專利名稱：基于量子點熒光原位雜交的海綿細胞內共生細菌的檢測方法
技術領域：
本發明涉及的是一種細菌檢測技術領域的方法，具體是一種基于量子點熒光原位 雜交的海綿細胞內共生細菌的檢測方法。
背景技術：
作為最古老的后生動物，海綿具有獨特的腔狀結構，以濾食海水中的微生物為生， 體內聚集了大量的共生微生物，一般可以達到海綿體積40%以上。許多證據表明，海綿來源 的藥用天然產物可能是其共生微生物產生的，海綿共生微生物也因此成為了海洋藥物研發 的重點之一。對這些微生物的多樣性進行分析，鑒定出具有宿主特異性的微生物是開發利 用海綿共附生微生物資源的前提。熒光原位雜交技術是一種不依賴于培養和DNA提取的方 法在一定條件下，使熒光染料標記的寡核苷酸探針與靶標DNA的結合，通過熒光顯微鏡觀 察拍照，其結果可以直接展示微生物在原位條件下的分布、種類和相對豐度。熒光原位雜交 技術在海綿共生微生物的研究當中有成功應用的案例，但很多時候，海綿強烈、廣譜的自發 熒光會干擾、甚至掩蓋探針的信號，使檢測失敗。因此，迫切需要開發一種新的方法可以繞 過海綿自發熒光的障礙，使得熒光原位雜交技術能夠應用廣泛應用于海綿共生微生物的研 允。量子點技術是近幾年來新興的熒光標記技術。其本身是一種納米級的半導體 顆粒，可被激發出穩定、強烈的熒光。且熒光的顏色隨著其自身半徑的不同也不同，在 腫瘤檢測等方面已經有了成功的應用。經過對現有技術的檢索發現，中國專利申請號 200510020089. 9，記載了一種“穩定標記肝癌細胞的方法”，該技術與傳統的熒光染料相比， 量子點的熒光譜更加豐富，不易粹滅。但是該現有技術的檢測往往依賴抗原抗體反應，對于 成分復雜、抗原性低、檢測對象含量低的環境樣品(海洋生物、地質樣品)來說，抗原抗體 反應難以達到要求。因此，需要選擇新的檢測方法。目前應用較多的DNA分子雜交技術是 較為理想的標記環境樣品的方法，用熒光標記的寡核苷酸探針在一定條件下與目標DNA結 合，實現復雜環境樣品中微量DNA的檢測。因此，如果能用量子點標記寡核苷酸探針進行檢 測，則可以利用其豐富的激發光譜和極高的靈敏度實現海綿細胞內共生細菌的檢測。

發明內容
本發明針對現有技術存在的上述不足，提供一種基于量子點熒光原位雜交的海綿 細胞內共生細菌的檢測方法，將機械法與化學法相結合，可以快速獲取海綿細胞，量子點發 光技術可以避免海綿細胞自發熒光的干擾，成功探測到海綿細胞內的細菌。本發明是通過以下技術方案實現的，獲取海綿單細胞，按照經典的熒光原位雜交 方法，采用生物素標記的寡核苷酸探針與海綿單細胞內的微生物基因組DNA進行雜交，最 后采用鏈親和素標記的量子點進行孵育處理，得到在激發光為紫外區的熒光顯微鏡下呈現 藍色的海綿細胞以及呈現紅色的細菌。
所述的獲取海綿單細胞是指1)將海綿組織解離于無鈣鎂人工海水中得到海綿細胞粗懸液；2)收集海綿細胞粗懸液中的沉淀經離心處理后得到海綿細胞，經固定脫水處理得 到海綿單細胞。所述的海綿組織是指體積不超過0. 5cm3的海綿組織；所述的無鈣鎂人工海水與海綿組織的體積比為1 15-20，IlOrpm ；所述的無鈣鎂人工海水的組分及含量為31. 6g/L NaCl、0. 75g/L KClU.0g/L Na2SO4,2. 4g/LTris/HCl、0. 02g/L NaHCO3,7. 