專利名稱：：一株發孢甲基彎菌及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及微生物領域中的一株甲烷氧化菌及其應用，特別是涉及一株發孢甲基彎菌及其應用。技術背景甲烷單加氧酶(Methanemonooxygenase，MM0)是生物體系中唯一能夠在常溫常壓下選擇性氧化甲烷生成甲醇的酶系，具有催化效率高，選擇性好的優點(RichardS.Hanson,ThomasE.Hanxon.MethanotrophicBacteria.MicrobiologicalReviews.1996(60):439-471)。它能將甲烷部分氧化成中間代謝產物甲醇，進一步轉化成二氧化碳和水，而且還能催化CI-C20垸烴化合物羥基化和C2-C10烯烴化合物環氧化，還可以共代謝氧化三氯甲垸、三氯乙烯、二氯甲烷等鹵代烴類化合物。因此，甲垸單加氧酶在天然氣利用、大宗化學品生產、生物材料開發、瓦斯氣體的安全預警與應急技術的研究、環境污染物的生物修復、控制全球甲烷溫室氣體和維持水陸生態環境的碳循環等方面都具有極大的應用潛力。實現上述應用均需要利用大量的高活性的甲垸單加氧酶，但是該酶價格昂貴，而且其胞外再生技術不成熟、純化過程復雜、穩定性差，因此直接利用其進行工業生產無疑將大大增加生產成本。甲烷氧化菌中含有甲烷單加氧酶，它是自然界中一類特殊的微生物，以甲院為唯一碳源及能源。因此利用具有穩定、高醒O活性的甲垸氧化菌進行整細胞催化將會成為實現上述應用的主要途徑。然而一般從自然界篩選得到的甲垸氧化菌普遍利用甲烷的效率低，生長速率慢，特別是MMO酶活不高，這些均已成為目前限制甲垸氧化菌大規模應用的瓶頸問題。因此，選育具有良好特性的生產菌株是實現上述應用的關鍵。
發明內容本發明的一個目的是提供一株發孢甲基彎菌，該菌具有生長速度快，遺傳穩定性高的特性并含有高酶活的甲烷單加氧酶。本發明所提供的發孢甲基彎菌為發孢甲基彎菌(ife^J^oW/HASt/7'C力OS/70/7'鵬)LEB-5，是通過常壓低溫等離子體誘變發孢甲基彎菌(leZ^J^OSi/2iA5^ric力ospori咖)0B3b得到的。它己于2007年09月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心地址是中國北京市朝陽區大屯路甲3號，保藏號為CGMCCNo.2173。本發明的另一個目的是提供一種生產甲烷單加氧酶的方法。本發明所提供的生產甲烷單加氧酶的方法是發酵發孢甲基彎菌(#"A^0^'m/sz^z'c力o印ori鵬)LEB-5CGMCCNo.2173得到甲烷單加氧酶。所述發酵方法為將發孢甲基彎菌(ifez^j^os;wsfric力os/ori咖)LEB-5CGMCCNo.2173接種于NMS培養基，在空氣和甲垸體積比為1:0.5—1:1.5的環境中、溫度為27-33°(3的條件下培養。在所述發酵培養過程中還可進行振蕩，所述振蕩速度為130200轉/分鐘，旋轉半徑為10-15mm。其中，空氣和甲垸的體積比具體可為1:1;培養溫度具體可為3(TC;轉速具體可為150轉/分。所述NMS培養基每升中含有0.5-1.5克NaN03，0.2-1,0克KH2P04，1.5-2.9克Na風，O.12-0.25克K2S04，0.025-0.05克MgS04每，0.002-0.010克CaCl2《H20，10-13毫克FeS047H20，2.0-3.5毫克CuS045H20，l-5毫升微量元素貯存液，0.1-l毫升H2S04溶液，余量為水；所述H2S04溶液的濃度為0.1-5mmol/L;所述微量元素貯存液的組成為ZnS04*7H20，0.1-0.5克/升;MnS044H20，0.2-0.25克/升；H肌0.012-0.092克/升;Na2Mo042H20，0.012-0.050克/升;CoCl26H20，0.011-0.095克/升和KI，0.07-0.09克/升；所述微量元素貯存液的溶劑為水。