專利名稱：黃素結合型葡萄糖脫氫酶的制作方法
技術領域：
本發明涉及以黃素化合物為輔酶的新的黃素結合型葡萄糖脫氫酶及其制造法。
背景技術：
血中葡萄糖濃度(血糖值)是糖尿病的重要標記。作為用于糖尿病患者管理自己血糖值的裝置，正在廣泛利用使用了電化學生物傳感器的自我血糖監測(Self Monitoring of Blood Glucose =SMBG)儀器。SMBG儀器中所用的生物傳感器一直以來使用的是葡萄糖氧化酶(GOD)等以葡萄糖為底物的酶。然而，GOD具有以氧為電子受體的特性，因此使用了 GOD的SMBG儀器中，可能發生測定樣品中的溶解氧對測定值產生影響、無法獲得準確測定值的情況。另一方面作為以葡萄糖為底物但并非以氧為電子受體的其它酶，已知有各種葡萄糖脫氫酶(以下記為GDH)。具體而言，已發現以煙酰胺二核苷酸(NAD)、煙酰胺二核苷酸磷酸(NADP)為輔酶的類型的GDH (NAD⑵-GDH)、以吡咯喹啉醌(PQQ)為輔酶的 ⑶H(PQQ-GDH)，并已用于SMBG儀器的生物傳感器中。然而，NAD(P)-GDH存在缺乏酶穩定性且必須添加輔酶的問題，另外PQQ-GDH底物特異性低，除與作為測定對象的葡萄糖作用以外，還與麥芽糖、D-半乳糖和D-木糖等糖化合物作用，因此存在測定樣品中的葡萄糖以外的糖化合物影響測定值而無法獲得準確測定值的問題。近年來，報告了如下例子在使用以PQQ-GDH作為生物傳感器的SMBG儀器測定接受輸液給藥的糖尿病患者的血糖值時，PQQ-GDH還與輸液中所含的麥芽糖作用，獲得高于實際血糖值的測定值，基于該值進行處置，而導致患者發生低血糖癥等。另外，已經明確在正在實施半乳糖負荷試驗和木糖吸收試驗的患者中也可能發生上述情況(例如參照非專利文獻1)。基于該情況，日本厚生勞動省醫藥食品局為了調查當葡萄糖溶液中添加有各糖類時對血糖測定值的影響而進行了交差反應性試驗，結果在添加600mg/dL的麥芽糖、300mg/ dL的D-半乳糖、或200mg/dL的D-木糖的情況下，使用PQQ-GDH法的血糖測定試劑盒的測定值顯示出比實際葡萄糖濃度高約2. 5 3倍的值。S卩，已經明確待測試樣中可能存在的麥芽糖、D-半乳糖、D-木糖導致測定值變得不準確，迫切希望開發出一種不受這類會導致測定誤差的糖化合物的影響、能夠特異性測定葡萄糖的底物特異性高的GDH。在上述這樣的背景之下，已經著眼于利用上述以外輔酶的類型的⑶H。例如非專利文獻2 5中雖然沒有關于底物特異性的詳細記載，但存在對來源于米曲霉的GDH的報告。在專利文獻1 3中公開了以來源于曲霉屬的黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)為輔酶的葡萄糖脫氫酶(FAD-GDH)，專利文獻4中公開了使對D-木糖的作用性降低的來源于曲霉屬的 FAD-GDH。專利文獻1 4中雖已記載了對于D-葡萄糖外的1種或多種糖化合物的反應性低的FAD-GDH，但具有對麥芽糖、D-半乳糖、D-木糖中的任一者反應性都足夠低的特性的黃素結合型GDH尚且未知。另外，在存在D-葡萄糖、麥芽糖、D-半乳糖、D-木糖的條件下能夠不受上述糖化合物的影響而準確測定葡萄糖濃度的黃素結合型GDH也是未知的。
專利文獻1 日本特開號公報專利文獻2 國際公開第04/058958號小冊子專利文獻3 國際公開第07/139013小冊子專利文獻4 日本特開號公報非專利文獻1 醫薬品·醫療用具等安全性情報206號(Pharmaceuticals and Medical Devices Safety Information No. 206)、2004 年 10 月、日本厚生勞動省醫藥食品
局非專利文獻 2 :Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae.I.Induction of its synthesis by p-benzoquinone and hydroquinone, T. C. Bak, and R. Sato, Biochim. Biophys. Acta,139,265-276(1967).非專利文獻 3 :Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. II. Purification and physical and chemical properties, T. C. Bak, Biochim. Biophys. Acta,139，277-293(1967) ·非專利文獻 4 :Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae.III. General enzymatic properties, T.C.Bak, Biochim. Biophys. Acta,146, 317-327(1967).非專利文獻 5 :Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. IV. Histidyl residue as an active site, T. C. Bak, and R. Sato, Biochim. Biophys. Acta,146，328-335(1967).