2g/L EDTA，余量為去離子水，該無鈣鎂人工海 水的PH為7.6 ；所述的解離是指將海綿組織在20°C以下環境振蕩、洗滌40min-60min后于200 目的不銹鋼細胞篩網上摩擦進行機械解離，同時用20-25倍于海綿體積的無鈣鎂人工海水 沖洗，沖洗液轉入錐形瓶中IlOrpm ；所述的離心處理是指對海綿細胞粗懸液中的沉淀采用300g離心處理5min后用 無鈣鎂人工海水洗滌三次，再次以300g離心處理5min獲得包含海綿細胞內內共生微生物 的海綿細胞；所述的固定脫水處理是指對海綿細胞采用20倍體積，4%濃度的多聚甲醛溶液 進行固定，然后制備細胞涂片并分別置于75%、85%、100%的乙醇中脫水風干。所述的生物素標記的寡核苷酸探針是指細菌通用寡核苷酸探針 EUB338-5' GCTGCCTCCCGTAGGAGT 3' -Biotin 儲液所述的雜交是指采用生物素標記的寡核苷酸探針與雜交緩沖液混合后滴加于固 定脫水處理后的海綿單細胞上，在43°C環境下雜交4-5h，經洗滌預熱后在48°C環境下進行 第一次孵育20min，再經二次預熱后滴加量子點雜交緩沖液，并在37°C環境下進行第二次 孵育20min。所述的寡核苷酸探針與雜交緩沖液的用量比例為體積比1 20;所述的雜交緩沖液的組分及含量為NaCl 900mM、Tris/HCl 20mM、SDS 0. 01% wt, 甲酰胺31 % wt，該雜交緩沖液的pH為7. 4。所述的洗滌是指雜交完成后，傾去殘留的探針雜交液，滴加預熱至48°C的雜交 后洗液；所述的雜交后洗液的組分及含量為NaCl IlOmM, Tris/HCl 20mM、EDTA 5mM、 0.01% WtSDS，該雜交后洗液的PH為7. 4。所述的二次預熱是指用37°C的TBS緩沖液洗滌兩次，每次5min ；所述的TBS緩沖液的組分及含量為NaCl 0.8%,KCl 0. 02%,Tris/HCl 0.3%，該 TBS緩沖液的pH為7.4。所述的孵育處理是指在37°C以下孵育30min，孵育完畢后用TBS溶液洗滌四次；所述的用TBS溶液洗滌四次是指用含有0. 05%吐溫-20的TBS溶液在37°C環境 下洗滌四次，每次5min。按照本發明方法可以快速獲取海綿細胞，避免海綿細胞自發熒光的干擾，成功探 測到海綿細胞內的細菌，為海綿共生微生物多樣性與功能的研究提供了新的視角。


圖1為實施例中Holoxea sp.海綿細胞內共生細菌的檢測結果。
具體實施例方式下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施 例。實施例1本實施例具體實施步驟如下1、海綿細胞分離(1)以下操作都在無菌條件下進行。海綿組織(l_2g)于4°C解凍后切成不大于 0.5cm3 的小塊。加入盛有 15-20 倍體積人工海水(1. Ig CaCl2,10. 2g MgCl2 · 6H20，31. 6g NaCl，0. 75gKCl，1. Og Na2SO4, 2. 4g Tris/HCl，0. 02g NaHCO3, IL 去離子水，pH 7.6)的錐形 瓶中，110rpm，20°C溫和振蕩 40min_60min。(2)將上一步中洗滌后的海綿小塊于200目的不銹鋼細胞篩網上輕輕摩擦進行機 械解離，讓海綿小塊變成蓉狀，同時用20-25倍體積無鈣鎂人工海水(31. 6g NaCl,0. 75g KCl, 1. OgNa2SO4, 2. 4g Tris/HCl, 0. 02g NaHCO3, 7. 