一種10,11-脫氫彎孢霉菌素的生產方法及其應用
【技術領域】
[0001] 發明設及到一種微生物發酵法生產和精制10,11-脫氨彎抱霉菌素方法，屬于微 生物發酵領域。
【背景技術】
[0002] 10,11-脫氨彎抱霉菌素（10, 11-(16117化0州1'乂11131'111)是一種優良的天然除草劑， 此外還具有多種生物活性，如對人肺成纖維細胞的毒性，TGF-0抑制活性，抗氧化活性，W 及抑菌活性等。Turner W.B. (F^mgal Met油olites, 1971, Academic Press, London)首次從 真菌Qirvularia sp.的代謝物中分離獲得10,11-(16117化〇州1'￥11131'；[]1，未見產率報道。更 多的報道集中在化合物的分離與鑒定，未見該類化合物的微生物發酵及精制工藝。

【發明內容】

[0003] 本發明的目的在于提供一種高產、低成本、工藝簡單的微生物發酵法生產高純度 10,11-脫氨彎抱霉菌素的方法。
[0004] 本發明的目的是通過W下技術方案實現的：
[0005] 一種10,11-脫氨彎抱霉菌素的生產方法，采用微生物發酵法制得10,11-脫氨彎 抱霉菌素，具體工藝步驟如下；
[0006] (1)搖瓶種子液制備；將斜面菌種接種于種子培養基中，30°c下活化培養72小時 后得到菌塊，在無菌操作環境下，用接種針劃取0. 5cmX0. 5cm的菌塊接種于種子搖瓶中， 將種子培養搖瓶置于轉速為12化/min的恒溫振蕩器中，在28°C下恒溫培養7天，得到種子 液；
[0007] (2)發酵培養；按搖瓶發酵液的配方配制發酵培養基，將該培養液裝入步驟（1)中 的種子液中，在轉速為16化/min的恒溫振蕩器中，在28°C下恒溫培養15天，得到含有菌絲 體和10,11-脫氨彎抱霉菌素的發酵基質；
[000引 （3)發酵液的萃取：將發酵基質經過濾去除菌絲體，得到含10, 11-脫氨彎抱霉菌 素的發酵液，利用經重蒸處理過的工業級己酸己醋分批萃取3次，得己酸己醋萃取液，經減 壓濃縮得10,11-脫氨彎抱霉菌素浸膏。
[0009] (4)產品110, 11-脫氨彎抱霉菌素精制：將10, 11-脫氨彎抱霉菌素浸膏熱溶于 分析純己酸己醋，在室溫放置12h，過濾，分析純己酸己醋洗漆，得淡黃色顆粒狀晶體，即為 10,11-脫氨彎抱霉菌素。
[0010] 所述的種子培養基為上豆液體培養基（PDB)，即將200g/L的去皮±豆漿液與20g/ L的葡萄糖經混合后制得，pH自然。
[0011] 所述的發酵培養基為上豆液體培養基（PDB)，即將200g/L的去皮±豆漿液與20g/ L的葡萄糖經混合后制得，pH自然。
[0012] 而且，所述發酵液萃取使用的溶劑為工業級己酸己醋，經重蒸處理。
[0013] 而且，所述產品10, 11-脫氨彎抱霉菌素精制方法為重結晶技術，結晶溶劑為己酸 己醋，分析純。
[0014] 本發明將上述的10, 11-脫氨彎抱霉菌素應用于制備除草劑的藥劑上。
[0015] 所述的防除雜草類別包括馬唐、牛筋草、碑草、狗尾草、畫眉草、寒草類的禾本科雜 草。
[0016] 進一步，本發明將上述的10,11-脫氨彎抱霉菌素還應用于制備抗腫瘤的藥劑上。 所述的腫瘤性疾病為人宮頸癌細胞（CaSki細胞）和人肝癌細胞化epG2細胞）。本發明的 優點和積極效果是；本發明利用微生物發酵技術和重結晶技術高效生產和精制天然來源的 化合物10, 11-脫氨彎抱霉菌素，獲得精制的10, 11-脫氨彎抱霉菌素產品，純度> 99%。該 菌種對發酵原料適應性強，產品10, 11-脫氨彎抱霉菌素分離產率達28.8%。該化合物具有 防除雜草、抗腫瘤等生物活性，可應用于醫藥及生物農藥等領域。
【附圖說明】
[0017] 圖1.活化后的微生物菌落形態（PDA)。
[001引圖2.搖瓶發酵狀態下的菌落形態（PDB)。
[0019] 圖3.搖瓶發酵15天后培養液中10, 11-脫氨彎抱霉菌素的檢測。
[0020] 圖4.精制10,11-脫氨彎抱霉菌素。
[0021] 圖5.精制10, 11-脫氨彎抱霉菌素純度分析（純度99. 17% )。
【具體實施方式】