所述NMS培養基具體可為每升培養基中含有O.85克NaN03，0.53克KH2P04，2.17克Na2HP04，0.17克K2S04，0.037克MgS04'7H20，0.007克CaCl2*2仏0，11.2毫克FeS04'7仏0，2.5毫克CuS04'5H20，2毫升微量元素貯存液，0.5毫升H2S04溶液，余量為水；所述H2S(V溶液的濃度具體可為lmmol/L;所述微量元素貯存液的組成具體可為ZnS047H200.2042克/升，MnS044H200.223克/升，H3B030.062克/升，Na2Mo042H20，0.048克/升，CoCl26H200.048克/升和KI0.083克/升;所述微量元素貯存液的溶劑為水。所述NMS培養基的pH為6.8-7.2，具體可為7.0。本發明的發孢甲基彎菌(K力/7asi加sZ^'c力os/on'鵬)LEB-5CGMCCNo.2173生長速度快、遺傳穩定性高，而且易于培養、培養效率高，能以甲垸為唯一碳源和能源產生具有高酶活的甲垸單加氧酶。本發明用發孢甲基彎菌(#ez^K7o9i"Mz^'c/w印or^邁)LEB-5CGMCCNo.2173生產甲烷單加氧酶的方法，克服了目前甲烷氧化菌利用甲烷效率低、生長速度慢、含有的甲烷單加氧酶的催化活性不高等問題，在天然氣利用、大宗化學品生產、生物材料開發、瓦斯氣體治理、環境污染物的生物修復等方面將會有廣闊的應用前景。圖1為發孢甲基彎菌(Jfez^^ow'加sz^rz'c力aspory咖)LEB-5CGMCCNo.2173及發孢甲基彎菌(ife^K7ow'加sfn'c力os/oj7'咖)0B3b的生長曲線。圖2為傳代培養發孢甲基彎菌(ifet/^7ow'"i/s^ric力o印oi^'i做)LEB-5CGMCCNo.2173時各代的對數生長中期的菌體光密度及甲烷單加氧酶活性。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明均為常規方法。實施例1、發孢甲基彎菌(i/ez^^osj'朋strj'c/o印oi^咖)LEB-5CGMCCNo.2173的制備本實施例中所使用的培養基的組成如下NMS(Higgins，nitrateminimalsalt)液體培養基每升培養基中含有O.85克NaN03，0.53克KH2P04，2.17克Na2HP04，0.17克K2S04，0.037克MgS047H20，0.007克CaCl22H20，11.2毫克FeS047H20，2.5毫克CuS045H20，2毫升微量元素貯存液，0.5毫升H2S04溶液，余量為水；所述NMS培養基的pH為7.0。121。C高壓滅菌15分鐘。H2S04溶液的濃度為lmmol/L。微量元素貯存液的組成為ZnS04*7H20，0.2042克/升;MnS044H20，0.223克/升；H3B03，0.062克/升；Na2Mo042H20，0.048克/升;CoCl26H20，0.048克/升；KI，0.083克/升。所述微量元素貯存液的溶劑為水。NMS固體培養基是在每升上述NMS液體培養基中加入15g瓊脂得到的。一、制備出發菌株懸浮液以II型甲烷氧化菌中的發孢甲基彎菌(ife^F7osj'm/sz^/c/o印ori鵬)0B3b(ATCC55314)為出發菌株。向裝有30mLNMS液體培養基的lOOmL帶擋板的密閉玻璃培養瓶中接入1.2mLOD柳為0.312的發孢甲基彎菌(#ez^^osi""stric力ospor'咖)0B3b的懸浮液，即接種量為4%(V/V)，加蓋橡膠塞，密封；用已滅菌的醫用注射器抽取瓶內空氣30mL，然后用已滅菌的濾膜孔徑為0.2um的氣體過濾器(Sartorius，Midisart2000)向瓶中注入甲烷至瓶內恢復常壓(一個大氣壓)；在溫度為30'C、轉速為150rpm、旋轉半徑為12mm的條件下振蕩培養，每24h重新充入混合氣體(空氣甲烷=1:1，V/V)至瓶內恢復常壓(一個大氣壓)，離心收集生長至對數生長期的發孢甲基彎菌(ifet/^ow'加sfn'c力o印orj'咖)0B3b，將其重懸于PBS磷酸緩沖溶液中，制得出發菌株發孢甲基彎菌(ifefA^o^/^fhc力o印ori鵬)0B3b的懸浮液，其0D6。。