2g EDTA，IL 去離子水，pH 7.6)沖洗，轉 入錐形瓶中110rpm，20°C振蕩、解離40min-60min，得到海綿細胞的粗懸液。粗懸液經300g， 5min離心后分別收集沉淀和上清，并用無鈣鎂人工海水洗滌沉淀(重懸一300g, 5min —收 集沉淀和上清)三次。操作時注意輕緩，避免對海綿細胞產生損傷。300g離心獲得的沉淀 為海綿細胞，其中包含海綿細胞內內共生微生物。2、海綿細胞固定、脫水對獲得的海綿細胞取10-20 μ L涂片，風干后采用卡諾氏 固定液(60%乙醇、30%氯仿、10%冰醋酸混合而成)進行室溫固定30分鐘。風干后分別在 75%、85%、100%的乙醇中各浸泡3分鐘，風干。待雜交用。3、寡核苷酸探針雜交將生物素標記的細菌通用寡核苷酸探針 EUB338 (5 ‘ GCTGCCTCCCGTAGGAGT 3 ‘ -Biotin)用雙蒸水配成 50ng/ μ L 的儲液，取 5 μ L 與 100 μ L 雜交緩沖液(NaCl 900mM, Tris/HCl 20mM, SDS 0. 01 %，甲酰胺 31 %，pH 7. 4)混合， 滴加于涂片區域。置于濕盒中，將雜交爐溫度設為43°C，雜交4-5h。雜交完成后，傾去殘留 的探針雜交液，滴加100 μ L預熱至48°C的雜交后洗液(NaCl IlOmM, Tris/HCl 20mM, EDTA 5mM,0.01% SDS, pH 7. 4)，48°C孵育20min。洗滌完畢后傾去雜交后洗液。用預熱至37°C 的 TBS 緩沖液(NaCl 0. 8%, KCl 0. 02%, Tris/HCl 0. 3%, pH 7. 4)洗滌 5min，重復一次。 滴加量子點雜交緩沖液100 μ L，37°C孵育20min。4、量子點標記用量子點雜交緩沖液將量子點-鏈親和素復合物稀釋100倍，取 ^^口！^商加于雜交區域力了！孵育〗。!^!!。孵育完畢，傾去殘留的量子點雜交液，用含有 0. 05%吐溫-20的TBS溶液37°C洗滌5min，重復一次。再用預熱至37°C的TBS溶液洗滌 5min，重復一次。風干后加蓋蓋玻片。所述的量子點雜交緩沖液由武漢珈源量子點技術開發有限公司的量子點熒光原 位雜交試劑盒提供(產品號Κ-5002-1)。所述的鏈親和素標記的量子點是指量子點雜交緩沖液將量子點_鏈親和素復合
5物稀釋100倍，其中量子點-鏈親和素復合物由武漢珈源量子點技術開發有限公司的量子 點熒光原位雜交試劑盒提供(產品號Κ-5002-1)。5、熒光顯微鏡觀察結果如圖1所示，激發光波長選擇紫外區，海綿細胞顯示藍 色，量子點雜交信號(紅色)顯示細菌雜交信號的存在。細菌含量較高時紅色熒光會覆蓋 海綿細胞的藍色熒光。實施例2本實施例具體實施步驟如下1、海綿細胞分離(1)以下操作都在無菌條件下進行。海綿組織(l_2g)于4°C解凍后切成不大于 0.5cm3 的小塊。加入盛有 15-20 倍體積人工海水(1. Ig CaCl2,10. 2g MgCl2 · 6H20，31. 6g NaCl，0. 75gKCl，1. Og Na2SO4, 2. 4g Tris/HCl，0. 02g NaHCO3, IL 去離子水，pH 7.6)的錐形 瓶中，110rpm，20°C溫和振蕩 40min_60min。(2)將上一步中洗滌后的海綿小塊于200目的不銹鋼細胞篩網上輕輕摩擦進行機 械解離，讓海綿小塊變成蓉狀，同時用20-25倍體積無鈣鎂人工海水(31. 6g NaCl,0. 