[0022] 下述試驗和實施例用于進一步說明但不限于本發明。
[0023] 一種微生物發酵法生產10, 11-脫氨彎抱霉菌素的方法，其工藝過程如下：
[0024] (1)搖瓶種子液制備；將斜面菌種接種于PDA固體培養皿中活化，30°C培養72 小時，肉眼觀察菌體生長良好，無雜菌污染（圖1)。在無菌操作環境下，用接種針劃取 0. 5cmX0. 5cm的菌塊接種于種子搖瓶中培養。將種子培養搖瓶置于轉速為12化/min的恒 溫振蕩器中，并使其培養溫度維持在28°C，培養7天，得到液體菌種。
[0025] (2)發酵培養；按搖瓶發酵液的配方配制培養液，分別裝入100個500mL的搖瓶 中，每個搖瓶裝液量為200mL。發酵搖瓶置于轉速為16化/min的恒溫振蕩器中，并使其培養 溫度維持在28°C，培養15天，得到含有菌絲體和10, 11-脫氨彎抱霉菌素的發酵基質（圖 2,圖3)。圖3為搖瓶發酵15天后培養液中10, 11-脫氨彎抱霉菌素的檢測；分析條件：色 譜儀器，Waters152祀F;分析柱，VenusilXBPC18;洗脫條件，50%邸3〇護&0;化合物保留 時間，17. 5分鐘。
[0026] (3)發酵液的萃取：將發酵基質通過過濾裝置去除菌絲體，得到含10, 11-脫氨彎 抱霉菌素的發酵液20以利用工業級己酸己醋（重蒸處理，總計用量20L)分批萃取3次，得 己酸己醋萃取液1化，經減壓濃縮得浸膏12.Og。
[0027] (4)產品10, 11-脫氨彎抱霉菌素精制：將12.Og發酵產物浸膏熱溶于200血己酸 己醋（分析純），室溫放置12h，過濾，己酸己醋（分析純）洗漆，得淡黃色顆粒狀晶體3. 45g， 分離產率28.8%。
[002引產品質量指標：
[0029] 性狀；淡黃色顆粒晶體（圖4)，純度> 99% (圖W;圖5為精制10, 11-脫氨彎抱 霉菌素純度分析（純度> 99% );分析條件；色譜儀器，Waters152祀F;分析柱，YMC-Pack ODS-A-HG;洗脫條件，50%CH3OH-H2O;化合物保留時間，14. 017分鐘。
[0030] 烙點：224-226°C。
[0031] 比旋光度[0]〇2°:-90. 2(c0. 61，邸3〇巧。
[003引 薄層色譜比移值Rf:0. 5(CHCl3-CH30H, 30:1)。
[003引 紫外吸收波長UV/Vis A max (MeOH)nm (log 0:234 (1.76) ,296 (1.94) and 348(1.49)。核磁共振氨譜電NMR(400MHz，CDCl3):12. 70 (lH，s, OH-7) ,6.71-6. 59(2 H，m，H-10and H-11), 6.58 (lH，brs，OH-5) ,6.25 (lH，d，J = 2.4, H-6), 6.22 (lH，d，J = 2.4，H-4)，4.92-4.83(lH，m，H-15)，4.05(lH，d，J=18.0，H-2a)，3.53(lH，d，J=18.0，H-2b)，2. 52-2. 46 (IH, m, H-12a)，2. 38-2. 28 (IH, m, H-12b)，2. 02-1. 87 (2H, m, H-13a and H-14a)，1. 69-1. 60 (2H, m, H-13b and H-14b)，1. 26 (3H, d, J = 6. 4, H-16)。
[0034] 核磁共振碳譜。cNMR(l〇〇MHz，CDCl3) :196. 2(C-9), 172.l(C-l), 166. 3(C-7), 16 1. 2(C-5), 148. 2(C-11), 137. 6(C-3), 131. 5(C-10), 114. 3(C-8), 113. 8(C-4), 103. 3(C-6) ，73. 1 (C-15)，44. 0 (C-2)，33.8(C-14)，32. 7 (C-12)，24. 0 (C-13)，19.8(C-16).高分辨質譜HRMS-ESI:m/z[M+的calcd.forCieHi905:291. 1232 ;found:291. 1225。10, 11-脫氨彎抱霉菌 素化學結構式如下：