為0.9、細胞干重為1.8g/L。PBS磷酸緩沖溶液的組成為NaCl8g/L,KC10.2g/L,Na2HP041.44g/L，KH2P040.24g/L;所述PBS磷酸緩沖溶液的pH為7.2。二、常壓低溫等離子體誘變發孢甲基彎菌(儉z^^osi'加s^rj'c力o印oW咖)0B3b1、樣品載片的制備取步驟一制備的出發菌株發孢甲基彎菌(ifez^^ow'/7M^rj'c力ospoWw/z)0B3b的懸浮液50uL，滴加在滅菌冷卻后的不銹鋼載片上，載片直徑10mm，然后將載片置于無菌工作臺，室溫自然風干至載片表面無明顯液滴。全部操作過程在無菌條件下進行。2、誘變操作利用等離子體發生器進行誘變，具體方法如下載片放置區域預先用75%酒精擦拭。等離子體發生器利用裸露電極放電，放電氣體采用純氦氣，外加電壓為200V的射頻電壓，輝光均勻放電，射流溫度為4(TC。將制得的載片置于等離子體射流出口區域進行輻照，載片距射流出口2咖。輻照時間為1.0rain。每次處理一個載片。3、誘變菌株的篩選將步驟2中經等離子體誘變處理后的載片分別置于裝有lmlPBS磷酸緩沖溶液的離心管中，劇烈振蕩，以將載片上的菌體洗脫。取所得的菌體懸浮液200ul，涂布于用于篩選的NMS固體培養基平板上。涂布后的平板置于30°C、空氣和甲垸體積比為l:l的環境中培養，培養至第6天。挑取平板上的菌落分別接入10ml麗S液體培養基中，加蓋橡膠塞，密封；用已滅菌的醫用注射器抽取瓶內空氣45mL，然后用已滅菌的濾膜孔徑為0.2um的氣體過濾器(Sartorius，Midisart2000)向瓶中注入甲烷至瓶內恢復常壓，在溫度為30。C、轉速為150rpm、旋轉半徑為12mm的條件下振蕩培養，每24h重新充入混合氣體(空氣甲烷=1:1，V/V)至瓶內恢復常壓(一個大氣壓)。通過測量其對數生長期的菌體濃度及所產生的甲烷單加氧酶的活性來驗證是否是目的誘變菌株。結果得到一株對數生長期的菌體濃度為1612-1786mg細胞干重/L發酵液、甲烷單加氧酶的活性為452-1492U/mg細胞干重的菌株，將其編號為LEB-5，該菌株已于2007年09月14日被保藏，其保藏號為CGMCCNo.2173。實施例2、利用發孢甲基彎菌(#ez^^asi/2wsz^fc/o邵orf咖)LEB-5CGMCCNo.2173發酵生產甲烷單加氧酶本實驗中所使用的培養基的組成如下NMS(Higgins'nitrateminimalsalt)液體培養基每升培養基中含有O.85克NaN0"0.53克KH2P04，2.17克Na2HP04，0.17克K2S04，0.037克MgS047H20，0.007克CaCl22H20，11.2毫克FeS047H20，2.5毫克CuS045H20，2毫升微量元素貯存液，0.5毫升H2S04溶液，余量為水；所述NMS培養基的pH為7.0。121。C高壓滅菌15分鐘。H2S04溶液的濃度為lmmol/L。微量元素貯存液的組成為:ZnS047H20，0.2042克/升;MnS044H20，0.223克/升；H3B03，0.062克/升;Na2Mo042H20，0.048克/升;CoCl26H20，0.048克/升；KI，0.083克/升；所述微量元素!C存液的溶劑為水。NMS固體培養基是在每升上述NMS液體培養基中加入15g瓊脂得到的。具體實驗步驟如下1、菌株活化將發孢甲基彎菌(ifez^j^ow'/2iAs^ic力ospon'鵬)LEB-5接種于NMS固體培養基上，劃線后置于3(TC、空氣與甲垸的體積比為l:l的環境中培養6天。