75g KCl, 1. OgNa2SO4, 2. 4g Tris/HCl, 0. 02g NaHCO3, 7. 2g EDTA，IL 去離子水，pH 7.6)沖洗，轉 入錐形瓶中110rpm，20°C振蕩、解離40min-60min，得到海綿細胞的粗懸液。粗懸液經300g， 5min離心后分別收集沉淀和上清，并用無鈣鎂人工海水洗滌沉淀(重懸一300g, 5min —收 集沉淀和上清)三次。操作時注意輕緩，避免對海綿細胞產生損傷。300g離心獲得的沉淀 為海綿細胞，其中包含海綿細胞內內共生微生物。2、海綿細胞固定、脫水對獲得的海綿細胞采用20倍體積，4%的多聚甲醛溶液懸 浮，4°C浸泡過夜。固定完成的細胞取10-20 μ L涂片，風干后分別在75%、85%、100%的乙 醇中各浸泡3分鐘，風干。待雜交用。3、寡核苷酸探針雜交將生物素標記的細菌通用寡核苷酸探針 EUB338 (5 ‘ GCTGCCTCCCGTAGGAGT 3 ‘ -Biotin)用雙蒸水配成 50ng/ μ L 的儲液，取 5 μ L 與 100 μ L 雜交緩沖液(NaCl 900mM, Tris/HCl 20mM, SDS 0. 01 %，甲酰胺 31 %，pH 7. 4)混合， 滴加于涂片區域。置于濕盒中，將雜交爐溫度設為43°C，雜交4-5h。雜交完成后，傾去殘留 的探針雜交液，滴加100 μ L預熱至48°C的雜交后洗液(NaCl IlOmM, Tris/HCl 20mM, EDTA 5mM,0.01% SDS, pH 7. 4)，48°C孵育20min。洗滌完畢后傾去雜交后洗液。用預熱至37°C 的 TBS 緩沖液(NaCl 0. 8%, KCl 0. 02%, Tris/HCl 0. 3%, pH 7. 4)洗滌 5min，重復一次。 滴加量子點雜交緩沖液100 μ L，37°C孵育20min。4、量子點標記用量子點雜交緩沖液將量子點-鏈親和素復合物稀釋100倍，取 ^^口！^商加于雜交區域力了！孵育〗。!^!!。孵育完畢，傾去殘留的量子點雜交液，用含有 0. 05%吐溫-20的TBS溶液37°C洗滌5min，重復一次。再用預熱至37°C的TBS溶液洗滌 5min，重復一次。風干后加蓋蓋玻片。所述的量子點雜交緩沖液由武漢珈源量子點技術開發有限公司的量子點熒光原 位雜交試劑盒提供(產品號Κ-5002-1)。所述的鏈親和素標記的量子點是指量子點雜交緩沖液將量子點_鏈親和素復合 物稀釋100倍，其中量子點-鏈親和素復合物由武漢珈源量子點技術開發有限公司的量子 點熒光原位雜交試劑盒提供(產品號Κ-5002-1)。
5、熒光顯微鏡觀察結果檢測結果為陰性。可能的原因是多聚甲醛作為交聯型的 固定劑使得微生物細胞壁變得更加緊實，無法讓探針透過。與成功的實施例1相比，卡諾氏 固定液更適合于以微生物檢測為目的細胞固定。在接下來的實施例3中，將討論雜交溫度 對量子點熒光原位雜交實驗的影響。實施例3本實施例具體實施步驟如下1、海綿細胞分離(1)以下操作都在無菌條件下進行。海綿組織(l_2g)于4°C解凍后切成不大于 0.5cm3 的小塊。加入盛有 15-20 倍體積人工海水(1. Ig CaCl2,10. 2g MgCl2 · 6H20，31. 6g NaCl，0. 75gKCl，1. Og Na2SO4, 2. 4g Tris/HCl，0. 02g NaHCO3, IL 去離子水，pH 7.6)的錐形 瓶中，110rpm，20°C溫和振蕩 40min_60min。