高耐受性β-葡萄糖苷酶及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種高耐受性0-葡萄糖巧酶及其應用，屬于發酵工程與生物技術領 域。
【背景技術】
[000引 0 -葡萄糖巧酶（0-Glucosidase，EC3. 2. 1. 21)，又稱0-D-葡萄糖巧水解酶，它 能夠水解結合于末端非還原性的0-D-葡萄糖巧鍵，同時釋放出0-D-葡萄糖和相應的配 基，該種酶存在于許多植物體，還存在于一些酵母、霉菌、木霉菌屬及細菌甚至是昆蟲體內。 0-葡萄糖巧酶可W將水果、蔬菜、茶葉中的風味前體物質0-糖巧水解為具有濃郁天然風 味的香氣物質。
[0003] 0-葡萄糖巧酶的可運用領域廣泛：可W用在果汁行業用于增香脫苦，很多果汁 中含有很多風味前體物質一一 0 -糖巧，只要通過一些酶的作用就能使該些糖巧配基揮發 釋放，起到增香的作用，在眾多的研究中發現，棘抱曲霉產的葡萄糖巧酶對蘋果汁、巧樣汁、 茶汁的增香效果良好；另外在果酒中的增香目前也是研究的熱點，對于脫苦的原理和增香 類似，例如在青梅汁中，葡萄糖巧酶可W將其中的苦杏仁巧分解為苯甲醒及氨氯酸和兩分 子的葡萄糖，該就使青梅的苦味大大減少；葡萄糖巧酶的脫苦還可W用在巧橘、橄攬等具有 一定苦味的水果中。
[0004] 另外，還可W用于一些糖巧類前體的分解來生產分解后產物，例如低聚龍膽糖的 生產、大豆異黃酬的生產，該兩種產物的前體都是W結合型的糖巧形式存在。除了W上該些 領域，0-葡萄糖巧酶的應用領域還很寬泛，比如制造生物酒精，通過基因技術來達到防治 病蟲害的目的，W及一些天然染料的生產，動物飼料的生產甚至是醫藥領域。
[0005] 目前，國內外對于0-葡萄糖巧酶的研究不少，但現有技術中產0-葡萄糖巧酶的 棘抱曲霉菌株胞外0-葡萄糖巧酶活性不高，所獲得的0-葡萄糖巧酶的耐受性不佳，如不 耐高溫、高酒精度、高鹽和高醋酸環境，導致其應用領域受限，本申請的發明人獲得一株具 有較高胞外0-葡萄糖巧酶活性的棘抱曲霉菌株，發酵獲得的0-葡萄糖巧酶能耐高溫、耐 高酒精度、耐高鹽和高醋酸環境，應用領域廣泛。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于提供一種由具有較高胞外0 -葡萄糖巧酶活性的棘抱曲霉菌 株發酵獲得的0-葡萄糖巧酶，該0-葡萄糖巧酶能耐高溫、耐高酒精度、耐高鹽和高醋酸 環境。
[0007] 本發明另一個目的是提供該棘抱曲霉菌株發酵產生的0-葡萄糖巧酶的若干應 用。
[0008] 本發明解決其技術問題所采用的技術方案是； 高耐受性0-葡萄糖巧酶，所述0-葡萄糖巧酶耐65-100°C高溫，耐質量濃度4~6%的 氯化鋼，耐質量分數3%的醋酸，耐體積分數11%W上的酒精，該0 -葡萄糖巧酶由保藏編號 為CGMCCNo. 7799、保藏名稱為曲霉Uwer知Wusw. )BG30的棘抱曲霉菌株發酵獲得，其 制備方法按如下步驟進行： (1) 將曲霉（知Wus5/7. )BG30接入斜面培養基進行增殖培養，用無菌生理鹽水 洗下斜面培養基上的抱子； (2) 將抱子液接入產酶培養基進行發酵培養，發酵液進行分離獲得0 -葡萄糖巧酶 粗酶液，所述粗酶液經過鹽析、透析、DEAE-陰離子交換柱層析、脫鹽和冷凍干燥純化獲得 0-葡萄糖巧酶。
[0009] 曲霉（AspergillusSP. )BG30,保藏單位；中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中屯、，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號CGMCCNo. 7799,保藏日 期2013年6月28日。
[0010] 曲霉Uwer知Wus )BG30的菌落形態特征；在麥芽汁瓊脂培養基上生長快， 25°C黑暗條件下培養7天，菌落直徑60-65mm，質地絨狀；產抱結構大量形成，分生抱子頭紫 褐色，初期球形，后期開裂，菌落背面淺褐色。分生抱子梗大，寬8. 5-11. 0ym，褐色，壁光滑， 頂囊球形，直徑33-42ym，全部表面可有；產抱結構單層，瓶梗6-10*ym，分生抱子楠圓形， 少數球形或近球形，淺到褐色，具明顯小刺，2. 9-4. 7*2. 5-4. 0ym，未見有性抱子。
[0011] 培養條件影響曲霉Uwer知)BG30的繁殖，進而影響其生產0 -葡萄糖 巧酶的能力，步驟（1)中增殖培養的條件為溫度28~30°C，培養時間96~120h;步驟（2)中發 酵培養的條件為溫度28~30°C，培養時間96~120h。