發明內容
發明要解決的問題本發明的課題在于提供對D-葡萄糖特異性高、即使在D-葡萄糖以外的糖化合物共存的條件下也能準確測定D-葡萄糖量的新的GDH。用于解決問題的方案為了解決上述課題，本發明人等反復進行了深入研究，對生產能夠準確測定葡萄糖量的新的GDH的微生物實施篩選，結果從屬于毛霉亞門的菌株中發現一種新的GDH，該 GDH具有GDH活性，對葡萄糖特異性高，即使在葡萄糖以外的糖化合物共存的條件下進行測定時也能夠準確測定葡萄糖。并且，對上述的新的GDH進行純化并確定其各種性質，確認其為新的黃素結合型GDH，實際實施在麥芽糖、D-半乳糖、D-木糖存在下的D-葡萄糖的測定， 并獲得了該新的GDH的氨基酸序列和編碼其的基因序列信息，從而完成了本發明。即，本發明如下所述。(1)黃素結合型⑶H，其具有以下⑴ (iii)的性質(i)作用在電子受體存在下顯示⑶H活性；(ii)分子量蛋白質的多肽鏈部分的分子量為約SOkDa ；(iii)底物特異性與對D-葡萄糖的反應性相比，對麥芽糖、D-半乳糖和D-木糖的反應性低。(2)根據上述(1)所述的黃素結合型⑶H，在設對D-葡萄糖的反應性為100%時， 對麥芽糖、D-半乳糖和D-木糖的反應性均為2%以下。
(3)根據上述⑴或(2)所述的黃素結合型GDH，設不存在以下(a) (c)時對 D-葡萄糖的反應性為100%，在存在以下(a) (c)的糖化合物中的1種以上時對D-葡萄糖的反應性為96% 104%，(a)麥芽糖，(b) D-半乳糖，(c) D-木糖。(4)根據上述⑴ (3)中任意一項所述的黃素結合型⑶H，其最適pH為pH6. 5 7. 0，最適溫度為37 40°C，穩定pH范圍為pH3. 5 7. 0，在40°C熱處理15分鐘后具有 80%以上的殘存活性。(5)根據上述(1) (4)中任意一項所述的黃素結合型GDH，其來源于被分類為毛霉亞門、優選毛霉綱、更優選毛霉目、進一步優選毛霉科的微生物。(6)根據上述(5)所述的黃素結合型GDH，其來源于被分類為毛霉(Mucor)屬的微生物。(7)上述(1) (6)中任意一項所述的黃素結合型GDH的制造方法，其特征在于， 在培養基中培養被分類為毛霉(Mucor)屬的微生物，從該微生物菌體采集黃素結合型GDH。(8)根據上述(7)所述的黃素結合型GDH的制造方法，微生物為選自普雷恩毛霉 (Mucor prainii)、爪卩圭毛霉(Mucor javanicus)、卷枝毛霉原變型(Mucor circinelloides f. circinelloides)中的1種以上微生物。(9)根據上述(1) (6)中任意一項所述的黃素結合型GDH，其特征在于，其具有 序列號1或序列號3所示的氨基酸序列、或與該氨基酸序列80%以上同源的氨基酸序列、或在該氨基酸序列中缺失、置換或添加1個或多個氨基酸而成的氨基酸序列。(10)由選自以下的㈧ (E)組成的組中的任意一個DNA構成的黃素結合型⑶H 基因(A)編碼序列號1所示的氨基酸序列的DNA ；(B)由序列號2所示的堿基序列構成的DNA ；(C)編碼序列號3所示的氨基酸序列的DNA ；(D)由序列號4所示的堿基序列構成的DNA ；(E)具有與序列號2或序列號4所示的堿基序列80%以上同源的堿基序列且編碼具有黃素結合型GDH酶活性的蛋白質的DNA。(11)重組體DNA，其特征在于，其是在載體DNA中插入上述(10)所述的黃素結合型⑶H基因而成的。(12)導入有上述(11)所述的重組體DNA的轉化體。