一種利用ssr分子標記篩選小麥近似品種的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種篩選小麥近似品種的方法，屬于農業的小麥育種與應用技術領 域。
【背景技術】
[0002] 小麥屬于禾本科的小麥屬，它是世界上最早栽培的農作物之一。我國于1997年開 始實施植物新品種保護制度。根據中國《植物新品種保護條例》規定，植物新品種必需具備 特異性，一致性和穩定性（簡稱DUS)才能授予品種權。近年來，隨著中國植物育種者品種 權意識的不斷增強，申請保護的植物新品種數量逐年增長。不僅如此，農業部《主要農作物 品種審定辦法》要求，申請審定的小麥品種必須具備特異性，一致性和穩定性。
[0003] 特異性測試是DUS測試的重點和難點。特異性是指申請品種應當明顯區別于申請 日以前所有已知的同屬或同種品種。為鑒定一個小麥品種具備特異性，需要證明該品種不 同于已知的每個小麥品種。已知的小麥品種數以萬計，將每一個申請DUS測試的品種（"申 請品種"）與這些品種進行田間種植比較，實踐上是不可行的。為此，需要通過一些篩選機 制將那些不需要種植即可知道與申請品種明顯不同的品種排除，只種植那些不確定與申請 品種是否有明顯差異的品種，即近似品種。因此，近似品種的選擇又是特異性測試的關鍵環
[0004] 目前，近似品種的篩選主要通過已知品種的地理來源、類型和分組性狀進行。測試 機構首先建立已知品種的表型性狀數據庫，利用品種地理來源、品種類型和分組性狀逐個 排除差異明顯的品種，最后篩選出近似品種。該方法的有以下幾個缺點：⑴小麥已知品種 數量眾多，品種類型和分組性狀少，育成品種相似度高，大量申請品種篩選出幾十甚至上百 個近似品種，降低了試驗精確度，加大了試驗成本；(2)測試機構需要事先知道申請品種的 分組性狀數據，往往申請人不能提供準確的分組性狀數據，導致近似品種篩選錯誤，測試機 構需要另外耗費一個生長周期的時間采集分組性狀數據，消耗大量的時間，勞力和財力。
[0005] 本發明申請人自己的專利201310119954. X公開了一種小麥SSR指紋圖譜構建方 法，該專利的主要目的是利用25對熒光標記引物構建指紋圖譜，然后根據品種間差異位點 數來鑒定是否是相似品種。申請人后續研究中發現采用上述方法鑒定近似品種存在以下問 題有待進一步改進：（1)位點差異法不能精確描述品種間不同類型位點的遺傳差異（例如， 一個雜合位點與純合位點間的位點差異與兩個純合位點間的差異，使用位點差異時是相同 的）；（2)位點差異法的判定為：品種間差異位點數〈3為近似品種；因此位點差異法對分子 數據的準確性要求極高，在實踐中需要大量投入才能達到；（3)同時該專利中采用的分子 標記數偏少，用其進行篩選近似品種準確性差。
【發明內容】
[0006] 本發明克服了上述現有技術的不足，提供了一種利用SSR分子標記篩選小麥近似 品種的方法。該方法在小麥每對染色體上選用2個SSR分子標記，共選用了 42個分子標記， 根據遺傳距離來篩選近似品種，該方法高效、準確。
[0007] 本發明的技術方案是：一種利用SSR分子標記篩選小麥近似品種的方法，其特征 是，
[0008] (1)提取供試品種DNA ;
[0009] (2)用21對基本核心SSR熒光標記引物和21對擴展核心SSR熒光標記引物分別 對供試品種模板DNA進行PCR擴增；
