一種提高脫落酸發酵產量的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種脫落酸的生產方法，尤其是一種提高脫落酸發酵產量的方法，屬于生物工程技術領域。
【背景技術】
[0002]脫落酸是植物五大激素之一，在植物生長發育中起多方面作用:如調節氣孔開閉，抑制種子發芽，控制胚胎和種子發育成熟，涉及抗逆作用如脫水，干旱，鹽脅迫，低溫，病蟲害和機械創傷等環境因子應答。在農業中，可用于提高作物的抗旱、抗寒、抗鹽能力，在其應用領域已經有大量專利報道，如公開號為CN104671979A的專利申請公開了一種含脫落酸的拌種劑，可提高東農冬麥I號抗寒能力；公開號為CNlO1199284的專利申請公開了一種含脫落酸的仁用杏樹花果防凍劑；公開號為CN1229015C的專利申請公開了一種含脫落酸的花期延長劑等。脫落酸的生產方法主要可以分為三類:(I)從植物中提取；(2)化學合成；
[3]微生物發酵法。其中植物中提取的方法因植物中含量極低，難以大量獲得，成本過高而無應用價值。人工合成脫落酸為多種光學異構體的混合物，拆分困難，活性遠小于天然型的脫落酸，售價昂貴，限制了其應用。而微生物發酵法是近年來興起的天然脫落酸生產方法，已經在工業上推廣應用。微生物發酵法生產脫落酸，主要使用的是真菌，如灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)，因為該菌發酵產量比其他微生物高，這在文獻中已經有較詳細的報道(陸麗珍等，氨基酸和生物資源2011，33(2):23-26)。為提高其發酵產量，人們主要對其發酵液成分、營養物質、添加前體等進行了研宄。例如:日本專利JP 5836393報道了在C.rosicola液體發酵培養基中添加鳥嘌呤，可使發酵產量提高；但由于鳥嘌呤價格較昂貴，在生產過程中成本較高；日本專利JP 0260590報道了在B.cinerea液體發酵培養基中添加柑橘干果皮提取物，可提高發酵產量，但由于柑橘果皮中含有抑制真菌生長的物質，且其含量受到柑橘種類、產地等因素的影響，在發酵中較難控制其添加量。鄭珩等報道(氨基酸和生物資源2002, 24(4):25-27) 了添加營養物質如玉米粉、檸檬酸鈉等，可以提高灰葡萄孢霉菌液體發酵產脫落酸的產量，優化后脫落酸產量可達0.212克/升。公開號為CN1182798A的專利申請公開了一種采用三級發酵方法，在第三級發酵中采用連續流加補料出料以及菌種固定化，并添加關鍵底物如咪唑、嗎啉、吡啶及其衍生物、乙酰胺、乙酸胺、甲羥戊酸等中的任一種，使脫落酸的產量可達到1.2克/升發酵液；公開號為CN 101041837A的專利申請公開了一種通過在發酵過程中流加肌醇解除葡萄糖阻遏的工藝來提高脫落酸的產量。公開號為CN102399827 A的專利申請則通過在發酵過程中流加乙酰輔酶A作為菌株合成脫落酸的前體物質，同時，添加生物表面活性劑吐溫-20改善發酵液溶氧狀況來制備天然脫落酸的方法，可以提高脫落酸的發酵產量。盡管如此，上述現有技術仍存在一些問題，如工藝較復雜，添加的底物、前體或促進劑成本高，不利于生產的成本降低等，另外，在液體發酵過程中，還容易出現菌絲體結團、發酵液粘度大、溶氧降低等缺點，使得發酵產量難以進一步提高。

【發明內容】

[0003]本發明的目的是針對現有技術存在的缺陷，提出一種提高脫落酸發酵產量的方法，解決菌絲體結團、發酵液粘度大的問題。
[0004]本發明通過以下技術方案解決技術問題:一種提高脫落酸發酵產量的方法，包括以下步驟:
[0005]第一步、對灰葡萄孢霉菌進行斜面培養3-5天，培養溫度24_30°C ;
[0006]第二步、經斜面培養的灰葡萄孢霉菌進行種子培養48-72小時，培養溫度24-28 0C ；
[0007]第三步、經種子培養的灰葡萄孢霉菌進行發酵培養8-11天，培養溫度24_28°C，培養時添加濃度為0.01-200mM的發酵促進劑，所述發酵促進劑為鉬酸或鉬酸鹽中的至少一種；
[0008]第四步、經發酵培養的灰葡萄孢霉菌提取純化，得到高產量的脫
[0009]落酸。
[0010]上述方法在發酵工藝中添加鉬酸及其鹽類的一種或者兩種以上的組合，從而提高灰葡萄孢霉菌發酵產天然脫落酸的產量。上述方法中的灰葡萄孢霉菌As 3.4584，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。
[0011]本發明通過以下技術方案進一步解決技術問題，所述第一步中，斜面培養采用PDA
平板培養基。
[0012]所述第二步中，種子培養基的成分按重量百分比如下，葡萄糖1_3%，MgSO40.01-0.1%, KCl 0.01-0.1%, KH2PO4 0.01-0.1%，谷氨酸單鈉鹽 0.1-0.5%, FeSO4.7H200.5mg/L，ZnSO4.7H20 2.5mg/L，CuSO4.5H20 4.0mg/L，余量的水。
[0013]所述第三步中，發酵培養基的成分如下，蔗糖或葡萄糖
[0014]10-40/L，一水合檸檬酸l-10g/L，吐溫-801_30g/L，玉米粉或玉米漿l_15g/L，豆油l_25g/L，山芋粉l_15g/L，鉬酸鹽Ι-lOOmM。所述鉬酸鹽為鉬酸鈉、鉬酸鉀、鉬酸銨、鉬酸鈣、鉬酸亞鐵、鉬酸鎂、鉬酸銅、鉬酸鋅中的至少一種，鉬酸鹽單獨在121°C滅菌25min，在發酵過程中一次或分次添加至發酵培養基中。所述鉬酸鹽的添加量為0.01-200mM。
[0015]將含有灰葡萄孢霉菌的種子培養基以1% -10%的接種量接種至發酵培養基培養。
[0016]所述第四步中，提取純化是將發酵后產物離心，收集發酵液，用鹽酸調節pH至2-4，加入等體積的乙酸乙酯萃取，萃取液濃縮后，結晶得產品。
[0017]本發明利用鉬酸鹽可以一定程度上抑制菌絲生長，誘導菌絲從絲狀變為短棒狀或小球形，顯著分散菌絲，改變菌絲形態，降低發酵液粘度，提高菌株對氧的利用率，大幅提高脫落酸的產量。本發明提高菌株對氧的利用率，促進脫落酸的生物合成，與原始工藝相比發酵產量提高50.1% -162.5%，脫落酸發酵水平可達2.lg/L以上。本工藝所用發酵促進劑成本低，工藝簡單，便于工業應用。
【附圖說明】
[0018]圖1為本發明一個實施例中的效果對比圖，A圖為未加鉬酸鹽的菌絲生長情況，B圖為添加鉬酸鹽后的菌絲生長情況。可以看出加入鉬酸鹽后菌絲更分散，不易結團，從而改善了菌絲與培養基之間的氧氣及養分交換，促進了發酵產量的提高。
【具體實施方式】
[0019]實施例中所用灰葡萄孢霉菌As 3.4584，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，以下不再贅述。
[0020]實施例1
[0021]菌種活化用培養基為土豆葡萄糖瓊脂培養基(PDA):稱取新鮮土豆200g，洗