(13)與對D-葡萄糖的反應性相比，對麥芽糖、D-半乳糖、D-木糖的反應性低的黃素結合型GDH的制造方法，其特征在于，培養含有上述(10)所述的黃素結合型GDH基因或上述(11)所述的重組體DNA且具有生產黃素結合型⑶H能力的微生物，從該培養物采集黃素結合型⑶H。發明的效果根據本發明的黃素結合型GDH，能夠準確測定D-葡萄糖量，而不會受待測試樣所含的麥芽糖、D-半乳糖、D-木糖等糖化合物的影響。從而即使對于正接受含有麥芽糖的輸液給藥的患者、正在實施半乳糖負荷試驗和木糖吸收試驗的患者的試樣也能準確測定血糖值。


圖1是表示本發明的黃素結合型GDH的吸收光譜的圖。圖2是表示本發明的黃素結合型⑶H的最適pH的圖。圖3是表示本發明的黃素結合型⑶H的最適溫度的圖。圖4是表示本發明的黃素結合型GDH的熱穩定性的圖。圖5是表示本發明的黃素結合型GDH的pH穩定性的圖。圖6是本發明的黃素結合型⑶H的SDS-聚丙烯酰胺電泳結果。圖7是表示使用本發明的黃素結合型GDH測得的、D-葡萄糖量的測定結果的圖。
具體實施例方式(黃素結合型⑶H的底物特異性)本發明的黃素結合型GDH，其特征在于，底物特異性優異，對D-葡萄糖的選擇性極高。具體而言，本發明的黃素結合型GDH對麥芽糖、D-半乳糖、D-木糖的反應性極低。具體而言，特征在于，在設對D-葡萄糖的反應性為100%時，對麥芽糖、D-半乳糖和D-木糖的反應性均為2%以下。本發明的黃素結合型GDH由于具有如此高的底物特異性，因此即使對于正接受含有麥芽糖的輸液給藥的患者、正在實施半乳糖負荷試驗和木糖吸收試驗的患者的試樣，也能準確測定D-葡萄糖量，而不會受待測試樣所含的麥芽糖、D-半乳糖、D-木糖等糖化合物的影響。如上所述，本發明的黃素結合型GDH，其特征在于，在使用麥芽糖、D-半乳糖、D-木糖等糖化合物代替D-葡萄糖作為底物進行測定時的測定值非常低，進而即使在混雜有麥芽糖、D-半乳糖、D-木糖等糖化合物的條件下也能準確測定葡萄糖測定值。具體而言，其特征在于，將不存在上述混雜糖化合物的條件下對D-葡萄糖的反應性設為100%時，存在作為混雜糖化合物的選自麥芽糖、D-半乳糖、D-木糖中的1種以上時的測定值為96% 103%，即使作為混雜糖化合物的麥芽糖、D-半乳糖和D-木糖這3種同時存在時測定值也為96% 104%。在使用具有這種特性的黃素結合型GDH的情況下，即使是待測試樣中存在麥芽糖、D-半乳糖、D-木糖的情況下也能夠準確測定葡萄糖量，故而優選。(本發明的黃素結合型GDH的酶化學特征)作為本發明的黃素結合型GDH的優選的酶的例子可列舉出具有以下酶化學特征的酶。(1)作用在電子受體存在下顯示⑶H活性(2)分子量蛋白質的多肽鏈部分的分子量為約SOkDa(3)底物特異性與對D-葡萄糖的反應性相比，對麥芽糖、D-半乳糖、D-木糖的反應性低(4)最適 pH :pH6. 5 7. 0(5)最適溫度37 40°C(6)穩定 pH 范圍:pH3. 5 7. 0
(7)熱穩定性在40°C熱處理15分鐘后具有80%以上的殘存活性(8)以黃素化合物為輔酶(9) Km值對D-葡萄糖的Km值為26 33mM只要是具有上述這樣的酶化學特征的GDH，則能夠準確測定D-葡萄糖量，而不會受待測試樣所含的麥芽糖、D-半乳糖、D-木糖等糖化合物的影響。另外，由于能夠在用于血糖值的測定等臨床診斷的合適PH范圍、溫度范圍內良好作用，因此能夠適合用于診斷用測定試劑等用途。此外，上述各種性質參數為典型的例子，在規定的測定條件下進行D-葡萄糖的測定時，在能夠實現本發明效果的范圍內，上述參數中具有可允許的變動幅度。