[0035]
[0036] (5)10,11-脫氨彎抱霉菌素的除草作用：化合物10,11-脫氨彎抱霉菌素 (0-20.Og)W-定劑量的溶液兌水，對馬唐進行莖葉、上壤雙重處理，用水40-5化g/畝，噴 藥15天后，對雜草的生長形成有效抑制，與常見商業農藥如草甘麟W-定比例聯合處理， 除草效果保持。
[0037] 做10, 11-脫氨彎抱霉菌素的抗腫瘤作用；化合物10, 11-脫氨彎抱霉菌素對人宮 頸癌細胞（CaSki細胞）和人肝癌細胞化epG2細胞）具有一定的抑制活性，IQ。值分別為 52. 1和45.6yM;對人乳腺癌細胞（MDA-MB-231細胞）和人胃癌細胞（HGC-27細胞）基本 沒有抑制活性，ICg。值分別為117. 8和274. 9uM。
【主權項】
1. 一種10, 11-脫氫彎孢霉菌素的生產方法，其特征在于，采用微生物發酵法制得 10,11-脫氫彎孢霉菌素，具體工藝步驟如下： (1) 搖瓶種子液制備：將斜面菌種接種于種子培養基中，30°c下活化培養72小時后得 到菌塊，在無菌操作環境下，用接種針劃取0.5 cmXO. 5 cm的菌塊接種于種子搖瓶中，將種 子培養搖瓶置于轉速為120 r/min的恒溫振蕩器中，在28°C下恒溫培養7天，得到種子液； (2) 發酵培養：按搖瓶發酵液的配方配制發酵培養基，將該培養液裝入步驟（1)中的種 子液中，在轉速為160 r/min的恒溫振蕩器中，在28°C下恒溫培養15天，得到含有菌絲體和 10, 11-脫氫彎孢霉菌素的發酵基質； (3) 發酵液的萃取：將發酵基質經過濾去除菌絲體，得到含10, 11-脫氫彎孢霉菌素的 發酵液，利用經重蒸處理過的工業級乙酸乙酯分批萃取3次，得乙酸乙酯萃取液，經減壓濃 縮得10, 11-脫氫彎孢霉菌素浸膏； (4) 產品110, 11-脫氫彎孢霉菌素精制：將10, 11-脫氫彎孢霉菌素浸膏熱溶于分 析純乙酸乙酯，在室溫放置12 h，過濾，分析純乙酸乙酯洗滌，得淡黃色顆粒狀晶體，即為 10, 11-脫氫彎孢霉菌素。2. 根據權利要求1所述的10, 11-脫氫彎孢霉菌素的生產方法，其特征在于，所述的種 子培養基為土豆液體培養基（PDB)，即將200 g/L的去皮土豆漿液與20 g/L的葡萄糖經混 合后制得，pH自然。3. 根據權利要求1所述的10, 11-脫氫彎孢霉菌素的生產方法，其特征在于，所述的發 酵培養基為土豆液體培養基（PDB)，即將200 g/L的去皮土豆漿液與20 g/L的葡萄糖經混 合后制得，pH自然。4. 權利要求1~3任一項所述的10, 11-脫氫彎孢霉菌素在制備除草劑的藥劑上的應用。5. 權利要求1~3任一項所述的10, 11-脫氫彎孢霉菌素在制備抗腫瘤的藥劑上的應用。6. 根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述的防除雜草類別包括馬唐、牛筋草、 稗草、狗尾草、畫眉草、藎草類的禾本科雜草。7. 根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述的腫瘤性疾病為人宮頸癌細胞 (CaSki細胞）和人肝癌細胞（HepG2細胞)。
【專利摘要】本發明屬于微生物發酵領域，特別涉及一種微生物發酵法生產10,11-脫氫彎孢霉菌素的方法。本發明的特征在于使用液體發酵技術獲得發酵基質，利用過濾方法去除菌絲體，然后通過乙酸乙酯萃取，減壓濃縮得浸膏，利用乙酸乙酯重結晶技術，獲得精制的10,11-脫氫彎孢霉菌素產品，純度﹥99%。該菌種對發酵原料適應性強，產品10,11-脫氫彎孢霉菌素分離產率達28.8%。產品10,11-脫氫彎孢霉菌素具有防除雜草、抗腫瘤等多種藥理活性，在醫藥、生物農藥等領域具有廣泛的應用。
【IPC分類】A01P13/00, A01N43/22, A61K31/365, A61P35/00, C12P17/08
【公開號】CN104988193
【申請號】CN201510392665
【發明人】鄧張雙, 陳良立, 郭志勇, 龔大春, 汪鋆植, 鄒坤
【申請人】三峽大學
【公開日】2015年10月21日
【申請日】2015年7月7日