[001引 0 -葡萄糖巧酶作為胞外產物，發酵完成后，0 -葡萄糖巧酶存在于發酵液中，通 過常規的酶分離純化方法即可分離純化獲得高酶活的0-葡萄糖巧酶。
[0013] 培養基的種類也是影響棘抱曲霉菌株繁殖的重要條件，步驟（1)中斜面培養基的 組成為；葡萄糖5.Og，氯化鋼3.Og，硝酸鐘3.Og，磯酸氨二鐘0. 06g，硫酸銅0. 004g，款皮 10.Og，酒石酸鐘鋼0. 005g，氯化鐵0. 005g，硫酸鋪0. 005g，瓊脂20.Og，乳糖10.Og，蒸饋水 1000血，抑值5. 5~6. 0,所述斜面培養基配置好后于0. 08Mpa滅菌20min，劃線接入曲霉 BG30進行培養。
[0014] 步驟（2)中產酶培養基的組成W1L培養基計為；款皮34~36g，硫酸錠1. 8~2.Og， M拆〇4 ? 7&0 0. 4~0. 5g，蛋白腺 1. 2~1. 5g，FeS〇4 ? 7&0 0. 008~0.Olg，葡萄糖 2g，抑 5. 45~5. 55。
[0015] 本發明的高耐受性0-葡萄糖巧酶的應用，在催化葡萄糖和抗環血酸合成抗壞 血酸葡萄糖巧中的應用，催化葡萄糖和抗環血酸合成抗壞血酸葡萄糖巧的具體工藝為：每 lOOmLW水做溶劑的反應體系中加入3-6g抗環血酸、15-25g葡萄糖和Ig酶保護劑硫脈，再 按0. 01-0.lOU/mL的添加量加入酶，于55-65°C反應2-2.化。
[0016] 本發明的高耐受性0-葡萄糖巧酶的應用，在催化乳糖合成低聚0-半乳糖巧中 的應用，催化乳糖合成低聚0-半乳糖巧的具體工藝為：每lOOmLW水做溶劑的反應體系中 加入乳糖30-45g和酶穩定劑硫脈Ig，再按0. 01-0.lOU/mL的添加量加入酶，于28-70°C反 應5-10分鐘。
[0017] 本發明的高耐受性0-葡萄糖巧酶還可W用于楊梅酒、擲猴桃酒、半甜型擲猴桃 酒、干型擲猴桃酒、擲猴桃白蘭地酒的脫苦去澀，W及用于雜糧酒發酵增香、洋河大曲酒增 香、蓮子酒增香、茶葉增香；用于調料品增香或食品增香，W及用于化妝品或護膚品的增香。
[0018] 與現有技術相比，本發明的有益效果是；本發明的高耐受性e-葡萄糖巧酶耐 65-100°C高溫，耐質量濃度4-6%的氯化鋼，耐質量分數3%醋酸和體積分數11%W上的酒 精，具有較強的增香功能及轉糖巧酶活性，可W用作酶法合成烷基糖巧；還可W用于多種果 酒、白酒、調料品和食品的增香化及化妝品和護膚品的增香，應用范圍廣，增香效果突出。
【附圖說明】
[0019] 圖1;分離純化并脫鹽凍干后0-葡萄糖巧酶的SDS-PAGE電泳銀染結果； 圖2 ;不同抑對發酵液粗酶液的0-葡萄糖巧酶活性的影響； 圖3 ;不同抑對精酶液的0-葡萄糖巧酶活性的影響； 圖4 ;溫度對發酵液粗酶液的0-葡萄糖巧酶活性的影響； 圖5 ;溫度對精酶液的0-葡萄糖巧酶活性的影響； 圖6 ; 0 -葡萄糖巧酶對pNPG的酶動力學雙倒數圖； 圖7;酒精作用下0-葡萄糖巧酶對pNPG的酶動力學雙倒數圖； 圖8 ; 0 -葡萄糖巧酶催化合成抗壞血酸葡萄糖巧反應混合物薄層層析圖譜； 圖9;抗壞血酸葡萄糖巧合成過程還原糖濃度的變化； 圖10 ; 0 -葡萄糖巧酶催化乳糖合成低聚0 -半乳糖巧反應混合物的薄層層析圖譜； 圖11 ;19°白酒的判別函數分析圖（LDA); 圖12 ;38°白酒的判別函數分析圖（LDA); 圖13 ;56°白酒的判別函數分析圖（LDA)。
【具體實施方式】
[0020] 下面通過具體實施例，對本發明的技術方案作進一步的具體說明。
[0021] 1、菌株的分離純化 1. 1樣本采集：從小竹林排水溝、野生茶樹下、腐爛竹葉和枯桃樹木等下的±壤中采集 25個±壤樣品于無菌試管中。
[0022] 1. 2樣本處理 試劑準備；含抗生素的樣本處理液配置：氨節青霉素Ig，卡那霉素〇.55g，氯化鋼 8. 5g，吐溫Ig溶于適量水中；Ig氯霉素用4. 5ml己醇溶解；將己醇-氯霉素溶液混入第一 步所得溶液中，定容至1L得到處理液。
[0023] 篩選培養基；含甲基紅的察氏培養基（肖/1);〔1(：-化15.0，硝酸鋼3.0g，^;：水硫酸 儀0. 5肖，氯化鐘0. 5g，^;：水硫酸亞鐵0.01肖，磯酸氨二鐘1.0肖，甲基紅0. 2肖，瓊脂15g， 水 1.0L。
[0024] 樣品處理；在每支含±壤樣本的無菌試管中加入10血含抗生素的樣品處理液，并 于高速混勻機中混勻，靜置30min。
[002引接種；分別將混合后的處理液取50化于2血的離屯、管中（第一管)，并加入950化 生理鹽水(無抗生素）即稀釋20倍，從第一管中取50uL于第二管并計入950yL生理鹽水， W上步驟重復，最后取稀釋倍數為400,8000,1600