例如穩定PH 范圍、最適PH范圍、最適溫度范圍等參數在包含規定的測定條件的范圍內既可以比上述典型的范圍稍寬，相反也可以比上述典型的范圍稍窄，只要在測定條件下確保充分的活性和/ 或穩定性即可。通常Km值越小則底物特異性越好，但作為本發明的酶，只要在規定的測定條件下具有實質上能夠實現充分選擇底物的范圍的值即可。上述各種酶化學性質可通過使用用于鑒定酶的各種性質的公知手法、例如以下實施例所述的方法進行調查。酶的各種性質可在生產本發明的黃素結合型GDH的微生物的培養液、純化工序過程中的某個階段進行某種程度地調查，更詳細而言，可使用純化酶進行調查。純化酶是指被分離為實質不含該酶以外的成分、特別是該酶以外的蛋白質(混雜蛋白質)的狀態的酶。具體而言，例如以重量換算，混雜蛋白質的含量小于全體的約20%、 優選小于約10%、更優選小于約5%、進一步優選小于約1%。此外，本說明書中后述的 "Mp⑶H”、“Mj⑶H”和“Mc⑶H”只要未特別限定則指純化酶。本發明的黃素結合型GDH所利用的電子受體沒有特別限定，例如可使用作為適合用于血糖值測定的試劑成分而公知的任意電子受體。本發明的黃素結合型GDH所利用的輔酶的特征在于，其為黃素化合物。黃素化合物可列舉例如黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、黃素單核苷酸(FMN)等。作為本發明的黃素結合型GDH的優選的酶的例子，可列舉出用SDS-聚丙烯酰胺電泳測定時蛋白質的多肽鏈部分的分子量為約SOkDa的黃素結合型GDH。此外，考慮到本發明的黃素結合型GDH中結合有糖鏈，在未進行除去糖鏈的操作的情況下，具有用SDS-聚丙烯酰胺電泳測定時測得的分子量比該數值大的傾向。作為本發明的黃素結合型GDH的優選的酶的例子，可列舉出對D-葡萄糖的Km值為26 33mM的黃素結合型⑶H。(黃素結合型GDH的作用原理和活性測定法)本發明的黃素結合型GDH在電子受體存在下催化將葡萄糖的羥基氧化而生成葡糖酸-S -內酯的反應。因此，可利用該原理，通過使用例如吩嗪硫酸甲酯(PMS)和2，6- 二氯靛酚(DCIP) 作為電子受體的以下測定體系，測得本發明的黃素結合型GDH的活性。(反應1)D-葡萄糖+PMS (氧化型)— D-葡糖酸-δ -內酉旨+PMS (還原型)(反應2)PMS (還原型)+DCIP (氧化型)
— PMS+DCIP (還原型)首先，在(反應1)中隨著葡萄糖的氧化而生成PMS(還原型)。通過隨后進行的 (反應幻，在氧化PMS的同時，DCIP被還原，因此可由600nm的波長的吸光度變化量測定氧化型DCIP的消失。具體而言，在本發明中，黃素結合型GDH的活性可按照下述步驟進行測定。將 1. 79mL IOOmM 磷酸緩沖液(ρΗ7. 0)、0. 08mL 1. 25M D-葡萄糖溶液和 0. OlmL 20mM DCIP 溶液混合，于37°C保溫5分鐘。接著，添加0.02mL 20mM PM S溶液和0. ImL酶樣品溶液，開始反應。測定反應開始時的吸光度和經時性的吸光度，求出隨酶反應的進行600nm處吸光度的每分鐘減少量(ΔΑ600)，按照下式計算黃素結合型GDH活性。此時，黃素結合型GDH活性是將37°C下存在濃度50mM的D-葡萄糖時1分鐘內還原1 μ mol的DCIP的酶量定義為IU。[數學式1]
權利要求
1.黃素結合型葡萄糖脫氫酶，其具有以下(i) (iii)的性質(i)作用在電子受體存在下顯示葡萄糖脫氫酶活性；( )分子量蛋白質的多肽鏈部分的分子量為約SOkDa ；(iii)底物特異性與對D-葡萄糖的反應性相比，對麥芽糖、D-半乳糖和D-木糖的反應性低。