(2)將上一步中洗滌后的海綿小塊于200目的不銹鋼細胞篩網上輕輕摩擦進行機 械解離，讓海綿小塊變成蓉狀，同時用20-25倍體積無鈣鎂人工海水(31. 6g NaCl,0. 75g KCl, 1. OgNa2SO4, 2. 4g Tris/HCl, 0. 02g NaHCO3, 7. 2g EDTA，IL 去離子水，pH 7.6)沖洗，轉 入錐形瓶中110rpm，20°C振蕩、解離40min-60min，得到海綿細胞的粗懸液。粗懸液經300g， 5min離心后分別收集沉淀和上清，并用無鈣鎂人工海水洗滌沉淀(重懸一300g, 5min —收 集沉淀和上清)三次。操作時注意輕緩，避免對海綿細胞產生損傷。300g離心獲得的沉淀 為海綿細胞，其中包含海綿細胞內內共生微生物。2、海綿細胞固定、脫水對獲得的海綿細胞取10-20 μ L涂片，風干后采用卡諾氏 固定液(60%乙醇、30%氯仿、10%冰醋酸混合而成)進行室溫固定30分鐘。風干后分別在 75%、85%、100%的乙醇中各浸泡3分鐘，風干。待雜交用。3、寡核苷酸探針雜交將生物素標記的細菌通用寡核苷酸探針 EUB338 (5 ‘ GCTGCCTCCCGTAGGAGT 3 ‘ -Biotin)用雙蒸水配成 50ng/ μ L 的儲液，取 5 μ L 與 100 μ L 雜交緩沖液(NaCl 900mM, Tris/HCl 20mM, SDS 0. 01 %，甲酰胺 31 %，pH 7. 4)混合， 滴加于涂片區域。置于濕盒中，將雜交爐溫度設為46°C，雜交4-5h。雜交完成后，傾去殘留 的探針雜交液，滴加100 μ L預熱至48°C的雜交后洗液(NaCl IlOmM, Tris/HCl 20mM, EDTA 5mM,0.01% SDS, pH 7. 4)，48°C孵育20min。洗滌完畢后傾去雜交后洗液。用預熱至37°C 的 TBS 緩沖液(NaCl 0. 8%, KCl 0. 02%, Tris/HCl 0. 3%, pH 7. 4)洗滌 5min，重復一次。 滴加量子點雜交緩沖液100 μ L，37°C孵育20min。4、量子點標記用量子點雜交緩沖液將量子點-鏈親和素復合物稀釋100倍，取 ^^口！^商加于雜交區域力了！孵育〗。!^!!。孵育完畢，傾去殘留的量子點雜交液，用含有 0. 05%吐溫-20的TBS溶液37°C洗滌5min，重復一次。再用預熱至37°C的TBS溶液洗滌 5min，重復一次。風干后加蓋蓋玻片。所述的量子點雜交緩沖液由武漢珈源量子點技術開發有限公司的量子點熒光原 位雜交試劑盒提供(產品號Κ-5002-1)。所述的鏈親和素標記的量子點是指量子點雜交緩沖液將量子點_鏈親和素復合 物稀釋100倍，其中量子點-鏈親和素復合物由武漢珈源量子點技術開發有限公司的量子 點熒光原位雜交試劑盒提供(產品號Κ-5002-1)。5、熒光顯微鏡觀察結果檢測結果為陰性。為了提高探針檢測的特異性，在本實施例中，雜交溫度提高到46°C，但并未得到陽性結果。分析原因，可能是之前文獻報道的46°C 這一高特異性溫度只適合純培養微生物檢測，對于環境樣品并不適合，畢竟，較高的雜交溫 度是以犧牲靈敏度為代價來提高特異性的。 綜合三個實施例，更加確定了海綿細胞的固定劑是卡諾氏固定液，雜交溫度應控 制在43 0C ο
權利要求