2、種子培養挑取平板上的菌落接入裝有10ml畫S液體培養基的培養瓶中，加蓋橡膠塞，密封；用已滅菌的醫用注射器抽取瓶內空氣45mL，然后用已滅菌的濾膜孔徑為O.2um的氣體過濾器(Sartorius，Midisart2000)向瓶中注入甲烷至瓶內恢復常壓(一個大氣壓)，在溫度為30°C、轉速為150rpm、旋轉半徑為12mm的條件下振蕩培養，每24h重新充入混合氣體(空氣甲烷=1:1，V/V)至瓶內恢復常壓(一個大氣壓)，制得種子培養液。3、發酵培養取lml步驟2中生長至對數生長期(72h)、0De。。為0.2、細胞干重為1.52g/L的種子培養液，在無菌條件下將其接入裝有30mlNMS液體培養基的lOOml培養瓶中，加蓋橡膠塞，密封；用已滅菌的醫用注射器抽取瓶內空氣30mL，然后用已滅菌的濾膜孔徑為0.2um的氣體過濾器(Sartorius，Midisart2000)向瓶中注入甲垸至瓶內恢復常壓(一個大氣壓)，在溫度為3(TC、轉速為150rpm、旋轉半徑為12mm的條件下振蕩培養，每24h重新充入空氣和甲垸的混合氣體至瓶內恢復常壓(一個大氣壓)，該混合氣體中空氣和甲垸的體積比為1:1。每隔24小時測定一次ODe。。，并繪制生長曲線。實驗設三次重復，并以原始菌株即未經誘變的發孢甲基彎菌(#e"y70w'/"strz.c力卿o".咖)0B3b為對照。結果如圖1所示，發孢甲基彎菌(lez^r7o^朋sz^ic力ospori鵬)LEB-5CGMCCNo.2173的對數生長期為72-120小時，在144小時達到最高生長量；發孢甲基彎菌(ife^r7asi/7ws^ric/wsporiuw)0B3b的對數生長期為72-120小時，在96小時達到最高生長量。在各個生長階段，發孢甲基彎菌(#e^^ow'77Wsz^ic/ospow'MH)LEB-5CGMCCNo.2173的生長量均明顯高于發孢甲基彎菌(fez^^o^'/2^frj.c力05^ori〃/z)0B3b。其中，0D6。。和細胞干重的換算關系為細胞干重=1.42+0.48X0D柳。。換算結果表明發孢甲基彎菌(ifez^j^o^/〃5"z^ic力o^ori湖)LEB-5CGMCCNo.2173培養至72、96、120、144小時的菌體含量分別為1634士12mg細胞干重/L發酵液、1714士17mg細胞干重/L發酵液、1725±23mg細胞干重/L發酵液和1732士24mg細胞干重/L發酵液；發孢甲基彎菌(ifez^K7ow'加stn'c力o5"/7ori鵬)0B3b培養至72、96、120、144小時的菌體含量分別為1248土15mg細胞干重/L發酵液、1342土llmg細胞干重/L發酵液、1461土14mg細胞干重/L發酵液、1471土8mg細胞干重/L發酵液。4、酶活測定根據甲烷單加氧酶催化丙烯生成環氧丙烷的反應來測定酶活，具體按照下述文獻中所描述的方法測定BurrowsK.丄，CornishA.，etal，Substratespecificitiesofthesolubleandparticulatemethanemonooxygenasesofifez^/7asi"wsm-c力09porz',0B3b.J.Gen.Microbiol.1984(130):3327-3333。其中，甲烷單加氧酶的酶活定義為在3(TC下，每分鐘催化l微摩爾(umol)丙烯轉化為環氧丙垸所需的酶量，即llKumol環氧丙烷/分；酶的比活單位定義為lmg細胞干重中所含的酶活力單位，即lU/mg細胞干重。具體方法如下將發孢甲基彎菌(ifefAr7ow'/7Mto'c力os/7oriM7)LEB-5和發孢甲基彎菌(臉fAr7o^/加sz^'c力ospor/咖)0B3b培養72、96、120、144小時的發酵液于12000rpm離心，收集菌體，棄去上清液，將菌體重懸于含20mMHC00Na和5mMMgCL的20mM磷酸緩沖液中至菌液0D,為0.5;然后將菌液裝于總體積為70ml的反應瓶中，膠塞密封后用針管抽取20ml空氣，再充入20ml丙烯氣體，于3(TC水浴搖床中反應30min。