袋的一端設有開口 ；開口端的中部設有牽引繩。
供試基質采集地點位于陜西榆林神木縣大柳塔鎮高家畔，屬于神東礦區活雞兔礦采空塌陷區，供試基質為該塌陷區的退化土壤，并過孔徑為1_的篩子，過篩后的土壤在裝入上述菌袋前經高溫高壓蒸汽滅菌(12rc，2h)，自然風干。 將上述供試基質裝入上述菌袋中，每個菌袋裝入供試基質100g，填裝完畢后，將所述菌袋的開口縫合。宿主植物為紫穗槐，紫穗槐選自活雞兔礦塌陷區微生物復墾示范基地。供試紫穗槐的平均株高為43. 3cm，冠幅為26cm。試驗于2011年4月17日進行，此時神東礦區的土壤已融凍，宿主植物處于返青季節。試驗設計20個重復，即選擇20株紫穗槐作為宿主植物，按照S型曲線選取紫穗槐，所選擇的20株紫穗槐大小相近。將貼近紫穗槐根部的土壤挖去，然后將上述裝有供試基質的菌袋緊靠紫穗槐根部垂直放置，放置深度為15cm，放置完成后覆蓋土壤，并將菌袋的牽引繩系在紫穗槐的莖干部，以便回收菌袋。10月初取回所述菌袋并采集宿主植物根際土壤。10月正是研究區冰凍季節，該區的植物已停止生長，本試驗是宿主植物的一個生長季。對采集的根際土壤和回收的菌袋內供試基質進行測定。宿主植物根際土壤中孢子密度、菌絲密度和IOOg土壤菌絲長度分別為15個/g、3. 19m g—1和319m。對回收的菌袋內的孢子密度、菌絲密度和菌絲長度進行測定，菌袋內的孢子密度高達33個/g、菌絲密度為6. 04m · g'菌袋內總菌絲長度為604m。所述菌袋內的孢子密度和菌絲密度要比紫穗槐根際土壤分別高出18個/g和2. 85m · g'說明本發明的微生物采集方法可以大大提高野外叢枝菌根真菌的采集量和采集速度。實施例2 (神東礦區補連塔礦塌陷區叢枝菌根真菌的原位采集)選取孔徑為30 μ m的尼龍布作為菌袋材料。該菌袋具有防腐功能，在宿主植物的一個生長季中，該菌袋在土壤中不會腐爛。菌袋的長度為10cm、寬度為8cm，菌袋的厚度為3cm;菌袋的一端設有開口 ；開口端的中部設有牽引繩。試驗地選在神東礦區補連塔礦，供試基質為該礦塌陷區退化土壤，并過孔徑為1_的篩子，過篩后的土壤經高溫高壓蒸汽滅菌(121°C，2h)，自然風干。將上述供試基質裝入上述菌袋中，每個菌袋裝入供試基質100g，填裝完畢后，將所述菌袋的開口縫合。宿主植物為沙柳。沙柳的平均株高為136. 5cm，冠幅為96. 2cm。
試驗于2011年4月18日進行，此時神東礦區的土壤已融凍，宿主植物處于返青季節。試驗設計20個重復，即選擇20株沙柳作為宿主植物，按照S型曲線選取紫穗槐，所選擇的20株紫穗槐大小相近。將貼近沙柳根部的土壤挖去，然后將上述裝有供試基質的菌袋緊靠沙柳根部垂直放置，放置深度為15cm，放置完成后覆蓋土壤，并將菌袋的牽引繩系在沙柳的莖干部，以便回收菌袋。10月初取回所述菌袋并采集宿主植物根際土壤，對回收的菌袋內的供試基質和沙柳根際土壤中孢子密度、菌絲密度和IOOg土壤中菌絲長度進行測定。結果，菌袋內的孢子密度、菌絲密度和菌絲長度分別達到21個/g、4. 74m -g^1和4. 74m,而根際土壤中孢子密度、菌絲密度和菌絲長度分別為11個/g、l. 91m · g—1和I. 91m。所 述菌袋內的孢子密度和菌絲密度要比沙柳根際土壤高出10個/g和2. 83m · g'說明本發明的微生物采集方法可以顯著提高野外叢枝菌根真菌的采集率，縮短叢枝菌根真菌的采集時間。實施例3 (寧夏煤矸石山復墾區叢枝菌根真菌的原位采集)選取孔徑為30 μ m的尼龍布作為菌袋材料。該菌袋具有防腐功能，在宿主植物的一個生長季中，該菌袋在土壤中不會腐爛。菌袋的長度為10cm、寬度為8cm，菌袋的厚度為3cm;菌袋的一端設有開口 ；開口端的中部設有牽引繩。試驗地點在寧夏大武口洗煤廠煤矸石山，該地位于寧夏回族自治區石嘴山市，屬于中溫帶干旱氣候區，降水稀少而集中，光照充足，蒸發強烈，空氣干燥，極不利于植物的生長。本試驗地點選擇煤矸石山上，煤矸石山上鋪了 O. 8 Im厚的河沙作為生長基質，試驗區為中國礦業大學(北京)礦區微生物復墾示范基地。供試基質為矸石山上廢棄砂質，并過孔徑為Imm的篩子，過篩后經高溫高壓蒸汽滅菌(12rC，2h)，自然風干。將上述供試基質裝入上述菌袋中，每個菌袋裝入供試基質100g，填裝完畢后，將所述菌袋的開口縫合。