[0010] 所述 21 對基本核心 SSR 熒光標記引物為 Xgwm357-1A、Xbarc61-1B、Xgdmlll-1D、 Xbarc5_2A、Xgwm429_2B、Xcaul5_2D、Xgwml55_3A、Xcau5_3B、Xgwml61_3D、Xgwm610_4A、 Xgwm513-4B、Xcfd84-4D、Xcfa2155-5A、Xbhwl29-5B、Xcfd8-5D、Xgwm570-6A、Xbarcl4-6B、 Xcfd76-6D、Xgpw2269-7A、Xwmc73-7B、Xgwm428-7D，其核苷酸序列依次如序列表 SEQ ID No. 1~42所示；
[0011] 所述 21 對擴展核心 SSR 熒光標記引物為 Xcfa2153-1A、Xbarc81-1B、Xcfd28-1D、 Xgwm445_2A、Xbarc7_2B、Xgwm296_2D、Xgwm2_3A、Xgwm566_3B、Xgwm341_3D、Xcau2_4A、 Xgwm495_4B、Xbarcl05_4D、Xbarcl-5、Xbarc4_5B、Xgdm43_5D、Xgwm617_6A、Xgwm219_6B、 Xcfd33-6D、Xcfa2123-7A、Xgwm344-7B、Xgwm44-7D ;其核苷酸序列依次如序列表 SEQ ID No. 43~84所示。
[0012] (3) PCR產物經電泳檢測采集數據；
[0013] (4)利用PowerMarker對采集的數據進行分析得到品種之間的遺傳距離，遺傳距 離小于0.2的判定為近似品種。
[0014] 上述步驟（1)-(3)的具體步驟同專利201310119954. X。
[0015] 本發明的有益效果是：（1)本發明利用42對分子標記引物對小麥品種進行擴增、 分析得到大量的分子數據，分別計算品種兩兩之間的分子距離。兩者相比較，當遺傳距離 多0. 2時，所有成對品種之間都有明顯差異，最終確定與申請品種的遺傳距離小于0. 2的已 知品種為近似品種，這樣只把遺傳距離小于0. 2的品種在田間種植，減少了大量的時間，勞 力和財力；提高了試驗精確度，降低了試驗成本；（2)與專利201310119954. X采用位點差異 篩選近似品種相比，分子距離法選用的閾值更為寬松，同時不會大量增加近似品種的數量； 因選用的分子距離閾值足夠大，可以允許一定程度的分子數據錯誤的存在，而不影響特異 性測試結果；(3)小麥共有3個基因組21對染色體，為了更好的代表小麥品種間的遺傳變 異，選用的SSR分子標記盡可能的均勻分布到不同的染色體組上，本發明在小麥每對染色 體上選用2個SSR分子標記；分子標記的數量多，分布均勾，對染色體覆蓋更完整，更好的反 映品種間的遺傳變異差異；本發明基于本發明42個分子標記計算出的遺傳距離和品種間 的表型距離相關性更強，更有利于近似品種篩選的準確性，嚴謹性；篩選結果更可靠；篩選 出的近似品種數量更少；進一步降低了特異性測試的成本；提高了實驗的精確度。
【具體實施方式】
[0016] 1、提取供試品種樣品的DNA
[0017] 米用CTAB法提取供試品種（如表1所不的36份申請品種和如表2所不的99份 已知品種）的DNA，提取方法同專利201310119954. X。
[0018] 表1 36份申請品種
[0019]
[0020] 表2 99份已知品種
[0021]
[0022]
[0023] 2、核心引物選擇
[0024] 小麥共有21對染色體，本發明在小麥每對染色體上選用2個SSR分子標記，共選 用了 42個分子標記；通過分析引物在染色體上的分布、多態性水平、PCR擴增穩定性和擴增 產物帶型，選擇了能夠同時滿足普通變性膠電泳檢測和毛細管熒光檢測兩種技術平臺的引 物共42對，作為小麥品種鑒定的核心引物（表3-4)。
[0025] 表3 21對核心引物
[0026]
[0027]
[0028]
[0029] 3、利用42對SSR引物對供試品種進行PCR擴增