12000rpm離心3min，測定上清液中環氧丙垸濃度。測定裝置及條件為氣相色譜儀器(島津GC—2010)，色譜柱(型號AT-5，說明書第7/9頁固定液5%苯基聚硅氧垸，95%甲基聚硅氧烷；柱長25m，內徑0.32mm，膜厚3.0um)，進樣器200。C，柱箱50。C,檢測器200。C，載氣N2，流速25cm/sec，H230ml/min，空氣300ml/min,進樣量lul。實驗設三次重復，結果如表1所示。表l誘變菌及原始菌所生產的甲烷單加氧酶的比活<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注誘變菌為發孢甲基彎菌(ifef力/7osj'/2iAsz^ric力os^ari咖)LEB-5原始菌為發孢甲基彎菌(i/ef力77ow'77〃sZ^z'c力o5"/on'i朋)0B3b實施例3、利用發孢甲基彎菌(Jfez^j^os眾iAsfWc力o印or'咖)LEB-5CGMCCNo.2173發酵生產甲浣單加氧酶本實驗中所使用的培養基的組成如下-NMS(Higgins，nitrateminimalsalt)液體培養基每升培養基中含有O.5gNaNO"0.2gKH2P04，1.5gNa風，0.12gK2S04，0.025gMgS047H20，0.002gCaCl22H20，lOragFeS047H20，2.OmgCuS045H20，lml微量元素jt存液，0.lmlH2S04溶液，余量為水；所述麗S培養基的pH為6.8。121。C高壓滅菌15分鐘。貼04溶液的濃度為0.lraM。微量元素貯存液的組成為ZnS04*7H20，0.l克/升;MnS044H20，0.2克/升;H3B03，0.012克/升;Na2Mo042H20，0.012克/升;CoCl26H20，0.011克/升;KI，0.07克/升；所述微量元素貯存液的溶劑為水。NMS固體培養基是在每升上述NMS液體培養基中加入15g瓊脂得到的。本實驗中培養發孢甲基彎菌(#"Ar7osi/2i/sz^ric力as;arj'w//7)LEB-5的過程中，除培養溫度、空氣與甲烷的體積比、振蕩轉速及旋轉半徑不同外，其余均與實施例2中的培養過程相同。本實驗中的培養溫度為27°C，空氣與甲垸的體積比為1:0.5，振蕩轉速為130轉/分，旋轉半徑為10mm。本實驗中甲烷單加氧酶酶活按照實施例2中的方法測定。實驗設三次重復。分別測發孢甲基彎菌(#ez^7"w'/7iAs^ric力o印or;/H)LEB-5CGMCCNo.2173培養至72、96、120、144小時的0D6。。，分別為0.478、0.657、0.733、0.741，將其換算成菌體含量，分別為1649士23mg細胞干重/L發酵液、1735±34mg細胞干重/L發酵液、1771士17rag細胞干重/L發酵液、1775士32mg細胞干重/L發酵液。分別測發孢甲基彎菌(i/e^7乃w'"iwtric力osporj'咖)LEB-5CGMCCNo.2173培養至72、96、120、144小時的酶活，結果見表2。表2發孢甲基彎菌LEB-5產生的甲垸單加氧酶的比活生長時間酶比活(小時)(U/mg細胞干重)72475±2396700±121201023±211441112±18實施例4、利用發孢甲基彎菌(ifez^77a^'/7wsz^'c力os^oW咖)LEB-5CGMCCNo.2173發酵生產甲烷單加氧酶本實驗中所使用的培養基的組成如下NMS(Higgins，nitrateminimalsalt)液體培養基每升培養基中含有l.5克NaN0"1.0克KH2P04，2.9克Na異，0.25克K2S04，0.05克MgS047H20，0.010克CaCl22H20，13毫克FeS047H20，3.5毫克CuS045H20，5毫升微量元素貯存液，l毫升H2S(V溶液，余量為水；所述醒S培養基的pH為7.2。