2.根據權利要求1所述的黃素結合型葡萄糖脫氫酶，在設對D-葡萄糖的反應性為 100%時，對麥芽糖、D-半乳糖和D-木糖的反應性均為2%以下。
3.根據權利要求1或2所述的黃素結合型葡萄糖脫氫酶，設不存在以下(a) (c)時對D-葡萄糖的反應性為100%，在存在以下(a) (c)的糖化合物中的1種以上時對D-葡萄糖的反應性為96% 104%，(a)麥芽糖，(b)D-半乳糖，(c)D-木糖。
4.根據權利要求1 3中任意一項所述的黃素結合型葡萄糖脫氫酶，其最適pH為 pH6. 5 7. 0，最適溫度為37 40°C，穩定pH范圍為pH3. 5 7. 0，在40°C熱處理15分鐘后具有80%以上的殘存活性。
5.根據權利要求1 4中任意一項所述的黃素結合型葡萄糖脫氫酶，其來源于被分類為毛霉亞門、優選毛霉綱、更優選毛霉目、進一步優選毛霉科的微生物。
6.根據權利要求5所述的黃素結合型葡萄糖脫氫酶，其來源于被分類為毛霉(Mucor) 屬的微生物。
7.權利要求1 6中任意一項所述的黃素結合型葡萄糖脫氫酶的制造方法，其特征在于，在培養基中培養被分類為毛霉(Mucor)屬的微生物，從該微生物菌體采集黃素結合型葡萄糖脫氫酶。
8.根據權利要求7所述的黃素結合型葡萄糖脫氫酶的制造方法，微生物為選自于普雷恩毛霉(Mucor prainii)、爪哇毛霉(Mucor javanicus)、卷枝毛霉原變型(Mucor circinelloides f. circinelloides)中的 1 種以上微生物。
9.根據權利要求1 6中任意一項所述的黃素結合型葡萄糖脫氫酶，其特征在于，其具有序列號1或序列號3所示的氨基酸序列、或與該氨基酸序列80%以上同源的氨基酸序列、或在該氨基酸序列中缺失、置換或添加1個或多個氨基酸而成的氨基酸序列。
10.由選自以下的㈧ (E)組成的組中的任意一個DNA構成的黃素結合型葡萄糖脫氫酶基因(A)編碼序列號1所示的氨基酸序列的DNA；(B)由序列號2所示的堿基序列構成的DNA;(C)編碼序列號3所示的氨基酸序列的DNA；(D)由序列號4所示的堿基序列構成的DNA;(E)具有與序列號2或序列號4所示的堿基序列80%以上同源的堿基序列且編碼具有黃素結合型葡萄糖脫氫酶酶活性的蛋白質的DNA。
11.重組體DNA，其特征在于，其是在載體DNA中插入權利要求10所述的黃素結合型葡萄糖脫氫酶基因而成的。
12.導入有權利要求11所述的重組體DNA的轉化體。
13.與對D-葡萄糖的反應性相比，對麥芽糖、D-半乳糖、D-木糖的反應性低的黃素結合型葡萄糖脫氫酶的制造方法，其特征在于，培養含有權利要求10所述的黃素結合型葡萄糖脫氫酶基因或權利要求11所述的重組體DNA且具有生產黃素結合型葡萄糖脫氫酶能力的微生物，從該培養物采集黃素結合型葡萄糖脫氫酶。
全文摘要
本發明提供一種對D-葡萄糖的底物特異性高的黃素結合型葡萄糖脫氫酶。一種屬于毛霉(Mucor)屬的微生物來源的、新的黃素結合型葡萄糖脫氫酶，特征在于，與對D-葡萄糖的反應性相比，對麥芽糖、D-半乳糖、D-木糖的反應性低，不易受上述糖化合物的影響。該酶不易受溶解氧的影響，即使在試樣中存在葡萄糖以外的糖化合物的情況下也能準確測定葡萄糖量。
文檔編號C12N15/09GK102292439SQ20108000494
公開日2011年12月21日 申請日期2010年4月19日 優先權日2009年6月4日
發明者一柳敦, 吉村太郎, 市川惠一, 田島遼子 申請人:龜甲萬株式會社