一種基于量子點熒光原位雜交的海綿細胞內共生細菌的檢測方法，其特征在于，通過獲取海綿單細胞，按照經典的熒光原位雜交方法，采用生物素標記的寡核苷酸探針對海綿單細胞內的微生物基因組DNA進行雜交，最后采用鏈親和素標記的量子點進行孵育處理，得到在激發光為紫外區的熒光顯微鏡下呈現藍色的海綿細胞以及呈現紅色的細菌。
2.根據權利要求1所述的基于量子點熒光原位雜交的海綿細胞內共生細菌的檢測方 法，其特征是，所述的獲取海綿單細胞是指1)將海綿組織解離于無鈣鎂人工海水中得到海綿細胞粗懸液；2)收集海綿細胞粗懸液中的沉淀經離心處理后得到海綿細胞，經固定脫水處理得到海 綿單細胞。
3.根據權利要求2所述的基于量子點熒光原位雜交的海綿細胞內共生細菌的檢測方 法，其特征是，所述的無鈣鎂人工海水的組分及含量為31. 6g/L NaCl,0. 75g/L KClU.0g/L Na2SO4,2. 4g/L Tris/HCl、0. 02g/L NaHCO3,7. 2g/L EDTA，余量為去離子水，該無鈣鎂人工海 水的PH為7. 6。
4.根據權利要求1所述的基于量子點熒光原位雜交的海綿細胞內共生細菌的檢測方 法，其特征是，所述的解離是指將海綿組織在20°C以下環境振蕩、洗滌40min-60min后于 200目的不銹鋼細胞篩網上摩擦進行機械解離，同時用20-25倍于海綿體積的無鈣鎂人工 海水沖洗，沖洗液轉入錐形瓶中llOrpm。
5.根據權利要求1所述的基于量子點熒光原位雜交的海綿細胞內共生細菌的檢測方 法，其特征是，所述的離心處理是指對海綿細胞粗懸液中的沉淀采用300g離心處理5min 后用無鈣鎂人工海水洗滌三次，再次以300g離心處理5min獲得包含海綿細胞內內共生微 生物的海綿細胞。
6.根據權利要求1所述的基于量子點熒光原位雜交的海綿細胞內共生細菌的檢測方 法，其特征是，所述的固定脫水處理是指對海綿細胞采用20倍體積，4%濃度的多聚甲醛 溶液進行固定，然后制備細胞涂片并分別置于75%、85%、100%的乙醇中脫水風干。
7.根據權利要求1所述的基于量子點熒光原位雜交的海綿細胞內共生細菌的檢測方 法，其特征是，所述的雜交是指采用生物素標記的寡核苷酸探針與雜交緩沖液混合后滴加 于固定脫水處理后的海綿單細胞上，在43°C環境下雜交4-5h，經洗滌預熱后在48°C環境下 進行第一次孵育20min，再經二次預熱后滴加量子點雜交緩沖液，并在37°C環境下進行第 二次孵育20min。
8.根據權利要求1所述的基于量子點熒光原位雜交的海綿細胞內共生細菌的檢測方 法，其特征是，所述的孵育處理是指在37°C以下孵育30min，孵育完畢后用TBS溶液洗滌四 次。
全文摘要
一種細菌檢測技術領域的基于量子點熒光原位雜交的海綿細胞內共生細菌的檢測方法，通過獲取海綿單細胞，按照經典的熒光原位雜交方法，采用生物素標記的寡核苷酸探針對海綿單細胞內的微生物基因組DNA進行雜交，最后采用鏈親和素標記的量子點進行孵育處理，得到在激發光為紫外區的熒光顯微鏡下呈現藍色的海綿細胞以及呈現紅色的細菌。本發明將機械法與化學法相結合，可以快速獲取海綿細胞，避免海綿細胞自發熒光的干擾，成功探測到海綿細胞內的細菌。
文檔編號C12Q1/04GK101974626SQ20101050305
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月12日 優先權日2010年10月12日
發明者劉放, 張風麗, 李志勇, 楊振亞, 韓敏奇 申請人:上海交通大學