12rC高壓滅菌15分鐘。H2S04溶液的濃度為5mmol/L。微量元素貯存液的組成為ZnS(WH20，0.5克/升;MnS044H20，0.25克/升;跳，0.092克/升;Na2Mo042H20，0.050克/升；CoCl26H20，0.095克/升;KI，0.09克/升。所述微量元素貯存液的溶劑為水NMS固體培養基是在每升上述麗S液體培養基中加入15g瓊脂得到的。本實驗中培養發孢甲基彎菌(ifez^r7osj'/H/sz^ric力o印on'Mz)LEB-5的過程中，除培養溫度、空氣與甲垸的體積比、振蕩轉速及旋轉半徑不同外，其余均與實施例2中的培養過程相同。本實驗中的培養溫度為33'C，空氣與甲垸的體積比為1:1.5，振蕩轉速為200轉/分，旋轉半徑為15mra。本實驗中甲烷單加氧酶酶活按照實施例2中的方法測定。實驗設三次重復。分別測發孢甲基彎菌(ifez^^ow'加sz^rz'c力o印ow'M/)LEB-5CGMCCNo.2173培養至72、96、120、144小時的0D6。。，分別為0.428、0.637、0.731、0.737，將其換算成菌體含量，分別為1625土12mg細胞干重/L發酵液、1726土13mg細胞干重/L發酵液、1775士9mg細胞干重/L發酵液、1775±llmg細胞干重/L發酵液。分別測發孢甲基彎菌(ifef4^ow';wsfWc力057ori鵬)LEB-5CGMCCNo.2173培養至72、96、120、144小時的酶活，結果見表3。表3發孢甲基彎菌LEB-5產生的甲烷單加氧酶的比活生長時間酶比活(小時)(U/mg細胞干重)72483±1296714±141201123±171441352±15實施例5、發孢甲基彎菌(ifez^/7osi加strz'c力o印or;邁)LEB-5的遺傳穩定性檢測取lml實施例2中生長至對數生長中期即96h的發孢甲基彎菌(l"A^o^'/wsz^'c力o5"/ori咖)LEB-5CGMCCNa.2173的種子培養液，在無菌條件下將其接種于裝有30mlNMS培養基的培養瓶中，按照實施例2中的方法進行培養，培養至對數生長中期96h時(第一代)；從中取lml菌液，在無菌條件下將其接種于裝有30mlNMS培養基的培養瓶中，按照實施例2中的方法進行培養，培養至對數生長中期96h時(第二代)；如此再繼續傳代培養8代。測定l-10代每代生長至對數生長中期(96h)的菌體光密度及甲烷單加氧酶的活性，測定方法如同實施例2中所述，結果如圖2所示。結果表明在傳代培養的1-10代中，每代生長至對數生長中期(96h)的菌體光密度0D6。。都保持在0.62-0.65的一個很穩定的范圍內，發孢甲基彎菌(J/ez^/Jas&Mtn'c力ospoWw/z)LEB-5生產的甲烷單加氧酶的活性也都保持在693-730U/mg細胞干重的一個很穩定的范圍內。權利要求1、發孢甲基彎菌(Methylosinustrichosporium)LEB-5，其保藏編號為CGMCCNo.2173。2、一種生產甲垸單加氧酶的方法，是發酵發孢甲基彎菌(i/"力j^ow'/wsz^'c力o印orj'咖)LEB-5CGMCCNo.2173得到甲烷單加氧酶。3、根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述發酵方法為將發孢甲基彎菌(ifez^/7asi77M^ric力ospaW鵬)LEB-5CGMCCNo.2173接種于麗S培養基，在空氣和甲垸體積比為l:0.5_1:1.5的環境中、溫度為27-33X:的條件下培養。4、根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于所述發酵培養過程中進行振蕩，所述振蕩速度為130200轉/分鐘，旋轉半徑為10-15mm。