宿主植物是當地先鋒植株白蠟，白蠟的平均株高為217cm，冠幅為151cm。試驗于2011年4月25日進行，此時寧夏地區的土壤已融凍，宿主植物處于返青季節。試驗設計20個重復，即選擇20株白蠟作為宿主植物，按照S型曲線選取白蠟，所選擇的20株白蠟大小相近。將貼近白蠟根部的土壤挖去，然后將上述裝有供試基質的菌袋緊靠白蠟根部垂直放置，放置深度為15cm，放置完成后覆蓋土壤，并將菌袋的牽引繩系在白蠟的莖干部，以便回收菌袋。10月初取回菌袋并采集宿主植物根際土壤，對回收菌袋內的供試基質和白蠟根際土壤孢子密度、菌絲密度和IOOg土壤中菌絲長度進行測定。結果，菌袋內孢子密度、菌絲密度和菌絲長度分別為28個/g、5. 66m · g—1和566m，而白蠟根際土壤中孢子密度、菌絲密度和菌絲長度分別為13個/g、2. 81m · g—1和281m。所述菌袋內的孢子密度和菌絲密度要比白蠟根際土壤高出15個/g和2. 85m · g'說明本發明的微生物采集方法可以顯著提高野外叢枝菌根真菌的采集率，縮短叢枝菌根真菌的采集時間。本領域技術人員可以理解，在本說明書的教導之下，可以對本發明做出一些修改或變化。這些修改和變化也應當在本發明權利要求所限定的范圍之內。
權利要求
1.一種生態環境勘察中的微生物采集方法，所述微生物為叢枝菌根真菌，所述采集方法包括以下步驟 (1)制作采集菌袋選取孔徑為30u m的布作為菌袋材料；用該菌袋材料制成菌袋；所述菌袋的一端設有開口； (2)制備供試基質供試基質為目標采集區的土壤，將所述土壤過孔徑為Imm的篩子，然后將過篩后的土壤滅菌并干燥備用； (3)將步驟(2)中得到的供試基質裝入步驟(I)中制作的菌袋中，填裝完畢后，將所述菌袋的開口封閉； (4)將步驟(3)中得到的裝有供試基質的菌袋緊靠宿主植物根部放置，放置完成后，覆蓋土壤。
2.根據權利要求I所述的微生物采集方法，其特征在于，所述采集方法具體包括以下步驟 (1)制作采集菌袋選取孔徑為30的尼龍布作為菌袋材料；用該菌袋材料制成菌袋；所述菌袋的長度為5 15cm、寬度為4 12cm、厚度為2 5cm ;菌袋的一端設有開口 ； (2)制備供試基質供試基質為目標采集區的土壤，將所述土壤過孔徑為1_的篩子，然后將過篩后的土壤滅菌并干燥備用； (3)將步驟⑵中得到的供試基質裝入步驟⑴中制作的菌袋中，每個菌袋的填裝量為50 150g，填裝完畢后，將所述菌袋的開口封閉； (4)將步驟(3)中得到的裝有供試基質的菌袋緊靠宿主植物根部放置，所述菌袋的放置方式為垂直放置，放置完成后，覆蓋土壤。
3.根據權利要求2所述的微生物采集方法，其特征在于，步驟(4)中，裝有供試基質的菌袋緊靠宿主植物根部放置包括將貼近所述宿主植物根部的土壤挖去，然后將所述裝有供試基質的菌袋緊靠宿主植物根部放置。
4.根據權利要求3所述的微生物采集方法，其特征在于，步驟(I)中，所述菌袋的長度為10cm、寬度為8cm、厚度為3cm ;且步驟(3)中，每個菌袋的填裝量為100g。
5.根據權利要求4所述的微生物采集方法，其特征在于，步驟(I)中，所述菌袋的一端具有牽引繩。
6.根據權利要求5所述的微生物采集方法，其特征在于，所述牽引繩設置在所述菌袋具有開口的一端，并設置在所述具有開口的一端的中部。
7.根據權利要求6所述的微生物采集方法，其特征在于，步驟(2)中，所述滅菌是采用高溫高壓蒸汽滅菌。
8.根據權利要求I 7任一項所述的微生物采集方法，其特征在于，所述微生物采集方法進一步包括以下步驟 在所述宿主植物一個生長季后，除去所述菌袋上部的土壤，取出所述菌袋，然后對所述菌袋內的包括孢子密度、菌絲密度、菌絲長度的指標進行測定。
全文摘要
本發明涉及一種生態環境勘察中的微生物采集方法。所述微生物采集方法中的微生物為叢枝菌根真菌，所述采集方法包括步驟制作采集菌袋、制備供試基質、將所述供試基質裝入所述菌袋并封閉以及投放所述菌袋。利用本發明的生態環境勘察中的微生物采集方法，其中所述菌袋可以富集孢子和菌絲體，在很大程度上縮小了篩選范圍并減少了工作量。
文檔編號C12N1/14GK102757901SQ20121013510
公開日2012年10月31日 申請日期2012年4月28日 優先權日2012年4月28日
發明者張凱, 畢銀麗 申請人:中國礦業大學(北京), 中國神華能源股份有限公司