5、根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述NMS培養基每升中含有0.5-1.5克NaN0"0.2-1.0克KH2P04，1.5-2.9克Na2HP04，0.12-0.25克K2S04，0.025-0.05克MgS047H20，0.002-0.010克CaCl22H20，10-13毫克FeS047H20，2.0-3.5毫克CuS045H20，1-5毫升微量元素IC存液，0.1-1毫升H2S04溶液，余量為水；所述NMS培養基的pH為6.8-7.2;所述H2S(V溶液的濃度為0.1-5mmol/L;所述微量元素貯存液的組成為ZnS04*7H20，0.1-0.5克/升;MnS044H20，0.2-0.25克/升；H3B03，0.012-0.092克/升;Na2Mo042H20，0.012-0.050克/升;CoCl26H20，0.011-0.095克/升；KI，0.07-0.09克/升;所述微量元素貯存液的溶劑為水。6、根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述麗S培養基每升中含有0.85克NaNO"0.53克KH2P04，2.17克Na2HP04，0.17克K2S04，0.037克MgS047H20，0.007克CaCl22H20，11.2毫克FeS047H20，2.5毫克CuS045H20，2毫升微量元素貯存液，0.5毫升H2S0,溶液，余量為水；所述H2S(X溶液的濃度為lmraol/L;所述微量元素貯存液的組成為ZnS047H200.2042克/升，MnS044H200.223克/升，H3B030.062克/升，Na2Mo042H20，0.048克/升，CoCl26H200.048克/升和KI0.083克/升；所述微量元素IC存液的溶劑為水。7、根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述空氣和甲垸的體積比為1:1。8、根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述發酵培養溫度為3(TC。9、根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述轉速為150轉/分。10、根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述NMS培養基的pH為7.0。全文摘要本發明公開了一株發孢甲基彎菌及其應用。本發明所提供的發孢甲基彎菌為發孢甲基彎菌(Methylosinustrichosporium)LEB-5，其保藏編號為CGMCCNo.2173。本發明還提供了一種生產甲烷單加氧酶的方法即發酵發孢甲基彎菌(Methylosinustrichosporium)LEB-5CGMCCNo.2173得到甲烷單加氧酶。本發明的發孢甲基彎菌(Methylosinustrichosporium)LEB-5CGMCCNo.2173生長速度快、遺傳穩定性高，而且易于培養、培養效率高，能以甲烷為唯一碳源和能源產生具有高酶活的甲烷單加氧酶。本發明用發孢甲基彎菌(Methylosinustrichosporium)LEB-5CGMCCNo.2173生產甲烷單加氧酶的方法，克服了目前甲烷氧化菌利用甲烷效率低、生長速度慢、含有的甲烷單加氧酶的催化活性不高等問題，在天然氣利用、大宗化學品生產、生物材料開發、瓦斯氣體治理、環境污染物的生物修復等方面將會有廣闊的應用前景。文檔編號C12N9/00GK101397543SQ20071017542公開日2009年4月1日申請日期2007年9月29日優先權日2007年9月29日發明者昊吳,李和平,王立言,邢新會申請人:清華大學